Name: Basofiel activatie test voor Onderzoek van IgE-gemedieerde mechanismen in Drug Overgevoeligheid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Leer de basofiel activatie test voor onderzoek naar IgE-gemedieerde mechanismen bij geneesmiddelovergevoeligheid met behulp van gekarakteriseerde drug-eiwitconjugaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Oostenrijkse Science Fonds (FWF) subsidie ​​P18820-B13. Ethiek statement: De studie werd goedgekeurd (PLUS_Ethik_090514) door de ethische commissie voor de experimenten met mensen en / of dieren aan de Universiteit van Salzburg te voldoen aan de Helsinki Declaraction als herzien in 1983 en alle patiënten die deelnamen gaven hun schriftelijke informed consent.

1. Voorbereiding van de drug conjugaten <ol><li> Los 10 mg DF in 1 ml dH 2 O in een 1,5 ml reactie buis. Bij de verdere procedure gebruik 95 ul van deze DF oplossing. Om conjugaat PP aan HSA te ontbinden 30,4 mg PP afgeleide (304 g / mol) in 500 pi 0,3 M natriumhydroxide (NaOH). </li><li> Voeg 430,6 ul dH 2 O en 100 ul 0,5 M 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES) buffer pH 6,5 tot 95 ul van de opgeloste DF. Voeg 33,1 ul dH 2 O en 140 ul van 2 M MES buffer pH 2,9 tot de PP monster. </li><li> Voeg 57,5 ul van een vers bereide N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) voorraadoplossing opgelost in dH 2 O met een concentratie van 100 mg / ml voor de DF monster, of 10 ul EDC oplossing voor de PP monster. Vortex de monsters gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg 16,9 ul van HSA oplossing met een concentratie van 118 mg / ml aan elk monster. </li><li> Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 300 ronden / min. </li><li> Dialyze de DF-en PP-monsters drie keer tegen de 2 liter van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 gedurende enkele uren per stuk. Voer alle stappen dialyseren bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster 10 minuten bij 14.000 xg en verzamel de bovenstaande vloeistof met DF of PP geconjugeerd aan HSA. </li><li> Controleer supernatant voor eiwitten door het uitvoeren van een SDS-PAGE, met behulp van 12% gels. Belasting ongeveer 12 ug van HSA conjugaat in een gel-sleuf. </li></ol> 2. Bepaal koppeling snelheid van drugs conjugaten (figuur 2) <ol><li> Voor de analyse van de koppeling snelheid van DF en PP-conjugaten door HPSEC gebruik maken van een 100 mM natriumfosfaat buffer, pH 6,5 met 150 mM NaCl en 0,05% natriumazide. Gebruik een 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 SWXL kolom. </li><li> Voer detectie van signalen met behulp van een online-gekoppelde RI-en UV-detector systeem. </li><li> Bereid een HSA standaard monster met een concentratie van 1 mg / ml in dH 2 O. Voor de detector kalibratie injecteren 50 ul HSA standaardoplossing. </li><li> Bereken de constante k RI RI en de UV-k UV voor de detector. Gebruik de formules gebied RI = k RI * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] en het gebied UV = UV-k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] met (dn / dc) HSA = 0.185 en (dA / dc) HSA = 0,518 5. </li><li> Bereid DF en PP afgeleide normen voor HPSEC die 5, 10 en 30 nmol hoeveelheden van beide normen kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd. </li><li> Bereken gemiddelde waarden voor (dn / dc) drugs-en (dA / dc) drug voor beide standaarden. Voor DF, een (dn / dc) van 0,235 ± 0,010 en een (dA / dc) van 39,000 ± 0,493 werd bepaald. Voor PP, een (dn / dc) van 0,328 ± 0,016 en een (dA / dc) van 53,155 ± 2,464 werd bepaald. </li><li> Injecteren geneesmiddel conjugaten op HPSEC en bepalen hun RI en UV piekoppervlakken. </li><li> Bereken de concentratie van DF, PP derivaat, en HSA door het oplossen van de twee vergelijkingen gebied RI = k RI * [(dn / dc) drug * c (drug) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] en het gebied UV = k UV * [(dA / dc) drug * c (drug) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] voor de onbekenden. </li></ol> 3. BBT met behulp van drugs conjugaten <ol><li> Bereid zeven flowcytometrie flacons en label ze afhankelijk van hun inhoud: onbesmet controle, negatieve controle, positieve controle, en drugs conjugaten. </li><li> Pipetteer 50 ul van de B-CCR-STB stimulatie buffer (flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) in de flesjes gereserveerd voor de ongekleurd en negatieve controle. Als een positieve controle, het gebruik 50 ui van een anti-FcεRI oplossing van de flow2 CAST kit. Voeg de juiste hoeveelheid conjugaat oplossing om de flesjes gereserveerd voor de drug conjugaten door het creëren van een 1:10 verdunning serie van 0,02 -20 ug / ml DF conjugaat en PP-conjugaat (eindconcentraties in een assay volume van 200 pi). Deze titratie-experimenten moeten worden uitgevoerd om de concentratie van optimale basofielen activatie voor elke patiënt monster te bepalen. </li><li> Voeg 100 ul buffer stimulatie aan elke buis en 50 ul patiënt EDTA volbloed. Meng de monsters. </li><li> Pipetteer 20 ul flow2 CAST vlekken reagens met anti-CCR3 antilichamen die zijn gemerkt met phycoerythrine (PE) en anti-CD63 antilichamen die zijn gemerkt met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) aan elke buis en meng opnieuw. Niet pipet vlekken reagens in de ongekleurd monster! </li><li> Incubeer de monsters gedurende 45 minuten in een 37 ° C waterbad. </li><li> Stop reactie op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Lyse erytrocyten door het toevoegen van 2,0 ml flow2 CAST lyserend reagens aan elke flacon en vortex voorzichtig. Incubeer monsters in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifuge monsters voor 5 minuten bij 500 xg en decanteer zorgvuldig supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 500 pi flow2 CAST wasbuffer en op te slaan op het ijs tot flowcytometrie. </li><li> Stel de flowcytometer het voltage snstellingen voor vooruit en zijwaartse verstrooiing (FSC, SSC), terwijl het verwerven van de ongekleurd monster. </li><li> De poort van de cellen voorspeld als lymfocyten uit het SSC-FSC-complot om de SSC-PE-plot. Basofielen zijn te herkennen aan een PE-gelabeld anti-antilichaam CCR3 als CCR3 hi SSC lo en gate ze in de FITC-PE plot. De anti-CD63 antilichaam detectie geactiveerd basofielen is gelabeld met FITC. </li><li> Stel de cut-off tot maximaal 2,5% van de basofielen als CD63 hi in de negatieve controle. Een monster wordt als positief voor basofielen activatie indien&gt; 5% basofielen zijn CD63 hi en de gemiddelde fluorescentie-index (MFI) van het monster gedeeld door de MFI van de negatieve controle groter is dan 2 (Figuur 3). </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Dit experiment evalueert BBT als een heilzaam middel om IgE-afhankelijke overgevoeligheid voor geneesmiddelen op te sporen. Eiwit conjugaten van NSAID's worden gebruikt voor de activering van basofielen. Door HPSEC met RI-en UV-detectie aggregatie toestand, koppeling graad, en de effectieve rendement van de conjugaten worden bepaald. Zoals figuur 4 laat zien, 43,5% van de DF conjugaten bleef monomeer met een koppeling mate van 5.0 DF / HSA. Voor de aggregaten een koppeling graad van 9,5 werd vastgesteld. De propyphenazone conjugaat bleek te bestaan ​​uit 68,5% monomeren met een koppeling graad van 21,2. De koppeling mate van de aggregaten was 27,9. In totaal heeft de vastgestelde koppeling mate van DF conjugaten was 7,6 DF en die van PP conjugaten was 23,2. BAT uitgevoerd met conjugaten onder optimale omstandigheden (concentratie van conjugaten, stimulatie tijd) mag het onderzoek van IgE-afhankelijke reacties in NSAID overgevoeligheid. Zoals weergegeven in figuur 5, alleen de PP conjugaat kon veroorzaken basofielen activatie gevisualiseerd door een opregulatie in CD63 oppervlakte expressie: 20,6% van de basofielen werden geactiveerd gekenmerkt door een log-verschuiving in de fluorescentie-intensiteit. De MFI verhoogd met een factor van 4,9 van de 386 (negatieve controle) naar 1893. In tegenstelling, het gebruik van de DF conjugaat slechts 3,1% van de basofielen werden geactiveerd die lager was dan de 5% cut-off. Ook de MFI nam slechts met een factor 1,1 (limiet 2,0) van 197 (negatieve controle) tot 210. Test validiteit wordt gegeven door (i) &lt;5% basofielen activatie in de negatieve controle, (ii) een log-verschuiving in de fluorescentie-intensiteit van een basofiele subpopulatie, en (iii)&gt; 50% geactiveerde basofielen (positieve controle). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Koppeling van DF en PP-afgeleide aan HSA. Na de ontbinding van de drugs, water, MES buffer, en EDC (koppeling reagens) worden toegevoegd. De monsters zijn gevortexed gedurende 1 minuut voordat HSA is gepipetteerd om het geneesmiddel oplossingen. Binnen de 2 uur schudden bij kamertemperatuur de drugs covalent binden aan HSA. Monomeren en aggregaten kan veroorzaken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Berekening van de koppeling graden. Eerst worden de constanten k RI en k UV bepaald. Daarom wordt HSA standaard met een bekende concentratie geïnjecteerd in het HPSEC systeem. (Dn / dc) en (dA / dc) van HSA worden gegeven waarden van 0,185 en 0,518, respectievelijk 5. De piek gebieden zijn gebruikt voor het berekenen van de constanten. Ten tweede, voor elk geneesmiddel drie normen zijn geïnjecteerd met drug-en concentratie-specifieke RI en UV-gebieden te bepalen. Omdat de k RI en k UV-constanten zijn bekend uit de bovenstaande stappen, kan de drug-specifieke (dn / dc) en (dA / dc) derivaten worden berekend. Ten derde, drug-HSA conjugaten worden geïnjecteerd in HPSEC. De resulterende piekoppervlakken worden gebruikt om de concentraties van het geneesmiddel en HSA per piek te berekenen door het oplossen van de twee vergelijkingen met twee onbekende variabelen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Basofiele gating. Cellen voorspeld als lymfocyten zijn gated zijwaartse verstrooiing versus voorwaartse verstrooiing (SSC-FSC plot). De basofielen zijn geïdentificeerd als CCR3 hi SSC lo van de gated lymfocyten (SSC-CCR3-PE plot). Basofielen worden geanalyseerd voor de activering (CD63 hi) in de CD63-FITC-CCR3-PE plot. De negatieve controle wordt gebruikt om de cut-off van maximaal 2,5% basofielen resterende CD63 hi in te stellen. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vastberaden koppeling graden van drugs conjugaten. RI-en UV-signalen tonen twee pieken van aggregaten (eluerend bij lage retentie volume) en monomeren (elueren met een hoog retentie volume) van het geneesmiddel-HSA conjugaten. Percentages van monomeren en aggregaten (bepaald op basis van RI-signalen) en hun koppeling graden zijn afgebeeld (n = 1). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Basofiele activatiop de test. Resultaten van het geneesmiddel conjugaat-geactiveerde monsters, negatieve controles, en positieve controles worden getoond in CD63-FITC-CCR3-PE percelen (n = 1).

<ol><li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li>
<li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+questions+in+Allergy%3A+1--drug+allergy%2Fhypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils%2C+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li>
<li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diclofenac+hypersensitivity%3A+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li>
<li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+based+on+human+basophils%3A+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Allergol+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-assisted+allergy+diagnosis%3A+current+applications+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li>
<li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions%3A+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem+-+Anti-inflammatory+%26+Anti-Allergy+Agents%22%5BJournal%5D)">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li>
<li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

BAT is een gevestigde, hoewel nog niet routinematig gebruikte methode voor de diagnose van IgE-gemedieerde allergische aandoeningen 6,7. Voor drugs-overgevoeligheid, echter, is de toepasbaarheid gecompromitteerd zo laag moleculair gewicht verbindingen zijn niet in staat om verknopen IgE-receptoren, een voorwaarde voor basofielen activatie 8. Daarom drugs in onderzoek moeten covalent worden gekoppeld aan geschikte drager eiwitten (bijv. HSA). Belangrijk is dat de koppeling graad (dwz het aantal geneesmiddelmoleculen per drager-eiwit) moet worden gecontroleerd om immunologische activiteit te garanderen (dat wil zeggen IgE-receptor cross-linking) van conjugaten. Theoretisch moeten twee haptenen per dragermolecuul voldoende zijn voor de IgE-receptor cross-linking en zo weinig als vijf DF moleculen per HSA is aangetoond dat ze mediator vrij trekker in een cel-gebaseerde test 4. Beide conjugaten, PP-HSA en DF-HSA, zijn vastbesloten om een ​​voldoende hoge graad koppeling (HPSEC) weer te geven en om immunologisch actieve waardoor ze geschikte reagentia voor gebruik in de BBT. Een ander probleem kan zijn dat drug metabolieten een rol kan spelen, als een metaboliet in plaats van de ouder geneesmiddel kan de overgevoeligheidsreactie veroorzaken. In het geval van DF, is deze mogelijkheid is geëvalueerd in detail voorheen met behulp van vijf belangrijke fase I-metabolieten en een koppeling variant 4. Belangrijke factoren voor het beheersen van de beschreven techniek onder meer de kwaliteit van het bloedmonster (&lt;12 uur sinds bloedafname, het aantal gedetecteerde basofielen&gt; 500) en optimalisatie van de stimulatie omstandigheden (tijd, dosis). Daarnaast, de zogenaamde non-responders die niet eens reageren met de positieve controle (antilichaam, gericht tegen de IgE receptor) moeten worden geïdentificeerd. Daarom validatie criteria moeten een anti-FcεRI antilichaam als positieve controle bevatten. Een belangrijk voordeel van het gebruik van drugs conjugaten is het feit dat ze lijken niet giftig, in tegenstelling tot pure drugs, zoals te zien voor DF-HSA conjugaat door co-stimulatie met anti-FcεRI antilichaam in BAT 4. Zuivere DF, in tegenstelling, displays cytotoxische effecten bij een concentratie van 1,25 mg / ml veroorzaakt problemen met de interpreteerbaarheid van BBT 9. Over het algemeen is het testen op potentiële cytotoxiciteit sterk aanbevolen voor iedere nieuw geproduceerde drug conjugaat. Hier hebben we aangetoond dat het potentieel van de PP-HSA-conjugaat die gebruikt in de BAT om IgE-gemedieerde overgevoeligheid onthullen. In tegenstelling, is DF overgevoeligheid niet geassocieerd met IgE aangetoond door het ontbreken van basophil activering in reactie op de DF-HSA conjugaat. Belangrijk is dat in geval van onzekerheid over een IgE-gemedieerde mechanisme conjugaten moeten worden geëvalueerd voor immunologische activiteit door in vitro cel-gebaseerde test systemen zoals is aangetoond voor DF 4. Met behulp van de beschreven opzet van het vervoegen van laag moleculair gewicht drugs covalent aan geschikte eiwit dragermoleculen een aantal overgevoeligheidsreacties tegen geneesmiddelen, waaronder antibiotica, andere NSAID&#39;s, radiocontrast media, spierverslappers, anesthetica, kan enz. worden onderzocht voor een betrokkenheid van een IgE-gemedieerde mechanisme. Daarom kunnen de BBT dienen als een aanvulling op de bestaande methoden voor de diagnose (huidtest, mondelinge provocatie testen).

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparaat </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column </td><td> Tosoh Bioscience </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Tafelmodel centrifuge </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Diclofenac natriumzout </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 CAST Kit </td><td> Bühlmann Laboratories </td><td> FK-CCR </td><td> Effectieve 14 juni 2011 flow2 CAST kit is nu Flow CAST </td></tr><tr><td> HP1100 HPLC-systeem </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Humaan serum albumine </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Laboratorium centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-Ethyl-N&#39;-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS tabletten </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazone afgeleide </td><td> Afdeling Moleculaire Biologie, Universiteit van Salzburg, Oostenrijk </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumwaterstofcarbonaat </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumhydroxide </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Natriumfosfaat </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Triple detector-array </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> Persoonlijke BioVortex V-1 plus </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Waterbad 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basofiel activatie test voor onderzoek van ige-gemedieerde mechanismen in drug overgevoeligheid

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Overgevoeligheidsreacties tegen niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID&#39;s) zoals propyphenazone (PP) en diclofenac (DF) kan zich manifesteren als Type I-achtige allergische reacties: 1. In de klinische praktijk, is de diagnose van overgevoeligheid voor geneesmiddelen voornamelijk uitgevoerd door de patiënt, als de huid test is niet betrouwbaar en mondelinge provocatie testen draagt ​​levensbedreigende risico&#39;s voor de patiënt 2. Vandaar dat bewijs voor een onderliggende IgE-gemedieerde pathomechanisme is moeilijk te verkrijgen. Hier presenteren we een in-vitro-methode, gebaseerd op het gebruik van menselijke basofielen afgeleid van geneesmiddel-overgevoelige patiënten die de allergische reactie effector in vivo nabootst. Als basofielen van drug-allergische patiënten altijd IgE-moleculen die specifiek zijn voor de dader drug, worden ze geactiveerd bij IgE-receptor verknoping en laat allergische effector-moleculen. De activering van basofielen kan gevolgd worden door de bepaling van de opregulatie van CD63 oppervlakte expressie met behulp van flowcytometrie 3. In het geval van een laag moleculair gewicht drugs, zijn conjugaten ontworpen om IgE-receptor verknoping mogelijk op basofielen. Zoals weergegeven in figuur 1, twee vertegenwoordigers van NSAID&#39;s, PP en DF, zijn covalent gebonden aan humaan serumalbumine (HSA) via een carboxylgroep reageren met de primaire aminogroep van lysine residuen. DF draagt ​​een intrinsieke carboxylgroep en dus direct 4 worden gebruikt, terwijl een carboxylgroep bevattende afgeleide van PP moest organochemically worden gesynthetiseerd voorafgaand aan de studie 1. De koppeling mate van de laagmoleculaire verbindingen op het eiwit dragermolecuul en hun ruimtelijke verdeling is belangrijk te garanderen verknoping van twee IgE receptor moleculen. De hier beschreven protocol is van toepassing high performance-size exclusion chromatografie (HPSEC) uitgerust met een sequentiële brekingsindex (RI) en ultraviolet (UV) detectie systeem voor de bepaling van de koppeling graad. Zoals de beschreven methodiek kan worden toegepast voor andere geneesmiddelen, de basofielen activatie test (BBT) draagt ​​de potentie om gebruikt te worden voor de bepaling van IgE-gemedieerde mechanismen in drug overgevoeligheid. Hier bepalen we PP overgevoeligheid als IgE-gemedieerde en DF overgevoeligheid als niet-IgE-gemedieerd door BAT.

Basofielen activatie test is een krachtig instrument voor de detectie van IgE-afhankelijke allergie<em&gt; In vitro</em&gt;. Hier is een geoptimaliseerd protocol voor basofielen activatie test gebruikt om drugs overgevoeligheid te onderzoeken. Een methode voor de efficiënte productie van covalente drug-eiwit conjugaten en hun fysisch-chemische karakterisering is beschreven.

Basofiel activatie test voor Onderzoek van IgE-gemedieerde mechanismen in Drug Overgevoeligheid

Overgevoeligheidsreacties tegen nietsteroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) zoals propypfenazon (PP) en diclofenac (DF) kunnen zich manifesteren als type I-achtige...

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van IgE-gemedieerde geneesmiddelhypersensitiviteit via de basofielactivatietest met behulp van goed gekarakteriseerde HAP-geïnitieerde drug-carrier proteïneconjugaten. Dit wordt bereikt door eerst een geneesmiddel chemisch te koppelen aan lysine-residuen van humaan serumalbumine via een intrinsieke of organisch-chemisch geïntroduceerde carboxylgroep. Vervolgens worden de conjugaten fysisch-chemisch gekarakteriseerd om de exacte koppelingsgraad te bepalen door middel van high performance size exclusion chromatography of H-P-S-E-C, met sequentiële refractie-index- en ultravioletdetectie.Vervolgens worden de goed gekarakteriseerde geneesmiddelconjugaten gebruikt om basofielen van donoren met geneesmiddelhypersensitiviteit te stimuleren. Uiteindelijk kan de basofielactivatietest of BAT worden gebruikt om IgE-gemedieerde mechanismen bij geneesmiddelhypersensitiviteit te evalueren. Mijn naam is Michael Steiner van de Allergy Research Group aan de Universiteit van Salzburg in Oostenrijk.Vandaag willen we u een techniek introduceren waarmee de betrokkenheid van medicijn-specifieke IgE-antilichamen bij geneesmiddelhypersensitiviteitsreacties kan worden gemeten. Hier tonen we de procedure met twee veelgebruikte vertegenwoordigers van nietsteroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, namelijk propofol en diclofenac. De methode heeft echter het potentieel om te worden gebruikt voor de routinediagnose van medicijnallergieën van het onmiddellijke type.Voeg over het algemeen 10 µL van een vers bereide N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride- of EDC-stockoplossing toe aan het propafenon- of PP-monster. Vortex het monster gedurende één minuut. Voeg vervolgens 16,9 µL menselijk serumalbumine- of HSA-oplossing met een concentratie van 118 mg/mL toe aan het monster en incubeer het monster vervolgens gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 300 rpm.Nadat het schudden is voltooid, worden de monsters drie keer gedialyseerd tegen twee liter PBS gedurende enkele uren per keer bij 4 °C. Centrifugeer de monsters vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur bij 14 000 ×g en verzamel het S-supernatans dat de aan HSA geconjugeerde NSAID's bevat. Controleer het supernatant op eiwitten door middel van een SDS-PAGE met 12% gels.Laad ongeveer 12 µg HSA-conjugaat in één gelslot voor de analyse van de koppelingssnelheid van de NSAID-conjugaten via high performance size exclusion chromatography of H-P-S-E-C. Verdun eerst de HSA-standaardmonsters tot een concentratie van 1 mg/mL in gedemineraliseerd water. Injecteer voor de kalibratie van de detector 50 µL van de HSA-standaardoplossing.Gebruik vervolgens een TSK gel, G 2000 SSW XL kolom van 7,8 bij 300 millimeter en een online gekoppeld refractie-index (RI) en UV-detectorsysteem. Bereken de RI-constante $\text{C}_{\text{RI}}$ en de UV-constante $\text{K}_{\text{UV}}$ voor de detector. Gebruik deze twee formules om PP-derivaatstandaarden voor HPSEC in gedemineraliseerd water te verdunnen in hoeveelheden van 5, 10 en 30 voor een eenvoudige injectie, en bereken vervolgens de gemiddelde waarden voor $\text{dN}/\text{dC}$ van het geneesmiddel en $\text{dA}/\text{dC}$ van het geneesmiddel voor beide standaarden.Inject nu met behulp van deze twee formules de geneesmiddelconjugaten op de H-P-S-E-C en bepaal hun RI- en UV-piekoppervlakken. Bereken vervolgens met dezelfde twee vergelijkingen de concentratie van de PP-derivaten en het HSA voor de onbekenden. Label eerst zeven flowcytometrie-buisjes op basis van hun inhoud: ongesteinde controle, negatieve controle, positieve controle en geneesmiddelconjugaten.Pipette vervolgens 50 µL basofielstimulatiebuffer in de vials die zijn gereserveerd voor de ongesteinde en negatieve controle. Voeg 50 µL van de anti FC epsilon R one-oplossing uit de flow two cast-kit toe aan de vial voor de positieve controle. Voeg nu 0,02 tot 20 µg/mL van het PP-conjugaat toe aan de vials voor het geneesmiddelconjugaat in een verdunningsreeks van 1:10, en voeg vervolgens 100 µL stimulatiebuffer en 50 µL EDTA-volbloed van de patiënt toe aan elke buis.Meng de monsters zorgvuldig. Pipetteer vervolgens 20 µL van de flow-kleuringsreagens met PE-gelabelde anti-CCR3-antilichamen en ZI-gelabelde anti-CD63-antilichamen in elk van de buizen met drug-conjugaat, de positieve controle en de negatieve controle en meng deze.Incubeer de monsters opnieuw gedurende 45 minuten in een waterbad van 37 °C. Plaats de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op ijs om de reactie te stoppen. Lyseer daarna de erytrocyten door twee milliliter Flow-2 cast lyserende reagens aan elk buisje toe te voegen.Incubeer de monsters 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Pelleteer de monsters vervolgens vijf minuten bij 500 ×g bij kamertemperatuur. Decanteer voorzichtig het supernatant, resuspendeer de cellen in 500 µL flow cytometry wash buffer en bewaar de monsters op ijs tot aan de flowcytometrie.Gebruik het ongekleurde monster om de voltagesinstellingen van de flowcytometer aan te passen. Gate vervolgens de cellen die zijn voorspeld als lymfocyten binnen het side scatter forward scatter-diagram. Vergelijkbaar met deze monsterfiguur worden basofielen eerst geïdentificeerd als CCR3-hoog en side scatter-laag.Vergelijkbaar met deze spreidingsplot. Na het gaten zetten van de cellen in de fit EPE-plot kunnen geactiveerde basofielen verder worden geïdentificeerd door hun expressie van FIT E-gelabelde CD 63-positiviteit. Na het instellen van de afkapwaarde op maximaal 2,5% basofielen als CD 63-hoog in de negatieve controle, kan een monster als positief voor basofielactivatie worden beschouwd als meer dan 5% basofielen CD 63-hoog zijn en de MFI van het monster gedeeld door de MFI van de negatieve controle groter is dan twee.Deze methode evalueert de bat als een nuttig instrument voor het detecteren van IgE-afhankelijke drug-hypersensitiviteitseiwitten. Conjugaten van NSAID's worden gebruikt voor de activering van basofielen door H-P-S-E-C met RI- en UV-detectie van aggregatie. De koppelingsgraad en het effectieve rendement van de conjugaten worden bepaald zoals weergegeven in deze figuur.43,5% van de DF-conjugaten bleven monomeer, met een koppelingsgraad van 5,0 DF aan HSA voor de aggregaten. Er werd een koppelingsgraad van 9,5 bepaald, zoals hier afgebeeld. Er werd aangetoond dat het PPP-conjugaat bestond uit 68,5% monomeren met een koppelingsgraad van 21,2.De koppelingsgraad van de aggregaten was 27,9. In totaal was de bepaalde koppelingsgraad van DF-conjugaten 7,6 df en die van PPP-conjugaten 23,2. BAT uitgevoerd met conjugaten onder geoptimaliseerde omstandigheden maakt onderzoek naar IgE-afhankelijke reacties bij NSAID-hypersensitiviteit mogelijk.Zoals hier getoond, was alleen het PP-conjugaat in staat om basofielactivatie te triggeren, gevisualiseerd door een upregulatie in de oppervlakte-expressie van CD 63. 20,6% van de basofielen was geactiveerd, gekenmerkt door een toename in fluorescentie-intensiteit, waarbij de MFI met een factor 4,9 steeg van 386 voor de negatieve controle naar 1893.In tegenstelling hiermee was bij gebruik van het DF-conjugaat slechts 3,1% van de basofielen geactiveerd, wat onder de drempelwaarde van 5% lag. Bovendien nam de MFI slechts toe met een factor 1,1, van 197 voor de negatieve controle naar 210. De validiteit van de assay wordt aangetoond door een basofielenactivatie van minder dan 5% in de negatieve controle.Ten tweede, een logaritmische verschuiving in fluorescentie-intensiteit van een basofiele subpopulatie en ten derde meer dan 50% geactiveerde basofielen voor de positieve controle. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe basofielactivatietesten worden uitgevoerd en, belangrijker nog, hoe IgE-gemedieerde drugshypersensitiviteitsreacties kunnen worden onderscheiden van niet-IgE-gemedieerde reacties. Bovendien zou u inzicht moeten hebben in hoe de toepasbaarheid van de basofielactivatietest voor drugallergieën kan worden uitgebreid, voorbij het reeds gevestigde gebruik bij pollen-, voedsel- en insectallergieën.

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Experimentele muismodellen van allergische astma bieden nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de ziekte van pathogenese en het ontwikkelen van nieuwe therapeutica. Deze modellen zijn zeer geschikt voor het meten factoren die de allergische immuunrespons, ontsteking van de luchtwegen en longen pathofysiologie.

Muizenmodel van Allergen Induced Astma

In this video, we describe an in vitro method to evaluate the allergic potential of an antigen to induce basophil degranulation. β-hexosaminidase is used as an index of chemical mediator release, and the enzyme activity of β-hexosaminidase is measured using a fluorogenic substrate.

Humanized Mediator Enzyme Release Assay: An Immunochemical Method to Screen Allergic Potential of Test Antigen by Monitoring Basophil Degranulation Response In Vitro

In this video, we demonstrate the test to evaluate basophil activation in the presence of a test allergen using flow cytometry.

Analyzing Basophil Activation in the Presence of a Test Allergen using Flow Cytometry

This video demonstrates a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system. Serum IgEs interact with distinct allergens immobilized in the reaction zone of the cartridge, which are subsequently detected with peroxidase-conjugated anti-IgE antibodies and a chemiluminescent substrate, allowing simultaneous detection of multiple allergen-specific IgEs.

A Microfluidic Cartridge-Based Detection System for Allergen-Specific Immunoglobulin E

Allergische reacties, gekenmerkt door de activering van mestcellen en basofielen, worden door de verknoping van IgE en het vrijkomen van pro-inflammatoire mediatoren. Een kwantitatieve beoordeling van allergische reacties kunnen worden bereikt door Evans Blue kleurstof veranderingen in vasculaire permeabiliteit na provocatie met allergeen controleren.

Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

In vitro analyse van klasse-switch recombinatie bij muizen is uitdagend vanwege cytofiele IgE-moleculen die gebonden zijn aan Fc-receptoren op het oppervlak van B-cellen.  We beschrijven een methode voor IgE-detectie door middel van trypsine-gemedieerde splitsing van oppervlakte-gebonden IgE vóór fixatie en permeabilisatie voor cytoplasmatische fluorescentiekleuring.

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

Dit werk beschrijft een protocol dat gebruik maakt van een component-opgeloste aanpak om sensibilisatie te bestuderen bij grasspollenallergene in een cohort van patiënten uit zuidelijk China met allergische rhinitis en / of astma.

Een component-opgeloste diagnostische aanpak voor een studie over grap pollen allergenen in Chinese zuidelijke landen met allergische rhinitis en / of astma

Dit document stelt een protocol voor het opsporen van serum specifieke immunoglobuline met een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic en de evaluatie van het nut ervan in allergie diagnoses.

Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)

De basofiele activeringstest is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties op basis van de detectie van basofiele activering in aanwezigheid van een specifieke stimulus door de meting van activeringsmarkers door flowcytometrie.

Basofiele activeringstest voor allergiediagnose

Hier presenteren we de mediator release assay, met behulp van een rat basofiele leukemie cellijn getransfecteerd met de menselijke IgE receptor, om de degranulatie van effectorcellen te simuleren die typisch worden waargenomen bij type 1 allergische reacties. Deze methode onderzoekt de biologische activiteit van allergenen op een zeer gevoelige, reproduceerbare en aanpasbare manier.

Gestandaardiseerde Mediator Release Assay als een uitlezing voor allergeen potentie

Leer de basofiel activatie test voor onderzoek naar IgE-gemedieerde mechanismen bij geneesmiddelovergevoeligheid met behulp van gekarakteriseerde drug-eiwitconjugaten.

Basofiel activatie test voor Onderzoek van IgE-gemedieerde mechanismen in Drug Overgevoeligheid

Meer video's verkennen