Name: Kweken en Elektrofysiologie van cellen op NRCC Patch-clamp Chips (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Leer elektrofysiologische opnames van gekweekte neuronen met behulp van planaire patch-clamp chips. Deze methode maakt giga-seal formatie mogelijk voor ionkanaalonderzoek en medium-doorvoer drugs screening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Alexei Bogdanov te erkennen voor de fabricage van patch-clamp chips op de CPFC, en Hue Tran, Ping Zhao en Matthew Shiu helpen bij de montage. Naweed Syed werd ondersteund door een Canadese Institute of Health Research (CIHR) subsidie. Collin Luk is de ontvanger van NSERC en Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) studiebeurzen.

1. Chip fabricage De werkwijze beschreven in 6 heeft een 3 pm dikke zichzelf staande film laag 1 MOhm toegang weerstand en een glad oppervlak trechtervormige opening die een innig afdichting met de cel 9 vergemakkelijkt, zie figuur 2. De chips worden singulated en gelijmd in plexiglas pakketten met de opening geconfronteerd met een gat het aansluiten van de chip naar een ondergrondse kanaal. De lijmen wordt afgegeven zodanig dat de shunt capaciteit minimaliseert een nominale 17 pF. Pakketten worden uitgerust met twee diameter van 1,5 mm en 6 mm glazen buizen vloeibare poorten (figuur 3). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Scanning electronen microscoop van een focused ion beam gedeelte van een NRCC patch-clamp chip toont een glad oppervlak en siliciumdioxide trechtervorm dat intieme cel contacten bevordert, en een ondiepe opening die goed is voor een lage instap resistance. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 3. Een chip gelijmd aan de onderzijde van de cultuur flacon in een plexiglas pakket voorzien ondergrondse vloeistofcomponenten en glazen buizen. 2. Sterilisatie, priming en testen De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een biologie veiligheidskabinet om besmetting of het aansluiten van de opening te voorkomen. <ul type="disc"><li> Steriliseren chips in een Harrick basis plasma reiniger (www.harrickplasma.com) met een 0.1-0.3 mbar resterende luchtdruk gedurende 15 min bij het maximale vermogen van 18 W. Andere luchtplasma kunnen worden gebruikt, met vergelijkbare vermogensdichtheid (24 mW / cm 3) te regelen en het product van vermogen dichtheid en tijdconstante. De plasmabehandeling maakt ook de chips hydrofiele Dit vergemakkelijkt priming. </li><li> Fit glazen buizen met een steriele Silastic Laboratorium silicone, 1mm ID x 2mm OD (Cole ParmerCat. # 96115-08), 3inch enerzijds 1 inch aan de andere zijde. </li><li> Vul vloeistofcomponenten door de buizen met steriel gefilterd standaard fosfaatbufferoplossing (PBS), zorg ervoor dat er geen luchtbel is opgesloten. </li><li> Knip de lange siliconenslang terwijl de druk in het PBS van de korte zijde op 1 atm. Een pool van PBS sijpelt door de opening kan zijn zichtbaar in de flacon. Klik de druk aanvoeren van de PBS en maak de korte siliconen tube van die levering. </li><li> Vul flacon met gefilterd PBS behulp van een injectiespuit. </li><li> Dompel een Ag / Ag: Cl-elektrode in de korte buis en een tegenelektrode in de flacon. Een impedantie meter wordt gebruikt om te bevestigen dat de toegang weerstand ligt tussen 300kohm en 3Mohm en de shunt capaciteit ligt tussen de 10pF en 25pF. Een chip met een lagere weerstand waarschijnlijk een lek, en een hogere capaciteit geldt als niet gebruikt aangezien het niet vangen de snelste dynamiek van elektrofysiologische de cel 6. Een chip met een lagere capaciteitof hoger weerstand als aangesloten, terwijl het eenvoudig kan zijn dat een luchtbel opgesloten in de opening. Sommige chips worden opnieuw getest na 1H en voldoet aan de juiste elektrochemische impedantie hebben. </li><li> Spoel de vloeibare kanaal met steriel gedeïoniseerd water, leeg de top flacon en spoel met hetzelfde, twee keer. </li><li> Dompel de verpakte chip met buizen in zoet steriel gedeïoniseerd water voor 30min laad vervolgens met andere chips in een steriele container gevuld met steriel gedeïoniseerd water. Dit zorgt ervoor dat chips blijven hydrofiele en beschermd tegen vervuiling. </li></ul> 3. Chips voorbereiding in de celbiologie lab De volgende stappen worden uitgevoerd in een HEPA-filter laminaire stroming kap met behulp van aseptische technieken, moeten alle oplossingen die gebruikt worden in deze procedure worden gefilterd gesteriliseerd met behulp van een 0.22μm filter. <ul type="disc"><li> Open een chip bak onder een HEPA-gefilterde laminaire stroming kap en verwijder de chips van container naar beneden om te voorkomen dat scheppen mogelijk zwevende verontreinigingen in de top flacon. </li><li> Spoel bovenkant van het flesje van de chip 2x met vers gefilterd steriel gedeïoniseerd water om eventuele resten van vuil te verwijderen van de chip oppervlak. </li><li> Zuig steriel gedeïoniseerd water uit de top flacon. </li><li> Sluit een uiteinde van de buis silastic aan de vloeibare kanaal een druk spuit met steriel gefiltreerd gedeïoniseerd water. In ons systeem, spuiten gevuld met oplossing zijn onder druk door aansluiting op een perslucht tank ingesteld op 20psi. Om de steriliteit te garanderen, wordt de lucht gefilterd (0,22 um filter) vóór binnenkomst in de spuit en ons systeem heeft ook een aan / uit klep die ons in staat stelt om te stoppen of druk uit te oefenen als dat nodig is. </li><li> Met behulp van een hemostaat, klem de uitgang van de slang. </li><li> Open de aan / uit kleppen aan de oplossing onder druk. </li><li> Om de subterranen vloeibare van de chip afspoelen met steriel gedeïoniseerd water, vrij wilt de uitgang van de slang. </li><li> Om voorce het water omhoog door de opening, klemt u de uitgang van de buis met een hemostat. </li><li> Om de waterafvoer te vermijden, klem de input en output uiteinden van de buis met een hemostats en sluit de aan / uit kleppen. </li><li> Maak de ingang uiteinde van de slang van de injectiespuit. </li><li> Plaats glas worden aangesloten op beide uiteinden van de buizen en verwijder de hemostats. </li><li> Vul top flacon met filter steriled gedeïoniseerd water. </li><li> Plaats het deksel van een 35 mm steriele schaal in de basis van een 100 mm steriele gerecht </li><li> Plaats chip op het deksel 35 mm en deksel met 100 mm schaal deksel. </li><li> Afbeelding chips dat de membraan en opening van de chips zijn vrij van vuil en / of luchtbellen. In ons laboratorium wij een opstaande microscoop 20x lange werkafstand doel te gebruiken. </li><li> Als er stof en / of luchtbellen aanwezig zijn, herhaaldelijk spoelen vloeibare kanaal en top flacon. Indien het puin en / of lucht kan worden verwijderd chip verwijderd. </li><li> Zodra de chipsafgebeeld, terug te keren naar laminaire stroming kap en trek beide uiteinden van de buizen. </li><li> Bevestig een uiteinde van de slang aan op een onder druk spuit met fysiologische media. </li><li> Klem de uitgang van de buis met een hemostat </li><li> Open drukventiel, verwijder de hemostaat van de uitgang einde van de vloeistofcomponenten en spoel de vloeibare kanaal met fysiologische media </li><li> Om de ondergrondse vloeibare met fysiologische media spoelen, opent u de aan / uit kleppen en verwijder de hemostaat van de uitgang uiteinde van de slang. </li><li> Om de fysiologische media opdrijven door de opening, klemt u de uitgang van de buis met een hemostat. </li><li> Klem ingang uiteinde van de slang met een hemostat en sluit de aan / uit kleppen. </li><li> Verwijder de ingang uiteinde van de slang uit de spuit en steek beide uiteinden van de buis met glas pluggen. </li><li> Verwijder de hemostats. </li><li> Verwijder het water van boven flacon. </li><li> Vul de bovenste flacon met filter gesteriliseerd fysiologische media. </li><li>Plaats de chip terug in de 100 mm petrischaal. </li><li> Plaats de voet van een 35 mm schaal in de 100 mm schotel en vul deze met filter gesteriliseerd gedeïoniseerd water om de luchtvochtigheid te verrijken. </li><li> Dek de schaal af tot het tijd is voor plating </li></ul> 4. Cel beplating van slak neuronen De patch-clamp chips kunnen geschikt zijn voor verschillende preparaten. We zijn momenteel testen van onze chips met zoogdieren primaire corticale neuronen en hebben verkregen voorlopige resultaten met cellen gekweekt gedurende 14 dagen 7, wat erop wijst dat onze sterilisatie-protocol adequaat is en dat de chips zijn niet cytotoxisch in lange termijn culturen. Voor de toepassing van dit protocol werden slak neuronen gekozen omdat ze een eenvoudige, maar goed gevestigde model voor neuronale elektrofysiologie 11 te bestuderen, en het is met die cellen dat we de belangrijkste resultaten tot nu toe 10 verkregen. Gedetailleerde celisolatie en cultuur proceduresis eerder beschreven 12, 13. <ul type="disc"><li> Verwijder de buitenste schil van 2-3 maanden oud Lymnaea stagnalis met stompe pincet en Anesthetize dieren in Lymnaea zoutoplossing die 10% Listerine. Alle volgende stappen uitgevoerd aseptisch in een laminaire luchtstroom kap met gesteriliseerd dissectie apparatuur en oplossingen bij kamertemperatuur. </li><li> Vervang de fysiologische media in de vloeistofcomponenten met de juiste opname oplossing met behulp van een Eppendorf pipet. Bij Lymnaea neuronen oplossing bevat (in mM) 50 KCl, 5 MgCl2, 5 ethyleenbis (oxyethylenenitrilo) tetra-azijnzuur (EGTA) en 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Speld de slakken in een Sylgard schaal gevuld met Lymnaea zoutoplossing en verwijder hele brein, zoals eerder beschreven 13 </li><li> Behandel de isolated hersenen in bepaalde media (DM) met trypsine enzym (0,2%, Sigma, Catalog # T-9201) gedurende 18 minuten gevolgd door behandeling in DM en trypsine inhibitor (Sigma, soja, Catalog # T-9003) gedurende 15 minuten. </li><li> Speld de hersenen in een kleine Sylgard schaal gevuld met een hoge osmolariteit gedefinieerde media (HODM - DM met glucose toegevoegd, 750 ul van 1 M glucose-oplossing om 20 mL DM). </li><li> Met behulp van fijne pincet en dissectie schaar, verwijder de buitenste en binnenste omhulsel van de ganglia van belang, het blootstellen van de neuronen. </li><li> Met behulp van een brand geslepen glazen pipet gevuld met HODM en bevestigd aan een injectiespuit zachtjes zuig de buurt van de cel van belang (linker pedaal dorsale 1) tot het neuron los van de hersenen en is geschorst in de pipet. </li><li> De glazen pipet wordt dan verplaatst en gedompeld in individuele neurochips waar zachte verwijdering van het micro-kan de neuronen om voorzichtig naar buiten worden gedrukt de pipet en geplaatst op de top van de individuele patch gaten op de chips.</li><li> Laat cellen ongestoord zitten minste 2 uur bij kamertemperatuur de bevestiging bevorderen de chip oppervlak rond de opening. </li></ul> 5. Elektrofysiologische registraties De chips aansluiten aan de versterker (in ons geval een Multiclamp 700B versterker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) <ul type="disc"><li> Plaats de oplossing in de vloeibare ondergrondse en de chip flacon met de juiste registratie oplossingen. Bij Lymnaea neuronen de bovenste cultuur kamers zijn gevuld met Lymnaea zoutoplossing (in mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl2 en 1.5 MgCl2) gebufferd tot pH 7,9 met HEPES 14. </li><li> Voor de stabiliteit, lijm de chip op een glasplaatje en het onder een microscoop te plaatsen. </li><li> Om de chip te sluiten op de versterker (in ons geval een Multiclamp 700B versterker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), snij een uiteinde van de slang en plaats een Silver draad die is aangesloten op de hoofd-fase. </li><li> Plaats de referentie-elektrode in de top flacon van de chip. </li><li> De chip is nu klaar voor opname. </li><li> Breng een 5 mV stap met de versterker om de totale weerstand te meten (R t) en bepalen de configuratie van de neuronen: cel-ingeschreven (R t&gt; 1 GΩ); whole-cell (Rt = 50-100 MΩ plus capacitieve transiënten, indicatieve van membraan scheuren over het diafragma), of geen zegel (R t &lt;5 MΩ). In onze laatste set van experimenten 10, 58% procent van de cellen met hoge weerstand afdichtingen had, en van die 80% van de cellen toonde opgewonden reacties. </li></ul> 6. Representatieve resultaten <ul type="disc"><li> Breng depolariserende stroompulsen (20 pA increment) het neuron (in dit geval LPeD1). </li><li> Houd het neuron bij Vm dicht bij haar rustpotentiaal (~ - 60 mV). </li><li> Houd u aan de antwoorden op deze depolariserende pulsen. Overschrijding actiepotentialen moetworden waargenomen als het neuron levensvatbaar is. </li><li> Figuur 4 toont een representatief resultaat dat in detail besproken in 14, 15. </li></ul><img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Spanning reacties (top) een LPeD1 neuron aan graded reeks intracellulaire stroompulsen (onder). De stroompulsen werden op Vm = - 60mV. Problemen oplossen <ul type="disc"><li> Voordat plating, het beeld chips te bepalen of membraan en diafragma zijn vrij van vuil en geschikt voor plating. We maken gebruik van een rechte microscoop en een 20x lange werkafstand doelstelling. In onze laatste set van experimenten 1, werden 67% procent van de chips met succes voorbereid op die manier. </li><li> Als er stof en / of luchtbellen aanwezig zijn gooi-chip en probeer een andere. </li><li> Diverse oppervlaktebehandelingen (plasma) of coatings (PDL, PEI, etc.) kunnen worden geprobeerd, maar het succes kan zijn sterk afhankelijk van celtypegebruikt. </li><li> De samenstelling van de vloeibare ("pipet") oplossing in kritieke voor de vorming van de giga-afdichting en de hele cellen. Pas oplossing, met aandacht voor osmolariteit, pH en ionische make-up. </li><li> Voor de langere termijn cultuur, te beginnen met de media in microfluïdische kanaal, schakel dan vóór pipetteer oplossing om de opname via de zachte zwaartekracht gevoede perfusie (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

<ol><li>Walz, W. Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalz%2C+W+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, Springer Protocols. 38(2007).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Behrends, J. C., Fertig, N. Ch. 14: Planar Patch-clamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrends%2C+JC+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, (2007).</li>
<li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li>
<li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li>
<li>National Research Centre of Canada . , Candian Photonics Fabrication Centre. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html">http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html</a> (c1995-2001).</li>
<li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology & Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li>
<li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li>
<li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P. In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSyed%2C+NI+%22Modern+techniques+in+neuroscience+research%22">Modern techniques in neuroscience research</a>. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. (1999).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li>
<li>Ong, W. -L., Yobas, L., Ong, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay%3A+gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187(2006).</li>
<li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li>
<li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. omas, Monette, T., Py, R., A, C. K. rantis, Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li>
<li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li>
<li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaketani%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology%3A+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays</a>. , Springer. (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

NRCC&#39;s patch-clamp chip ondervraging platform is een potentieel krachtig hulpmiddel voor hoge informatie-inhoud farmaceutische testen en te onderzoeken in vitro modellen van de ziekte. De voordelen ten opzichte van glas pipetten een laag toegang weerstand, die een voordeel grote cellen probe, en ondanks een iets grotere capaciteit resulteert in dynamiek vergelijkbare kleinere cellen. Spontane cel om diafragma zegels zijn routinematig verkregen, en hele celinvoer is waargenomen dat spontane 14 te zijn. Een duidelijk verschil tussen chips en het glas pipet methode is dat de probe deel van de cel kweekschaal en niet handmatig in contact gebracht met de celmembraan. Het kweken van cellen, eventueel van functionele netwerken, resulteert in biologisch relevante modellen ziektemodellen en een ander mechanisme voor het vastzetten hoge cel sonde afdichtingen 16. Echter, in tegenstelling tot celsuspensies, aspiratie cannot worden gebruikt om een ​​cel op de sonde positioneren. Slak neuronen, zoals andere grote cellen, vatbaar zijn voor manuele positionering van de sonde. Voor kleinere cellen die een langere tijd cultuur hebben wij overbodig maakte een manipulatie en houdt een grote kans op het verkrijgen van een afdichting met patronen hechting Polypeptiden bovenop de probes cellen bovenop de probes en aangetoond plaatsing van cellen op de probe 17,18. NRCC wordt ook aan een polyimide microfluïdisch patch-clamp chip 19 met een capaciteit vergelijkbaar met die van glas pipet. Het uiteindelijke doel van dat project is een multiple-probes patch-clamp-chip die het mogelijk maakt de gelijktijdige controle van de elektrofysiologische activiteit van een aantal neuronen betrokken zijn in het netwerk van gedrag bij de resolutie van de individuele ionkanalen 14. Deze methode is een hoge resolutie complementaire methode multi-elektrode arrays 20.

kweken en elektrofysiologie van cellen op nrcc patch-clamp chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Door zijn uitstekende gevoeligheid en het vermogen om te bewaken en controleren van individuele cellen op het niveau van ionkanalen, patch-spannen is de gouden standaard van elektrofysiologie toegepast op de ziekte-modellen en farmaceutische schermen zowel 1. De werkwijze omvat gewoonlijk zacht contact brengen van een cel met een glazen pipet opgevuld met een fysiologische oplossing om een stuk het membraan isoleren onder de top 2. Een elektrode geplaatst in de pipet legt ionkanaal activiteit in het membraan pleister of wanneer gescheurd voor de gehele cel. In het laatste decennium patch-clamp chips zijn voorgesteld als alternatief 3, 4: een onderbroken film scheidt de fysiologische medium uit het kweekmedium en een opening in de film microfabricated vervangt de top van de pipet. Patch-clamp chips zijn geïntegreerd in geautomatiseerde systemen en op de markt voor high-throughput screening 5. Om incrgemakkelijk doorvoer zij omvatten de vloeibare levering van cellen van suspensie, de positie van het diafragma door afzuigen en geautomatiseerde routines cel-probe afdichtingen detecteren en sluiten gehele cel mode. We hebben gerapporteerd over de fabricage van een silicium patch-clamp chip met geoptimaliseerde impedantie en opening vorm die de hoge kwaliteit opname van actiepotentialen in gekweekte neuronen slak 6 toelaat, onlangs hebben we ook gemeld vooruitgang op weg naar het ondervragen van zoogdieren neuronen 7. Onze patch-clamp chips worden vervaardigd op de Canadese Photonics Fabrication Center 8, een commerciële gieterij, en zijn verkrijgbaar in grote series. We staan ​​te popelen om deel te nemen in samenwerking met elektrofysiologen het gebruik van de NRCC technologie in verschillende modellen te valideren. De chips worden gebruikt volgens de algemene regeling in figuur 1 weergegeven: de chip is aan de bodem van een plexiglas cultuur flacon en de achterzijde van de opening is verbonden met een ondergrondse-zendersel uitgerust met buizen aan weerszijden van het pakket. Cellen gekweekt in de flacon de cel van de sonde wordt bewaakt door een meetelectrode opgenomen in de twee buitenste channel.The vloeibare poorten oplossing, gemakkelijker met minimale verstoring van de cel is een voordeel ten opzichte van glas pipetten voor intracellulaire perfusie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Principe van de meting met behulp van de NRCC patch-clamp-chip We detail hier de protocollen te steriliseren en ontluchten van de chips, ze laden met medium, plaat ze met cellen, en uiteindelijk deze te gebruiken voor elektrofysiologische opnamen.

We laten zien hoe vlakke patch-clamp chips gefabriceerd op de National Research Council of Canada worden gesteriliseerd, gegrond, geladen met medium, bedekt met cellen, en gebruikt voor elektrofysiologische opnamen.

Kweken en Elektrofysiologie van cellen op NRCC Patch-clamp Chips

Vanwege de uitzonderlijke gevoeligheid en de mogelijkheid om individuele cellen op het niveau van ionkanalen te monitoren en te controleren, is patch-clamping de gouden standaard ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het registreren van de elektrofysiologische activiteit van gecultiveerde cellen via een planaire patchclamp-chip. Dit wordt bereikt door de patchclamp-chips te steriliseren, te primen en te testen, zodat celcultuur kan groeien en de daaropvolgende elektrofysiologische activiteit ervan kan worden gemonitord. Na het testen kunnen de chips worden bewaard totdat ze in een celbiologielaboratorium opnieuw worden geprimed.Als volgende stap worden neuronen geëxtraheerd uit ledematen, stussen en gekweekt op de chips. Tot slot worden de chips aangesloten op een patchclamp-versterker om de elektrofysiologische activiteit van de cellen te monitoren. Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van de bestaande planaire patchclamp-chips is dat deze geschikt is voor gebruik met neuronen in kweek, waardoor onderzoek mogelijk is naar synaptisch communicerende neuronen.Deze methode en aanpak maken een beter begrip mogelijk van de ionkanaalfuncties van prikkelbare cellen die zijn ingebed in een neuraal netwerk, onder zowel normale als pathologische omstandigheden. De implicaties van deze methode strekken zich uit tot de farmacologie, waar deze kan worden gebruikt voor drugscreenings met een gemiddelde doorvoer en een hoog informatiegehalte voor ionkanalen en receptorproteïnen. We hebben ervoor gekozen om deze methode te demonstreren met neuronen van slakken, omdat deze neuronen eenvoudig gepositioneerd en gekweekt kunnen worden.Omdat deze neuronen in kweek opnieuw netwerken vormen, zijn ze uitstekend geschikt voor studies naar transformatie. Belangrijker is dat deze chips ook kunnen worden gebruikt in andere cellsystemen, zoals hart- en kankercellen. De belangrijkste uitdaging bij het gebruik van planaire patchclamp-chips is het verkrijgen van chips met schone openingen, evenals het uitplaten en kweken van cellen.Niet-aangesloten chips zouden contraproductief zijn, en daarom worden alle chips getest voordat ze worden gebruikt. Het meest kritieke punt van de elektrofysiologische beoordeling vindt plaats zodra de cellen zijn gekweekt. Dit bestaat uit de vorming van de gigaseal tussen het celmembraan en de bovenste twee randen van de chip.Alle geproduceerde planaire patchclampchips maakten gebruik van geïsoleerde cellen in suspensie en zijn afhankelijk van zuigkracht om cellen naar de opening te trekken voor de vorming van een giga-seal. De vorming van de GigE vindt bij onze chips spontaan plaats.Terwijl de neuronen worden gekweekt en er geen gebruik wordt gemaakt van zuiging, zal ik de sterilisatie van de chip en de screeningsstap demonstreren. Tanya zal het laden in een cellensbiologielaboratorium uitleggen, Colin zal de celpreparatie en het uitplaten illustreren. Ten slotte zal Marcia laten zien hoe onze opnames worden gemaakt. Om deze procedure te starten, steriliseert u de chips in een basisplasma-reiniger met een residuele luchtdruk van 0,1 tot 0,3 millibar gedurende 15 minuten bij een maximaal vermogen van 18 watt.De plasmabehandeling maakt de chip bovendien hydrofiel, wat het primen vergemakkelijkt. Voorzie de glazen buisjes vervolgens van steriele elastische laboratoriumsiliconeslangen, drie inch aan het ene uiteinde en één inch aan het andere uiteinde. Vul de buisjes daarna met een steriele standaard fosfaatbuffersolutie, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen achterblijven.Klem de lange siliconen slang af terwijl de PBS vanaf het korte uiteinde onder een druk van één atmosfeer wordt gezet. Laat vervolgens de druk in het fluïdische kanaal ontsnappen. Vul daarna het flacon met PBS met behulp van een spuit.Dompel een zilver/zilverchloride-elektrode in het vial en een tegenelektrode in de korte buis. Gebruik een impedantiemeter om te bevestigen dat de toegangsweerstand tussen 300 kilo ohm en 3 mega ohm ligt, en de shuntcapaciteit tussen 10 pico farad en 25 pico farad. Spoel vervolgens het vloeistofkanaal door met steriel gedeïoniseerd water.Leeg het bovenste vial en herhaal het spoelproces twee keer. Dompel vervolgens het chipverpakking met de buisjes gedurende 30 minuten onder in vers, steriel gedeïoniseerd water. Plaats daarna andere chips in een steriele container gevuld met steriel gedeïoniseerd water.Dit zorgt ervoor dat de chips hydrofiel blijven en beschermd zijn tegen contaminatie. Open een chipcontainer onder een HEPA-gefilterde laminaire flow-kast en verwijder de chips waarbij het bovenste vial naar beneden is gericht om contaminatie door verpakkingsresten die op het wateroppervlak drijven te voorkomen. Om eventuele resterende resten van het chipoppervlak te verwijderen, spoelt u het bovenste vial tweemaal met gefilterd steriel gedeïoniseerd water. Verbind één uiteinde van de elastische slang die aan het fluïdische kanaal is bevestigd met een onder druk staande spuit met steriel gefilterd gedeïoniseerd water.In dit systeem wordt het water in de spuit onder druk gezet door een persluchttank die is ingesteld op één atmosfeer; om steriliteit te waarborgen wordt de lucht gefilterd voordat deze de spuit binnentreedt. Dit systeem is bovendien uitgerust met twee aan-uitkleppen waarmee de druk indien nodig kan worden geregeld. Klem het uitlaatpunt van het vloeistofsysteem af met een hemostat.Open vervolgens het ventiel van de persluchttank om de oplossing onder druk te zetten. Open daarna de hemostaat aan het uitlaatende van het vloeistofsysteem om de chip door te spoelen met vers steriel gedeïoniseerd water. Klem het uitlaatende van het vloeistofsysteem af met een hemostaat om het water door de opening te dwingen.Om waterafvoer te voorkomen, wordt de inlaat van het vloeistofsysteem met de hemostat afgeklemd en worden de aan-uitkleppen gesloten. Koppel vervolgens het inlaatuiteinde van de slang los van de spuit. Sluit beide uiteinden van de slang af en verwijder de hemostaten.Vul het bovenste flacon met het gefilterde steriele gedeioniseerde water. Plaats vervolgens het deksel van een steriele schaal van 35 millimeter op de bodem van een steriele schaal van 100 millimeter. Plaats daarna een chip bovenop het deksel van 35 millimeter en dek dit af met een deksel van een schaal van 100 millimeter.Om ervoor te zorgen dat het membraan en de opening van de chips vrij zijn van vuil of luchtbellen, worden de chips afgebeeld. Indien er vuil of luchtbellen aanwezig zijn, worden het fluïdische kanaal en het bovenste flacon herhaaldelijk gewassen met steriel water.Als het vuil of de luchtbellen niet verwijderd kunnen worden, wordt de chip weggegooid. Zodra de chips zijn afgebeeld, brengt u de chips terug naar de laminaire flowkast. Koppel beide uiteinden van de slang los.Bevestig één uiteinde van de slang aan een onder druk staande spuit met fysiologisch medium en klem het uituiteinde van de slang af met de hemostat om het ondergrondse vloeistofsysteem te spoelen met fysiologisch medium. Open de aan/uitkleppen en verwijder de hemostat van het uiteinde van de slang om het fysiologisch medium door de opening te persen; klem vervolgens het uituiteinde van de slang af met de hemostat, klem het inuiteinde van de slang af met de hemostat en sluit de aan/uitkleppen. Verwijder daarna het inuiteinde van de slang uit de spuit en sluit beide uiteinden van de slang af met glazen stoppen.Verwijder vervolgens de hemostaten. Verwijder daarna het water uit het bovenste vial. Vul het bovenste vial met gefilterd steriel medium.Plaats de chip terug in de 100 millimeter petrischaal. Plaats vervolgens de bodem van de 35 millimeter petrischaal in de 100 millimeter petrischaal en vul deze met gefilterd steriel gedeïoniseerd water om de luchtvochtigheid te verhogen. Dek de schaal daarna af tot het moment van het uitplaten.Om deze procedure te starten, verwijdert u met een stompe pincet de buitenste schelp van twee tot drie maanden oude li sags. Anestheseer de dieren vervolgens in limba-zoutoplossing met 10% Listerine in een laminaire flowkast. Speld de slakken vast in een cell guard-schaaltje gevuld met limba-zoutoplossing en verwijder de volledige hersenen.Behandel vervolgens de geïsoleerde hersenen in gedefinieerd medium met trypsine-enzym gedurende 18 minuten. Behandel ze daarna in gedefinieerd medium met een trypsine-inhibitor. Pin de hersenen gedurende 15 minuten met een fijne pincet en een dissectieschaar vast aan een klein cell guard-schaaltje gevuld met gedefinieerd medium met een hoge osmolariteit.Verwijder de buitenste en binnenste schede van de betreffende ganglia en leg de neuronen bloot. Bevestig vervolgens een vuurgepolijste glazen pipet, gevuld met gedefinieerd medium met een hoge osmolariteit, aan een microspuit en oefen voorzichtig zuigkracht uit nabij de betreffende cel tot het neuron loslaat van de hersenen en in de pipet wordt opgeslagen. Nadat het medium in de vloeistofsystemen van de neurochip is vervangen door een geschikte registratie-oplossing, wordt de glazen pipet in een kweekbuis gekanteld en het neuron voorzichtig boven de opening van de chip geplaatst.Laat de cellen minimaal twee uur ongestoord op kamertemperatuur rusten om de hechting aan het chipoppervlak rond de opening te bevorderen. Vervang de oplossing in de kweekschaal door de geschikte registratie-oplossing voor stabiliteit. Lijm de chip op een glazen objectglas en plaats deze onder een microscoop om de chips aan de versterker te verbinden.Knip het lange uiteinde van de slang af en voer de zilverdraad in die verbonden is met de headstage. Plaats vervolgens de referentie-elektrode in de chip-kweekschaal. De chip is nu klaar voor de registratie.Hier wordt een voorbeeld getoond van de spanningsreacties van een linker pedaal dorsaal-1 neuron op graduele series intracellulaire stroompulsen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de elektrofysiologische activiteit van gecultiveerde cellen kan worden geregistreerd met een planaire patchclamp-chip. Onthoud dat we in de eerste stap chips screenen om er zeker van te zijn dat die welke niet worden gebruikt om cellen uit te platen een verstopping hebben; Ture biology-gebruikers beginnen bij de laadstap en vinden doorgaans nog steeds een paar geblokkeerde chips per batch.Deze nieuwe methode vormt een belangrijke doorbraak in de ontwikkeling van een goedkope technologie waarmee in vitro neurale netwerken met een ongekende resolutie kunnen worden onderzocht. Deze technologie kan leiden tot geavanceerde assays voor de identificatie van therapeutische targets, geneesmiddelenontwikkeling en diagnostische beoordeling. Verdere ontwikkeling van deze technologie zal gezondheidsonderzoekers nieuwe mogelijkheden bieden om innovatieve therapieën voor neurologische ziekten of aandoeningen te verkennen.Het potentieel ervan strekt zich uit tot hartcellen, kanker en andere cellen met electrogene eigenschappen.

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

In this video, embryonic kidney cell cultures expressing light-dependent ion channel proteins fused with a fluorescent reporter demonstrate the effect of light on ion movement. Whole-cell patch clamp is used to monitor the movement of ions.

Optogenetic Electrophysiology Recording of Cells with Light-Dependent Ion Channels

We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene...

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

Afferent sensorische neuronen geven sensorische informatie van de periferie naar het centrale zenuwstelsel door. Het identificeren van specifieke afferente neuronen zal helpen bij het begrijpen van hun fysiologie. We beschrijven een methode van retrograad labelen om afferente neuronen te identificeren, en bestuderen de spanningsafhankelijke ionenkanalen in deze neuronen met behulp van patch clamp elektrofysiologie en immunocytochemie.

Identificatie van specifieke Sensory Neuron Populaties voor Studie van Uitgedrukt Ion Channels

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Gesloten-lus protocollen worden steeds gebruikelijker in de moderne elektrofysiologie. We presenteren een eenvoudige, veelzijdige en goedkope manier om complexe elektrofysiologische protocollen uit te voeren in corticale piramidale neuronen in vitro, met behulp van een desktopcomputer en een digitale acquisitiekaart.

Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Een methode voor stimulatie van in-vitro celcultuur elektrische activiteit met zichtbaar licht, gebaseerd op het gebruik van organische halfgeleidende polymeren, wordt beschreven.

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Dit artikel beschrijft hoe de ion-selectiviteit van channelrhodopsine wordt bepaald met elektrofysiologische whole-cell patch-clamp opnames met behulp van HEK293 cellen. Hier wordt de experimentele procedure voor het onderzoeken van chloride-selectiviteit van een anion-selectieve channelrhodopsine gedemonstreerd. De procedure is echter overdraagbaar naar andere channelrhodopsinen met een verschillende selectiviteit.

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Leer elektrofysiologische opnames van gekweekte neuronen met behulp van planaire patch-clamp chips. Deze methode maakt giga-seal formatie mogelijk voor ionkanaalonderzoek en medium-doorvoer drugs screening.

Kweken en Elektrofysiologie van cellen op NRCC Patch-clamp Chips

Meer video's verkennen