Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van specifieke genetische mutaties op de vasculaire ontwikkeling en structuur te bepalen. Dit wordt bereikt door het embryo en de extra-embryonale weefsels samen te dissecteren om een geschikt monster voor injectie te verkrijgen. Vervolgens wordt de facialisader geïnjecteerd met een fluorescerende kleurstof om het intacte vaatstelsel te labelen.

Vervolgens wordt het embryo klaargemaakt voor analyse. Ten slotte worden hole mounts of coupes van de gelabelde vasculatuur afgebeeld om de driedimensionale structuur van de normale vasculatuur te tonen, op basis van immunofluorescentiemicroscopie van hole mounts of weefselcoupes. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik geïnteresseerd was in het bepalen van het ontwikkelingstijdstip waarop de perifere vasculatuur via angiogenese verbinding maakt met de thymus.

Om te beginnen, bereid FXI dextran of GS L one I selectin B four in PBS voor in een 1,5 milliliter eppendorfbuisje; voeg 100 microliters van de 1,25 millimolar fast green PBS-stock toe aan de FXI dextran, of 180 microliters aan de GS L one I selectin B four, zodat de oplossingen zichtbaar blauw zijn. Warm de buis vervolgens op tot 37 degrees Celsius.

Dissekeer E 14.5 tot E 18.5 embryo's samen met de dooierzakken, waarbij de Allen Toic-steel intact blijft. Breng de embryo's over naar een nieuwe Petrischaal en dompel ze onder in PBS bij kamertemperatuur. Positioneer vervolgens een embryo om een sagittaal aanzicht van het gezicht te verkrijgen.

Pak vervolgens het embryo voorzichtig bij de kop vast met microdissectiepincetten. Injecteer met een naald van 30 gauge 50 µL FXI dextran of GS L one I selectin B four in de vena facialis, waarbij de naald in de richting van de achterzijde van de kop wordt gericht. Wanneer de kleurstof zichtbaar is in de vena umbilicalis, wordt de naald verwijderd en wordt het embryo van de lan gescheiden.

Laat het embryo twee tot drie minuten in PBS bij kamertemperatuur rusten, zodat de kleurstof door het gehele embryo kan circuleren. Nadat de kleurstof door het embryo is gecirculeerd, worden huidmonsters genomen van regio's op de ledematen, de rug en de buik.

Was de huidmonsters in koude PBS en fixeer deze gedurende twee uur in 4% paraldehyde PBS. Was ze vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in transparante vials van vier milliliter met twee milliliter koude PBS. Plaats de huidmonsters op microscoopglaasjes en voeg aan elk glaasje 100 µL monteermedium en een dekglas toe.

Laat de preparaten in het donker drogen voordat de klaring in BABB en de daaropvolgende confocale beeldvorming kunnen worden uitgevoerd voor beelden van de huidvascularisatie met een hogere resolutie. Om weefsels voor cryosectie voor te bereiden, worden hele embryo's snel ingevroren in vloeibare stikstof. Breng OCT aan op een sectieblok en monteer het embryo.

Snijd bevroren weefsel in secties van 10 micron dik en verzamel deze op objectglazen. Fixeer de secties in aceton gedurende vijf tot 10 minuten, was ze vervolgens drie keer in koude TBS en blokkeer ze in 10% donkerserum in TBS in een vochtkamer. Voeg bij kamertemperatuur 100 microliters primair antilichaam toe aan elke sectie.

In dit voorbeeld gebruiken we rat anti-US CD 31 om het endotheel te labelen en geit anti-US P-D-G-F-R bèta om perivasculaire cellen te labelen, om er zeker van te zijn dat het antilichaam gelijkmatig over het coupespreidraatje is verspreid. Dek de objectglazen af met individueel gesneden stroken parafilm. Incubeer de objectglazen gedurende één uur tot overnacht in een bevochtigingskamer bij vier graden Celsius.

Was de coupes vervolgens drie keer in koude TBS. Incubeer deze met 100 µL van de passende secundaire antilichamen gedurende minimaal 30 minuten. Was tot slot drie keer in koude TBS. Voeg 100 µL monteermedium en een dekglas toe aan elk objectglas.

Laat de coupes in het donker drogen. Voor vibraam-sectionering worden de thymusloben uit de embryo's gedisseceerd en gespoeld in koud PBS. Fixeer het weefsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur in 4% paraldehyde PBS.

Nadat de monsters zijn gewassen in PBS Triton X, vult u een kleine plastic cartridge met 4% low melt agarose PBS. Dompel de monsters onder in de agarose PBS en zorg ervoor dat het weefsel in contact staat met de bodem van de cartridge. Laat de agarose stollen op ijs.

Gebruik vervolgens een scheermesje om het overtollige agar af te snijden. Breng lijm aan op het VIBRAM-blok en plak het monster op het blok. Giet koude PBS in het Vibram-waterbad totdat het monster en het mesje zijn ondergedompeld.

Stel de snelheid en amplitude in. De amplitude moet worden verlaagd. Als coupes uiteenvallen door overmatige agitatie, snijd dan 50 weefselcoupes.

Breng vervolgens met een pincet de coupes over naar koude PBS in een microplaat met 24 putjes en blokkeer de coupes in 500 µL 10% donkeyserum in PBS Triton X gedurende 30 minuten. Voeg daarna primaire antilichamen toe, zoals anti CD 31 en anti P-D-G-F-R beta, en incubeer gedurende acht uur tot overnacht in een afgedekte microplaat bij 4 °C. Was vervolgens drie keer met PBS Triton X over een totale periode van acht uur bij 4 °C.

Nadat de coupes opnieuw zijn geblokkeerd en zijn geïncubeerd in secundaire antilichamen, worden de monsters drie keer gewassen in PBS Triton X gedurende in totaal acht uur bij vier graden Celsius. Fixeer de monsters vervolgens opnieuw in 4%paraldehyde PBS gedurende 30 minuten op ijs en was nog drie keer in PBS Triton X gedurende 30 minuten op ijs. Dehydrateer de monsters via een methanol PBS Triton X-serie met oplopende concentraties gedurende 10 minuten per stap.

Vervang vervolgens de 100% methanol door verse methanol en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Plaats het monster op een glazen concave objectglas en bedek het monster met een een-op-een oplossing van BABB en methanol. Incubeer de monsters gedurende 10 tot 15 minuten.

Vervang vervolgens de oplossing door 100% BABB en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten of totdat het weefsel transparant is geworden. Plaats een dekglas en verzegel dit met twee tot drie lagen nagellak. Laat de nagellak uitharden in het donker bij kamertemperatuur.

Het monster kan worden bewaard bij vier graden Celsius, maar de beelden moeten binnen 12 tot 24 uur worden vastgelegd. Maak beelden van 10 micron dikke bevroren coupes met een confocale microscoop met gebruik van het plan A per chromat 20x 0,8 objectief met 633, 488 en 543 nanometer laserlijnen. Leg één micron dikke confocale Z-secties vast van 50 micron dikke in OCT ingebedde coupes met het plan A per chromat 10x 0,4 objectief met 488, 543 en 633 nanometer laserlijnen. Reconstrueer seriële Z-secties met Zeiss AIA vision 4.6 of andere software voor beeldanalyse. Een efficiënte labeling van de embryonale vasculatuur is cruciaal voor het beoordelen van bloedvatdefecten bij embryonale muizen. Deze figuren tonen specifieke labeling van bloedvaten in de thymus van E 16.5 en co-labeling van a GS L one I selectin.

B vier geïnjecteerde embryo's met CD 31 alsmede kleuring van de rechter- en linkerventrikels. Het GSL one I selectine B vier protocol voor cryosneden werd in deze experimenten gebruikt. Whole-mount labeling van het bloedvatnetwerk van de huid bij E 16.5 muizen wordt hier getoond na toepassing van deze procedure.

Andere methoden, zoals co-labeling van de stromale cellen en bloedcellen met de vasculatuur, kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: hoe interageren bloedcellen en stromale cellen met de vasculatuur in het muisembryo onder zowel normale als pathologische omstandigheden?