Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry
November 23rd, 2011
Het cytochroom c oxidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) double-labeling methode maakt het mogelijk voor de directe visualisatie van mitochondriale ademhaling enzymdeficiënties in vers ingevroren weefsel secties. Dit is een eenvoudige techniek histochemische en is nuttig bij het onderzoek naar mitochondriële ziekten, veroudering, en veroudering-gerelateerde aandoeningen.
Het algemene doel van deze procedure is om directe visualisatie van mitochondriale ademhalingsenzymdeficiënties in verse bevroren weefselsecties mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst cryostat-secties te verzamelen van het gewenste orgaan. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van de Cox Histo Chemie, gevolgd door de SDH Histochemie.
Ten slotte worden de weefselsecties gedehydrateerd, gemonteerd en bedekt met een dekglas. Uiteindelijk kunnen de resultaten de hoeveelheid mitochondriale disfunctie laten zien aan de hand van de hoeveelheid cellulaire blauwe kleuring. Hallo. Vandaag gaan we het hebben over de Cox SCH dubbele labeltechniek voor histochemie.
En hoewel deze methode kan worden toegepast om mitochondriale ziekten te bestuderen, kan het ook inzicht geven in veroudering en leeftijdsgerelateerde stoornissen. Nadat het brein van een dier is verwijderd dat is geofferd in overeenstemming met een ethisch permit, wordt het snel bevroren op droog ijs. Bevroren weefsel kan worden bewaard op min 80 graden Celsius, ingepakt in aluminiumfolie totdat het klaar is om te worden gesneden.
Bereid het weefsel voor op cryosectie door het brein op een cryostat-chuck te plaatsen en het te omringen met inbeddingsmiddel. Plaats de chuck snel in de cryostat en verzamel 14 micronsecties bij min 21 graden Celsius. Ontdooi de secties op dia's met behulp van een verwarmingsblok en laat de dia's vervolgens een uur drogen op kamertemperatuur.
Plaats de dia's in een dia-kleuringskamer met natte papierstrips. Omdat reactietijden belangrijk zijn in deze test, wordt aanbevolen om maximaal 10 dia's per experiment te verwerken onder een chemisch afzuigkap. Bereid incubatiemedium voor, dat dab en cytochroom C bevat in PBS en vortex.
Voeg snel twee microgram boviene CDEs toe aan het medium en meng goed door te vortexen. Om alle korrels van CDEs die nog steeds onder de kap werken te breken, breng 150 tot 200 microliter incubatiemedium aan op elke dia met behulp van de pipettepunt om gelijkmatig over alle secties te verspreiden. Incubeer de dia's gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius.
Verwijder na 40 minuten het incubatiemedium van de dia's. Was de dia's vier keer gedurende 10 minuten in PBS. Na het wassen van de dia's, brengt u ze terug in de dia-kleuringskamer met natte papierstrips onder een chemisch afzuigkap.
Bereid de NBT-oplossing in PBS voor, zorg ervoor dat het PMS tegen licht wordt afgeschermd, vortex de oplossing snel, breng 150 tot 200 microliter van de NBT-oplossing aan op elke dia met behulp van de pipettepunt om gelijkmatig over alle secties te verspreiden. Incubeer de dia's gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder na 40 minuten overtollig oplossing van de dia's. Was de dia's vier keer gedurende 10 minuten in PBS.
Dehydrateer de dia's gedurende twee minuten in de volgende sequentiële concentraties van ethanol. 70% 70% 95% 95% en 99,5% Laat ten slotte 10 minuten intrekken in een aanvullende 99,5%-stap. Plaats de dia's 10 minuten in xyleen, monteer met LAN en breng dekglazen aan.
Laat de dia's overnacht of minimaal een tot twee uur drogen in een geventileerde ruimte. Breinsecties van wild type en vroegrijp verouderende MT.DNA-mutatormuizen werden sequentieel gelabeld voor COX- en SDH-activiteiten.
Normale Cox-activiteit, aangegeven door de donkerbruine kleuring, is te zien in de hippocampus van wild-type muizen. Cox-deficiënties, aangegeven door de blauwe kleuring, werden onthuld in de hippocampus van MT DNA-mutatormuizen op 12 en 46 weken. Er was een verdere afname van de Cox-activiteit bij 46 weken van leeftijd bij M-T-D-N-A-mutatormuizen, wat duidt op een wijdverbreide verergering van de disfunctie van de ademhalingsketen.
Onvoldoende incubatietijden van 10 en 25 minuten resulteerden in verminderde afzetting van het bruine dab-reactieproduct. De verkorte incubatietijden zorgden voor de vorming van het blauwe Foran-eindproduct tijdens de SDH-incubatie, wat misleidend suggereerde dat er cellen met COX-deficiënties waren die werden afgedekt. Het bedekken van de dia's tijdens de COX-incubatie resulteerde ook in onnauwkeurige vorming en afzetting van het DAB-reactieproduct.
Hoewel Cox- en SDH-activiteiten individueel kunnen worden gelabeld zoals hier getoond, heeft de sequentiële labeltechniek zich bewezen als voordelig bij het lokaliseren van cellen met mitochondriale disfunctie. Een voorbeeld van een specificiteitscontrole voor COX- en SDH-activiteiten in de hersenen van een wilde muis toont negatieve labeltechniek. Vergeet dus niet dat het werken met de chemicaliën in de Cox SCH dubbele labeltechniek volgens het chemische protocol uiterst gevaarlijk is en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste laboratoriumkleding en een masker onder de chemische kap werken, en ook het weggooien van het incubatiemedium, elke keer dat u deze test uitvoert, moet worden gedaan.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De dubbele-labelingsmethode voor cytochroom c oxidase/natrium dehydrogenase (COX/SDH) maakt de visualisatie van mitochondriale ademhalingsenzymdeficiënties in vers-bevroren weefselsecties mogelijk. Deze histochemische techniek is vooral nuttig voor het onderzoeken van mitochondriale ziekten en verouderingsgerelateerde aandoeningen.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biochemie
- Mitochondriaal onderzoek
Achtergrond
- Mitochondriale disfunctie is gekoppeld aan verschillende ziekten.
- Begrip van enzymdeficiënties kan helpen bij het diagnosticeren van mitochondriale stoornissen.
- Histochemische technieken bieden directe visualisatie van enzymactiviteit.
- Vers-bevroren weefselsecties behouden de cellulaire architectuur.
Doel van het onderzoek
- Om mitochondriale ademhalingsenzymdeficiënties te visualiseren.
- Om de rol van mitochondriale disfunctie in ziekten te onderzoeken.
- Om een eenvoudige methode voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Verzameling van cryostaatsecties van het orgaan van belang.
- Uitvoering van COX-histochemische analyse.
- Uitvoering van SDH-histochemische analyse.
- Dehydratie, plaatsing en dekglasbevestiging van weefselsecties.
Belangrijkste resultaten
- De resultaten geven het niveau van mitochondriale disfunctie aan.
- Cellulaire blauwe kleuring correleert met enzymactiviteit.
- De methode maakt duidelijke visualisatie van enzymdeficiënties mogelijk.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van veroudering en daarmee gerelateerde aandoeningen.
Conclusies
- De COX/SDH dubbele-labelingsmethode is effectief voor het onderzoeken van mitochondriale disfunctie.
- Deze techniek kan helpen bij de diagnose van mitochondriale ziekten.
- Het biedt waardevolle inzichten in verouderingsgerelateerde mitochondriale veranderingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Mitochondrial respiratory function assessment is critical for target validation in neurodegenerative and age-related disease programs. The COX/SDH double-labeling histochemical method enables direct visualization of enzyme deficiencies, supporting mechanistic de-risking of mitochondrial targets. This approach provides predictive confidence in early discovery by linking mtDNA integrity to functional bioenergetics readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mtDNA-encoded COX activity to respiratory chain function.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct histochemical readout of enzyme activity in tissue sections.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue COX-deficient phenotypes in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline mitochondrial function.
- Operational Value: Delivers quantitative, spatially resolved enzyme activity data through DAB and NBT product localization.
- Platform Reuse: Enables scalable assessment of mitochondrial health across multiple organ systems using standardized histochemical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial dysfunction observed in aging and mtDNA mutator models.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via consistent enzyme activity readouts.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying respiratory chain dysfunction over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing functional mitochondrial readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing COX and SDH activity in defined brain regions.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, washing, and dehydration steps ensuring reproducible staining.
- Analytics: Enables comparative condition analysis via quantitative blue and brown staining correlating with SDH and COX activity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent exacerbation of respiratory chain dysfunction in mutator mice.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable histochemical platform for mitochondrial assessment across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mitochondrial disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of enzyme activity visualization across sections.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in mitochondrial programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on functional rescue of COX-deficient cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histochemistry and mitochondrial biology for accurate assay execution and interpretation.
- Depends on cryostat, incubation chambers, and chemical hoods for section preparation and reagent handling.
- Necessitates cross-team standardization of incubation times, reagent concentrations, and washing protocols to avoid artifacts.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-neural tissues such as heart or liver.
- Includes practical limitations such as hazardous reagent handling (DAB, NBT, PMS) and the need for fresh-frozen tissue preservation.
