Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging
December 23rd, 2011
Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.
Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van kankercellen visueel te inspecteren en te karakteriseren door een compartimentaliserend microfluïdisch apparaat. Dit wordt bereikt door eerst het dissociëren van reeds bestaande neurosferen van hersenkankerstamcellen die in serumvrij medium zijn gekweekt. De tweede stap is om een Bilayered SU eight master te fabriceren en met behulp van zachte lithographie een A-P-D-M-S stempel te maken met een compartimentaliserend ontwerp.
Vervolgens wordt het microfluïdisch apparaat geassembleerd en geladen met hersenkankerstamcellen. Ten slotte wordt langdurige time-lapse beeldvorming van de migratie van hersenkankerstamcellen gerealiseerd met behulp van een all-in-one microscopisch systeem. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat hersenkankerstamcellen een draaiende sequentie van morfologische stadia vertonen tijdens hun migratie door ultrabeperkte ruimte.
Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande massa's zoals de Transwell Boyton Chamber, is dat het microapparaat een visuele inspectie van het migratieproces mogelijk maakt, gecontroleerde plaatsing van cellen en de nauwkeurige levering van factoren. Daarom heeft microforic-technologie de kenmerken van betrouwbare, efficiënte en kosteneffectieve selectie en navigatie van enkelvoudige cellen. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van kankermetastase en recidief, omdat enkelcelanalyse van hoog migrerende cellen potentiële toekomstige chemotherapeutische doelen kan identificeren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in het migratiegedrag van kankersystemen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals embryonale ontwikkeling, immuunresponsen, wondgenezing en orgaanregeneratie. Begin met de celsuspensie van BTSC afgeleide neurosferen. Verzamel de cellen in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 900 RPM, maar niet sneller.
Zuig de super natin op. Laat vervolgens de neurosferen los door ze gedurende vijf tot tien minuten te incuberen in 0,5 milliliter voorgewarmde Accutane bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, verstoor de cellen mechanisch met 10 tot 20 zachte bewegingen van een P 100 pipet.
Voeg vervolgens 1,5 milliliter stamcelmedium toe om de Accutane te neutraliseren, centrifugeer de celsuspensie bij 1300 RPM gedurende vijf minuten en suspendeer de cellen in één milliliter stamcelmedium. Controleer de celdichtheid met een hemo cytometer en pas de dichtheid aan op 20.000 cellen per microliter. Om te beginnen met de fabricage van de SU eight master, bereid twee fotomaskers voor met behulp van Adobe Illustrator en laserprint transparantiefolie met Image Setter incorporated.
De eerste laag fotomasker bestaat uit twee fiducial markers en een array van microkanalen, en de tweede laag van het fotomasker heeft de zitting- en ontvangstkamers. Reinig beide maskerlagen met isopropanol en laat ze aan de lucht drogen. Spuit nu een handwafeltje met drie micron dikke SU eight foto resist, gevolgd door zachte bakken.
Stel vervolgens de eerste laag fotomasker in nauwe contact uv, leg het fotoresist bloot en laat het uitharden. Bak en ontwikkel vervolgens de uitgeharde wafel. Bedek de gebieden van de fiducial marker op de handwafel met scotch tape.
Spuiten vervolgens de wafel met 250 micron dikke foto resist. Schil vervolgens de tape af om de markers voor uitlijningsdoeleinden te onthullen. Plaats de tweede laag foto resist en lijn de fiducial markers uit.
Leg vervolgens de tweede laag fotomasker bloot en laat het uitharden, gevolgd door post bakken en ontwikkelen. Bepaal nu de SU eight master via dampdeposition om het oppervlakteplakkerigheid te verminderen. Plaats de wafels in een droogkast met verschillende druppels Tri Chloro clijn oplossing onder vacuüm gedurende ten minste één uur.
De master is dan klaar voor gebruik om PDMS met de master te gieten. Begin met het grondig mengen van de voorpolymeerbasis met het geneesmiddel in een verhouding van 10 tot 1. Plaats vervolgens het mengsel in een droogkast voor vacuümontgassing totdat er geen luchtbellen meer zichtbaar zijn.
Giet het mengsel op de masker en ontgast opnieuw. Als er nieuwe luchtbellen worden geïntroduceerd, dan moet de mal gedurende twee uur bij 90 graden Celsius op een vlakke hot plate worden uitgehard. Nadat het is afgekoeld tot kamertemperatuur, laat u de PDMS stempel voorzichtig los.
Zo worden cultuurkanalen gegraveerd in PDMS en klaar voor assemblage van het microfluïdische apparaat. De master is herbruikbaar voor het gieten totdat deze barst of versleten is. Wanneer de master plakkerig wordt, kan de anti-plakkerige coating opnieuw worden aangebracht.
Begin met het maken van inlaten en uitlaten in het microfluïdische apparaat door de PDMS stempel. Reinig de PDMS stempel door hem gedurende 30 minuten in 70% ethanol te weken en vervolgens gedurende 10 minuten in gedeïoniseerd water te spoelen. Steriliseer en voltooi de cross-link reacties van de PDMS stempel door middel van autoclaving.
Leg nu de PDMS stempel op een glasdekje dat is gecoat met poly L lysine. Het apparaat wordt vervolgens gecoat met laminaat door de kamers te vullen met laminaat oplossing via reservoir inlaten en gedurende een nacht bij 37 graden Celsius te incuberen. De volgende dag, zuig het laminaat van het apparaat.
Was vervolgens het apparaat door het twee keer te overspoelen met stamcelmedium. Laad nu 11 microliter gedissocieerde cellen in een van de zaai reservoirs. Gebruik indien nodig vacuüm aspiratie om de cellen in de kamer te forceren. Laad vervolgens een extra zeven microliter cellen in het aangrenzende zitting reservoir.
Na vijf minuten zullen de zitting en ontvangst reservoirs worden overspoeld met media. Plaats nu een 0,5 tot één millimeter dikke steriele PDMS plaat op het apparaat. De natuurlijke oppervlakte adhesie van PDMS met zichzelf zal het apparaat afdichten. Eenmaal afgesloten, is het klaar voor transport, incubatie en microscopische beeldvorming.
Voorbereidt de biot, IM door het 45 minuten te laten lopen. Om de temperatuur, vocht en luchttoevoer te stabiliseren, voegt u verschillende schalen water toe aan de monsterkamer om de
Overzicht
Deze studie presenteert een microfluïdisch apparaat dat is ontworpen om de migratie van kanker-stamcellen te onderzoeken. Het platform maakt real-time visualisatie van levende celbewegingen mogelijk, waardoor inzichten worden verkregen in de mechanismen van agressieve kankercel-infiltratie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Microfluidica
- Kankerbiologie
Achtergrond
- Kanker-stamcellen zijn betrokken bij tumormetastase en recidief.
- Het begrijpen van hun migratie kan leiden tot betere therapeutische strategieën.
- Bestaande methoden hebben niet de mogelijkheid om celbeweging in real-time visueel te volgen.
- Microfluïdische technologie biedt een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van celgedrag.
Doel van de studie
- Om een microfluïdisch apparaat te ontwikkelen voor het observeren van kanker-stamcelmigratie.
- Om de morfologische veranderingen tijdens celbeweging te analyseren.
- Om potentiële chemotherapeutische doelen te identificeren door middel van single-celanalyse.
Gebruikte methoden
- Dissociatie van hersentumor-stamcellen uit neurosferen.
- Fabricage van een gelaagde SU-8 master met behulp van zachte litografie.
- Assemblering van het microfluïdische apparaat en het laden van cellen.
- Langdurige time-lapse beeldvorming van celmigratie.
Belangrijkste resultaten
- Hersentumor-stamcellen vertonen verschillende morfologische stadia tijdens migratie.
- Het microfluïdische apparaat maakt nauwkeurige controle van celplaatsing en factorafgifte mogelijk.
- Deze techniek is efficiënter dan traditionele methoden zoals de Transwell Boyton Chamber.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstige kankertherapieën gericht op metastase informeren.
Conclusies
- Het microfluïdische apparaat is een betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van kankerceldynamica.
- De bevindingen kunnen zich uitstrekken tot andere biologische processen zoals wondgenezing en orgaanregeneratie.
- Deze aanpak verbetert ons begrip van het gedrag van kanker-stamcellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Compartmentalizing microfluidic devices enable high-resolution analysis of cancer stem cell migration, addressing a critical bottleneck in understanding mechanisms of metastasis and therapeutic resistance. This platform supports predictive confidence in target validation by isolating and characterizing highly migratory subpopulations relevant to aggressive tumor behavior. Integration of live cell imaging with microenvironment control positions this method at a key inflection point for translational oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of migratory mechanisms in brain tumor stem cells at single-cell resolution.
- Supports biological de-risking by isolating aggressive subpopulations for downstream molecular analysis.
- Facilitates functional target validation through direct observation of migration phenotypes.
- Improves predictive confidence for prioritizing therapeutic targets linked to metastasis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, compartmentalized systems for quantitative migration assays.
- Standardizes assay conditions with precise control over cell placement and factor delivery.
- Enables reproducible, scalable workflows for screening compounds affecting migration.
- Supports reliable evaluation of candidate interventions targeting invasive cell behavior.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by simulating tumor cell spread through brain interstitial spaces.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling isolation and reculture of migratory cells.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking migration phenotypes to molecular profiles.
- Supports mechanistic de-risking for therapeutic strategies targeting recurrence and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven migration studies, quantitative phenotyping, and downstream molecular analysis of isolated subpopulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on migration mechanisms and pathway involvement in cancer stem cells.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible platforms for evaluating migration-modulating compounds.
- Analytics: Delivers quantitative migration metrics and live imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro migration behavior to disease-relevant invasion and recurrence models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, reusable platform adaptable to diverse cell types and experimental questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in migration-driven oncology targets.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of migration assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by clarifying biological drivers of metastasis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and therapeutic strategies addressing recurrence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and live cell imaging.
- Demands access to specialized microscopy and analytical infrastructure for long-term imaging.
- Necessitates cross-team standardization of device design and assay protocols.
- Adaptable to various cell types and migration models with appropriate device modifications.
- Device reusability and assay throughput depend on maintenance and fabrication quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
BTSC Neurosphere Dissociation
3:00
Fabrication of Bi-layered su-8 Master
4:42
Molding of the PDMS Stamp
5:31
Assembly of Microfluidic Devices and Cell Culturing
7:04
Long-term Time-lapse Imaging of BTSC Migration with BioStation IM
7:46
Time-lapse Recordings of Migrating BTSC
8:40
Conclusion
