Name: Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer de COX/SDH dubbel-labeling histochemie om mitochondriale respiratoire enzymdeficiënties te visualiseren in verse bevroren weefselsneden. Deze methode helpt bij het bestuderen van mitochondriale ziekten en verouderingsgerelateerde aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, Zweeds Research Council, de Zweedse Brain Power, en Zweeds Hersenstichting. Veel dank aan Mattias Karlen en dr. Giuseppe Coppotelli voor creatieve ondersteuning bij figuur 1 en 2, respectievelijk; Karin Pernold voor technische bijstand, en Drs. Barry J. Hoffer, Lars Olson, en Nils-Göran Larsson voor veel nuttige adviezen en discussie.

1. Weefsel voorbereiding voor cryosectioning <ol><li> Offer het dier door een van beide cervicale dislocatie of onthoofding, in overeenstemming met de beschikbare ethisch mogelijk te maken. </li><li> Snel verzamelen weefsels van belang (bv. Hersenen), en snel bevriezen op droog ijs (weefsels kan bevriezen in isopentaan of propaan gekoeld met vloeibare stikstof om een optimale morfologie verkrijgen vereisen). Bewaar weefsels in aluminiumfolie bij -80 ° C tot klaar sectie. </li><li> Insluiten bevroren weefsel als voorbereiding op cryosectioning. </li><li> Verzamel 14-um cryostaatcoupes bij -21 ° C (kan nodig zijn om temperatuur aan te passen ± 1-2 ° C). Dooi secties op dia&#39;s met behulp van verwarming blokkeren, en op te slaan zonder dia&#39;s afdekken bij -20 ° C tot klaar voor gebruik. </li></ol> 2. COX histochemie <ol><li> Laat dia&#39;s op kamertemperatuur drogen gedurende 1 uur. Zet dia&#39;s in een slide-kleuring kamer met natte filter papier, in reepjes gesneden. Voor het verkrijgen van consistent resultaten in elk experiment, is het raadzaam om een ​​maximum van tien dia&#39;s per experiment proces om vertragingen te minimaliseren. </li><li> Bereid onder een chemische motorkap 1x DAB, 100 uM cytochroom c in 0,1 M PBS pH = 7,0. Vortex snel. </li><li> Voeg 2 ug runderen catalase (2 pg ml -1 of ongeveer 4 IU ml -1). Meng goed door vortexen te breken alle korrels van catalase. </li><li> Van toepassing zijn 150 tot 200 ul van incubatiemedium aan elke dia, gebruik pipettip gelijkmatig op alle onderdelen te verspreiden. </li><li> Incubeer de glaasjes gedurende 40 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder overtollige oplossing van de dia&#39;s. Was de dia&#39;s 4 keer, 10 minuten per keer, in 0,1 M PBS pH = 7,0. </li><li> Keer terug dia naar dia-kleuring kamer met nat papier strips. </li></ol> 3. SDH histochemie <ol><li> Bereid onder een chemische motorkap 1,5 mM NBT, 130 mM natrium-succinaat, 0,2 mM PMS, en 1,0 mM natriumazide in 0,1 M PBS pH = 7,0. Neem voorzichtig om het schild tePMS tegen licht. Vortex snel. </li><li> Toe te passen 150-200 pi van incubatiemedium aan elke dia, gebruik pipettip gelijkmatig op alle onderdelen te verspreiden. </li><li> Incubeer de glaasjes gedurende 40 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder overtollige oplossing van de dia&#39;s. Was de dia&#39;s 4 keer, 10 minuten per keer, in 0,1 M PBS pH = 7,0. </li><li> Uitdrogen van de dia&#39;s voor 2 minuten in de volgende concentraties van ethanol: 70%, 70%, 95%, 95%, 99,5%. Laat vervolgens 10 minuten in een extra 99,5% stap. </li><li> Plaats de glaasjes in xyleen gedurende 10 minuten. Houder met Entellan en dekglaasje aan. Laat de dia&#39;s naar &#39;s nachts, of ten minste 1-2 uur drogen in een geventileerde ruimte. </li></ol> 4. Bepaling van de mitochondriale dysfunctie <ol><li> De hoogte van mitochondriale dysfunctie wordt aangegeven door de hoeveelheid van cellulaire blauwe vlekken. Naar semi-kwantificeren deze bedragen, moet dia&#39;s worden gecodeerd en gevisualiseerd onder bright-field microscopie. Semi-kwantificering moeten worden uitgevoerd op een blinde<html> basis met behulp van een schaal, bijvoorbeeld 0-4 (0, geen blauwe vlekken, 4, alleen blauwe vlekken). Het is het beste om dit soort van semi-kwantificering uit te voeren op verschillende secties van een bepaald onderwerp / dier aan een gemiddelde waarde voor elk vak / dier te berekenen. </li><li> Statistieken moeten worden uitgevoerd met behulp van een non-parametrische test, zoals Mann-Whitney of Kruskal-Wallis. </li></ol> 5. Juiste specificiteit controles <ol><li> Voor de specificiteit controles voor COX-activiteit, herhalen &quot;COX histochemie&quot; stappen, en voeg 2,5 mM natriumazide, een terminal ademhalingsketen-remmer. </li><li> Voor de specificiteit controles voor SDH-activiteit, herhalen &quot;SDH histochemie &#39;stappen met de verwijdering van natrium succinaat en de toevoeging van 50 mM malonaat, een competitieve remmer van SDH. </li><li> Wassen en drogen afdelingen in een ethanol-serie, en dan monteren en dekglaasje de dia&#39;s zoals beschreven in stappen 3,4 tot 3,6. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: tent &quot;&gt; De algemene regeling van de COX / SDH dubbel-labeling histochemische test wordt geïllustreerd in figuur 2. Representatieve voorbeelden van geschikte COX / SDH dubbele etikettering histochemie in de hersenen secties van wild-type en voortijdig verouderen mtDNA mutator muizen zijn weergegeven in figuur 3. De donkere bruine vlekken in wild-type muizen (Figuur 3, links paneel) toonde normale COX-activiteit. Cellen met ademhalingsketen deficiënties, aangegeven door de blauwe kleuring, werden geopenbaard in 12 weken oude mtDNA mutator muizen, en deze tekortkomingen werden meer verspreid als mtDNA mutator muizen de leeftijd tot 46 weken (Figuur 3, midden en rechter paneel). Voorbeelden van ongepaste COX / SDH dubbel-labeling in de hersenen secties van wild-type muizen als gevolg van onvoldoende COX etikettering zijn weergegeven in figuur 4. Onvoldoende incubatietijd voor de demonstratie van COX-activiteit, of het verminderen van de beschikbaarheid van moleculaire zuurstof door het afdekken van de slide tijdens de incubatie, resulteerde in een verminderde afzetting van de DAB reagerenion product, en dus toegestaan ​​voor de vorming van de blauwe formazan eindproduct tijdens de SDH-incubatie. COX-en SDH-activiteiten kunnen ook afzonderlijk worden onderzocht (Figuur 5, links en midden), maar de sequentiële etikettering is nuttig in het identificeren van cellen met COX tekortkomingen, te wijten aan de vorming van de blauwe neerslag tijdens de SDH-incubatie (Figuur 3, centrum en rechts). Specificiteit controles voor COX-en SDH-activiteiten kan ook worden gedaan (Figuur 5, rechts). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig1.jpg" /> Figuur 1. Mitochondriale luchtwegen Complexen IV. De mitochondriale ademhalingsketen is gelegen binnen de binnenste membraan en omvat vijf complexen. Het doel van de ademhalingsketen is om elektronen transport van Complex I tot en met IV en zo ontstaat er een proton gradient over het binnenste membraan wordt gebruikt door Complex V (ATPase) om ATP te produceren. Rood zeshoeken represent subeenheden gecodeerd door mtDNA. Witte zeshoeken vertegenwoordigen subeenheden gecodeerd door nucleair DNA (Merk op dat complexe II volledig is gecodeerd in het nucleaire genoom). Zo kan mutaties in het mitochondriaal genoom oorzaak disfunctioneren van de respiratoire keten als gevolg van mutaties in de subeenheden van de ademhalingsketen-complexen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig2.jpg" /> Figuur 2. Stroomschema van de COX / SDH dubbel-labeling histochemische assay. Ontleden de organen van belang, snel bevriezen van de weefsels op droog ijs, en bewaar ze bij - 80 ° C. Verzamel cryostaat secties en te houden bij - 20 ° C tot gebruik. Laat secties aan de lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bereid de incubatie medium voor COX histochemie, toepassen op de dia&#39;s, en gedurende 40 minuten bij 37 ° C. incubeer Was de secties in PBS 4 keer gedurende 10 minuten elke wasbeurt. Bereid de incubatie medium voor SDH histochemie, toepassen op de slides, en opnieuw incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ° C. Was weer de secties in PBS, gedehydreerd in een ethanol-serie, en dan monteren en dekglaasje de dia&#39;s. De COX / SDH dubbel-gelabeld secties zijn klaar om onder bright-field microscopie te bekijken binnen 1-2 uur. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve voorbeelden van COX / SDH double-labeling. Brain secties van wild-type en voortijdig verouderen mtDNA mutator muizen werden opeenvolgend gelabeld voor COX-en SDH-activiteiten. (Schaal bar:. 200 pm) Normaal COX-activiteit (aangegeven door een donker bruine kleur), werd aangetoond in de hippocampus van de wild-type muizen (links). COX tekortkomingen (aangegeven met blauw) werden geopenbaard in de hippocampus van mtDNA mutator muizen (midden en rechts). Er was een verdere daling van COX-activiteit door 46 weken oud in mtDNA mutator muizen, wat suggereert wijdverspreide verergering van de respiratoire keten dysfunctie. De waargenomen mitochondrial dysfunctie in mtDNA mutator muizen 12 wordt veroorzaakt door een hoge mate van mtDNA puntmutaties evenals verhoogde niveaus van lineaire verwijderingen 5. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig4.jpg" /> Figuur 4. Voorbeelden van ongepaste COX / SDH double-labeling. Brain secties van wild-type muizen werden opeenvolgend gelabeld voor COX-en SDH-activiteiten. (Schaal bar:. 200 pm) Onvoldoende incubatietijd (10 en 25 minuten) voor de demonstratie van de COX activiteit resulteerde in een verminderde afzetting van de bruine DAB reactie product, in vergelijking met de 40-minuten incubatietijd (links en midden). De verkorte incubatietijden toegestaan ​​voor de vorming van de blauwe formazan eindproduct tijdens de SDH incubatie, misleidende suggereert de aanwezigheid van cellen met COX tekortkomingen. Het afdekken van de dia&#39;s tijdens de COX incubatie resulteerde ook in onjuiste vorming en afzetting van de DAB reagerenion product (rechts). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig5.jpg" /> Figuur 5. Ik NDIVIDUELE COX-en SDH-etikettering en de specificiteit controle. Brain secties van wild-type muizen werden apart gelabeld voor COX-en SDH-activiteiten, wordt aangegeven door de donkerbruine kleur en de blauwe kleur, respectievelijk (links en midden). Hoewel de COX-en SDH-activiteiten kunnen individueel worden gemerkt, is de sequentiële etikettering bleek voordelig is in de plaatsbepaling van cellen met mitochondriale dysfunctie. Een voorbeeld van een specificiteit controle voor COX-en SDH-activiteiten in de hersenen van een wild-type muis gaf een afwezigheid van etikettering (rechts). (Schaal bar:. 200 pm)

<ol><li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mitochondrial+DNA+mutations+in+mammalian+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).</li>
<li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).</li>
<li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biologic+clock%3A+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Geriatr.+Soc%22%5BJournal%5D)">The biologic clock: the mitochondria.</a> J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genetics+-+a+paradigm+for+aging+and+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases.</a> Science. 256, 628-632 (1992).</li>
<li>Trifunovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+ageing+in+mice+expressing+defective+mitochondrial+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase.</a> Nature. 429, 417-423 (2004).</li>
<li>Ameur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+of+mouse+mitochondrial+DNA%3A+mutational+patterns+and+their+origins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins.</a> PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).</li>
<li>Safdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).</li>
<li>DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial myopathies.</a> Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).</li>
<li>Old, S. L., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+microphotometric+assay+of+succinate+dehydrogenase+and+cytochrome+c+oxidase+activities+for+use+on+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle.</a> Histochem. J. 21, 545-555 (1989).</li>
<li>Chaturvedi, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+PGC-1alpha+function+in+muscle+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).</li>
<li>Edgar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+point+mutations+with+major+effects+on+protein-coding+genes+are+the+driving+force+behind+premature+aging+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Metab%22%5BJournal%5D)">Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice.</a> Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).</li>
<li>Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+brain+lactate+is+a+hallmark+of+aging+and+caused+by+a+shift+in+the+lactate+dehydrogenase+A%2FB+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).</li>
<li>Crugnola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+in+muscle+from+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).</li>
<li>Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+pathology+in+cytochrome+c+oxidase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency.</a> Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).</li>
<li>DiMauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+encephalomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial encephalomyopathies.</a> Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).</li>
<li>Bonilla, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+morphological+approaches+to+the+study+of+mitochondrial+encephalomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Pathol%22%5BJournal%5D)">New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies.</a> Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).</li>
<li>Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+human+aging%3A+implications+for+the+central+nervous+system+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle.</a> Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).</li>
<li>Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+enzyme+activity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+implications+for+the+role+of+mitochondria+in+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death.</a> Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).</li>
<li>Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+rates+and+activities+of+respiratory+chain+complexes+correlate+linearly+with+heteroplasmy+of+deleted+mtDNA+without+threshold+and+independently+of+deletion+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).</li>
<li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+is+necessary+for+mtDNA+maintenance+and+embryogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice.</a> Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).</li>
<li>Ekstrand, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+parkinsonism+in+mice+with+respiratory-chain-deficient+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).</li>
<li>Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondroplet+ultrastructural+demonstration+of+cytochrome+oxidase+activity+with+a+polymerizing+osmiophilic+reagent%2C+diaminobenzidine+%28DAB%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB).</a> J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).</li>
<li>Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , Saunders. (1973).</li>
<li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+oxidase+deficient+cells+accumulate+in+the+hippocampus+and+choroid+plexus+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age.</a> Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).</li>
<li>Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+histochemical+determination+of+succinic+dehydrogenase+activity+in+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres.</a> Histochem. J. 20, 230-243 (1988).</li>
<li>Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+tRNA%28Leu%28UUR%29%29+mutation+in+mitochondrial+encephalomyopathy%2C+lactic+acidosis%2C+and+strokelike+episodes+%28MELAS%29%3A+genetic%2C+biochemical%2C+and+morphological+correlations+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle.</a> Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).</li>
<li>Petruzzella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high+levels+of+mutant+mtDNAs+co-localize+with+cytochrome+c+oxidase-negative+ragged-red+fibers+in+patients+harboring+a+point+mutation+at+nt+3243%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243.</a> Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).</li>
<li>Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+encephalomyopathies+in+childhood.+I.+Biochemical+and+morphologic+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations.</a> J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).</li>
<li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in-depth+evaluation+of+suspected+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease.</a> Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De gecombineerde COX / SDH histochemische methode kan de visualisatie van cellen met mitochondriale dysfunctie. Deze techniek, met vroege studies die teruggaat tot 1968, blijft populair, met vele overweegt het de &quot;gouden standaard&quot; voor het identificeren van mitochondriale ziekten bij patiënten 14,19,26,27. Het is nu vaak gebruikt om mtDNA mutatie-driven veroudering en veroudering-gerelateerde aandoeningen 12,13,18,20,21,24 te onderzoeken. De COX / SDH dubbel-labeling methode wordt vaak g...

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Dry Ice </td><td> AGA Gas AB </td><td> blokvorm </td><td></td></tr><tr><td> Isopentaan (2-methylbutaan) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 277258 CAS: 78-78-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cyrostat inbedding oplossing </td><td> Sakura Finetek </td><td> Tissue Tek 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Microm </td><td> Microm Model HM 500M </td><td></td></tr><tr><td> Dia&#39;s </td><td> Thermo Scientific </td><td> Super Frost Plus Menzel Glaser J1800AMWZ </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes Borosilicaatglas </td><td> VWR International </td><td> 16004-098 </td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> Filtreerpapier </td><td> Munktell Filter AB </td><td> Kwaliteit: 1350 ArtikelNummer: 242 001 </td><td> 430 x 430 mm </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Sigma Liquid Substrate System, D7304 </td><td></td></tr><tr><td> Cytochroom c (Type III, van paarden hart) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2506 CAS: 9007-43-6 </td><td></td></tr><tr><td> Runderen catalase (uit de lever) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9322 CAS: 9001-05-2 </td><td></td></tr><tr><td> Nitroblauw tetrazolium (NBT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N6876 CAS: 298-83-9 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium succinaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S2378 CAS: 6106-21-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fenazine methosulfaat (PMS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9625 CAS: 299-11-6 </td><td> PMS is licht gevoelig. Schild tegen licht. </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8032 CAS: 26628-22-8 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Xyleen </td><td> VWR International </td><td> EM-XX0060-4 </td><td></td></tr><tr><td> Entellan </td><td> VWR International </td><td> 100503-870 </td><td></td></tr><tr><td> Malonaat (Malonzuur) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1296 CAS: 141-82-2 </td><td></td></tr></table>

visualisatie van mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom c oxidase / succinaat dehydrogenase (cox / sdh) double-labeling histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondriaal DNA (mtDNA) defecten zijn een belangrijke oorzaak van de ziekte en kunnen ten grondslag liggen aan veroudering en veroudering gerelateerde veranderingen 1,2. De mitochondriale theorie van veroudering suggereert een rol voor mtDNA mutaties, die bio-energetica homeostase en cellulaire functie kan, veranderen in het verouderingsproces 3. Een schat aan bewijs is samengesteld ter ondersteuning van deze theorie 1,4, een voorbeeld hiervan is het mtDNA mutator muis 5, maar de precieze rol van mtDNA schade bij veroudering is het niet helemaal begrepen 6,7. Het observeren van de activiteit van de respiratoire enzymen is een rechttoe rechtaan aanpak voor het onderzoeken van mitochondriale dysfunctie. Complex IV, of cytochroom c oxidase (COX), is essentieel voor mitochondriale functie. De katalytische subeenheden van COX worden gecodeerd door mtDNA en zijn essentieel voor de montage van het complex (figuur 1). Zo zijn een goede synthese en functie grotendeels gebaseerd op mtDNA integriteit 2.Hoewel andere respiratoire complexen kon worden onderzocht, complexen IV en II zijn het meest vatbaar voor histochemische onderzoeken 8,9. Complex II, of succinaat dehydrogenase (SDH), wordt volledig gecodeerd door nucleair DNA (figuur 1), en de activiteit is meestal niet beïnvloed door een verminderde mtDNA, maar een verhoging zou kunnen mitochondriale biogenese 10-12 aan te geven. De verminderde mtDNA waargenomen in mitochondriale ziekten, veroudering, en leeftijd gerelateerde ziekten leidt vaak tot de aanwezigheid van cellen met een lage of afwezige activiteit van COX 2,12-14. Hoewel de COX-en SDH-activiteiten kunnen individueel worden onderzocht, heeft de sequentiële dubbele labeling methode 15,16 bleek gunstig zijn in de plaatsbepaling van cellen met mitochondriale dysfunctie 12,17-21. Veel van de optimale grondwetten van de test zijn bepaald, zoals de substraat concentratie, elektronen acceptoren / donateurs, tussentijdse elektronen dragers, invloed van pH, en de reactie time 9,22,23. 3,3 &#39;-diaminobenzidine (DAB) is een effectieve en betrouwbare elektron donor 22. In cellen met functioneren COX, zal de bruine indamine polymeer product te lokaliseren in het mitochondriaal cristae en verzadigen cellen 22. Die cellen met disfunctionele COX zal daarom niet worden verzadigd door de DAB-product, waardoor voor de visualisatie van de SDH-activiteit door vermindering van nitroblauw tetrazolium (NBT), een elektron acceptor, een blauwe formazanproduct eindproduct 9,24. Cytochroom c en natrium succinaat substraten worden toegevoegd aan endogene niveaus tussen controle en zieke / mutant weefsels 9 normaliseren. Catalase wordt toegevoegd als een voorzorgsmaatregel om mogelijke vervuilende reacties van peroxidase-activiteit 9,22 te vermijden. Fenazine methosulfaat (PMS), een tussentijdse elektron drager, wordt gebruikt in combinatie met natrium azide, een ademhalingsketen-remmer, tot de vorming van de uiteindelijke reactieproducten 9,25 te verhogen. Ondanks deze op de hoogteatie, enkele kritische details die het resultaat van deze betamelijk eenvoudige test, in aanvulling op specificiteit controles en de vooruitgang in de techniek, zijn nog niet gepresenteerd.

Het cytochroom c oxidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) double-labeling methode maakt het mogelijk voor de directe visualisatie van mitochondriale ademhaling enzymdeficiënties in vers ingevroren weefsel secties. Dit is een eenvoudige techniek histochemische en is nuttig bij het onderzoek naar mitochondriële ziekten, veroudering, en veroudering-gerelateerde aandoeningen.

Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry

Defecten in mitochondriaal DNA (mtDNA) vormen een belangrijke oorzaak van ziekten en kunnen ten grondslag liggen aan veroudering en verouderingsgerelateerde veranderingen 1,2. De mitochondriale theorie van ...

Het algemene doel van deze procedure is om directe visualisatie van tekorten in mitochondriale respiratoire enzymen in vers ingevroren weefselcoupes mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst cryostaatcoupes van het betreffende orgaan te verzamelen. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van de Cox histochemie, gevolgd door de SDH histochemie.Ten slotte worden de weefselsneden gedehydrateerd, gemonteerd en voorzien van een dekglas. Uiteindelijk kunnen de resultaten de mate van mitochondriale dysfunctie aantonen aan de hand van de hoeveelheid cellulaire blauwe kleuring. Hallo. Vandaag gaan we het hebben over de Cox SCH dubbele labelings-HISTOCHEMISCHE techniek.Hoewel deze methode kan worden toegepast om mitochondriële ziekten te bestuderen, kan ze ook inzicht bieden in veroudering en ouderdomsgerelateerde aandoeningen. Nadat de hersenen zijn verwijderd uit een dier dat in overeenstemming met de ethische vergunning is geofferd, moeten deze snel worden ingevroren op droogijs. Ingevroren weefsel kan, gewikkeld in aluminiumfolie, bij -80 °C worden bewaard tot het moment van sectie.Bereid het weefsel voor op cryosectie door de hersenen op een cryostaatblok te plaatsen en deze te omringen met insluitingsmedium. Plaats het blok snel in de cryostaat en verzamel coupes van 14 micron bij minus 21 graden Celsius. Ontdooi de coupes op objectglazen met behulp van een warmteblok en laat de objectglazen vervolgens één uur drogen bij kamertemperatuur.Plaats de coupes in een kleurkamer voor coupes met natte papierstrips. Omdat reactietijden essentieel zijn bij deze assay, wordt aanbevolen om maximaal 10 coupes per experiment onder een zuurkast te verwerken. Bereid het incubatiemedium voor, bestaande uit dab en cytochroom C in PBS, en meng dit met een vortex.Voeg snel twee microgram boviene CDE's toe aan het medium en meng goed door te vortexen. Om alle korrels CDE's op te lossen terwijl u nog steeds onder de zuinetkast werkt, brengt u 150 tot 200 microliter incubatiemedium aan op elke slide, waarbij u de pipetpunt gebruikt om het gelijkmatig over alle secties te verspreiden. Incubeer de slides gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius.Verwijder na 40 minuten het incubatiemedium van de objectglazen. Was de objectglazen vier keer in PBS, telkens gedurende 10 minuten. Plaats de objectglazen na het wassen, terwijl u onder een zuurkast werkt, terug in de kleurkamer voor objectglazen met natte papierstrips.Bereid de NBT-oplossing in PBS voor, waarbij u er zorg voor draagt dat het PMS tegen licht wordt afgeschermd. Vortex de oplossing kort en breng 150 tot 200 µL van de NBT-oplossing aan op elke slide, waarbij u de pipetpunt gebruikt om de vloeistof gelijkmatig over alle secties te verspreiden. Incubeer de slides 40 minuten bij 37 °C. Verwijder na 40 minuten de overtollige oplossing van de slides. Was de slides vier keer in PBS, telkens gedurende 10 minuten.Dehydrateer de coupes gedurende twee minuten per stap in de volgende opeenvolgende concentraties ethanol: 70%, 70%, 95%, 95% en 99,5%. Laat de coupes vervolgens nog 10 minuten rusten in een extra stap met 99,5%. Plaats de coupes gedurende 10 minuten in xyleen, monteer met LAN en breng dekglas aan.Laat de coupes hier een nacht of ten minste één tot twee uur drogen in een geventileerde ruimte. Brenducties van wild-type en vervroegd verouderende MT.DNA Mutator-muizen werden sequentieel gelabeld voor COX- en SDH-activiteiten.Normale Cox-activiteit, aangegeven door de donkerbruine kleuring, is zichtbaar in de hippocampus van wild-type muizen. Cox-deficiënties, aangegeven door de blauwe kleuring, werden aangetoond in de hippocampus van MT DNA mutator-muizen op 12 en 46 weken. Er was een verdere afname van de Cox-activiteit bij een leeftijd van 46 weken bij M-T-D-N-A mutator-muizen, wat wijst op een wijdverspreide verergering van de dysfunctie van de ademhalingsketen.Onvoldoende incubatietijden van 10 en 25 minuten resulteerden in een verminderde depositie van het bruine DAB-reactieproduct. De verkorte incubatietijden maakten de vorming van het blauwe Foran-eindproduct mogelijk tijdens de SDH-incubatie, wat misleidend wees op de aanwezigheid van cellen met COX-deficiënties. Het dekglas tijdens de COX-incubatie leidde eveneens tot een onjuiste vorming en depositie van het DAB-reactieproduct.Hoewel Cox- en SDH-activiteiten afzonderlijk kunnen worden gelabeld zoals hier wordt getoond, is gebleken dat sequentieel labelen voordelig is bij het lokaliseren van cellen met mitochondriële dysfunctie. Een voorbeeld van een specificiteitscontrole voor COX- en SDH-activiteiten in hersenen van een wild-type muis laat een negatieve labeling zien. Vergeet daarom niet dat het werken met de chemicaliën bij de Cox SCH dubbele labeling volgens het chemische protocol extreem gevaarlijk is; voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van passende laboratoriumkleding en een masker, het werken onder de zuurkast en het correct afvoeren van het incubatiemedium moeten telkens worden nageleefd wanneer u deze assay uitvoert.

visualization-mitochondrial-respiratory-function-using-cytochrome-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Confocale scanning microscopie wordt toegepast voor beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in doorbloed hart of skeletspieren in levende dieren. Real-time monitoring van enkele mitochondriale processen zoals superoxide flitsen en membraanpotentiaal schommelingen kan de evaluatie van de mitochondriale functie in een fysiologisch relevante context en tijdens pathologische verstoringen.

Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of In Vivo

We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.

Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.

High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Dit protocol beschrijft een vergelijkende test, met behulp van mitochondriale complexe activiteiten CI+CIII en CII+CIII in de aan- of afwezigheid van Na+, om het bestaan van gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools te bestuderen.

Interne mitochondriale membraangevoeligheid voor Na + onthult gedeeltelijk gesegmenteerde functionele CoQ-pools

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Leer de COX/SDH dubbel-labeling histochemie om mitochondriale respiratoire enzymdeficiënties te visualiseren in verse bevroren weefselsneden. Deze methode helpt bij het bestuderen van mitochondriale ziekten en verouderingsgerelateerde aandoeningen.

Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry (Video) | JoVE Journal

Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry

Meer video's verkennen