Name: Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer hoe je een genoom-brede screen uitvoert voor miRNA-doelen met behulp van de MISSION Target ID-bibliotheek. Deze methode maakt identificatie van micro RNA-targets mogelijk via celtransfectie en selectie met ganciclovir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het hele Sigma Life Science Mission Target ID Bibliotheek development team, in het bijzonder Kevin Gutshall voor het vinden van de technologie en het onderhandelen over de licentievoorwaarden, en Heather Holemon voor haar steun en deelname aan het oplossen van problemen vruchtbare discussies. We danken ook dr. Joop Gäken van King&#39;s College in Londen voor het vrij delen van niet-gepubliceerde resultaten en suggesties, en Qazi Hamid van RxBiosciences voor het bereiden van een grote partij van cDNA en zijn persistentie in het krijgen van het gekloond. We willen Nan Lin en Scott Bahr erkennen van SAFC voor het uitvoeren van cDNA arrays en data-analyse. Missie is een geregistreerd handelsmerk van Sigma-Aldrich Biotechnologie LP

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Auteurs verklaren financiële relaties met commerciële instellingen die belang hebben bij het ingezonden werk te hebben.

microRNA&#39;s zijn 20-24 nucleotide RNA&#39;s die de genexpressie reguleren post-transcriptie door remming van mRNA vertaling, en vaak, destabilisatie van de beoogde mRNA (besproken in [6]). Een enkele miRNA kunnen zelf een paar honderd mRNA naar een cel reageert op ontwikkelings-en signalen uit de omgeving te controleren. Het identificeren en valideren van doelwit mRNA&#39;s is essentieel in het bepalen van een miRNA de rol en functie in deze routes. Echter, target identificatie is niet eenvoudig, omdat, in dieren, miRNAs en hun doel sites zijn niet volledig complementair. De &quot;zaad&quot; gebied, gebaseerd 2 tot 7 van het 5&#39;-uiteinde van de miRNA, meestal complementair aan de doelstellingen. Er zijn echter vele uitzonderingen op het zaad regel-en downstream-base-paring kan compenseren voor een onvolmaakte zaad wedstrijd. Een aantal van de computer algoritmes zijn ontwikkeld om miRNA doelen op basis van zaad matching-en downstream-compensatie, doelstructuur voorspellen eend positie, volgorde behoud, en verschillende andere parameters die zijn waargenomen voor experimenteel gevalideerde targets (besproken in [7]). Terwijl in silico voorspellingen zijn handig en doen identificeren aan geldige miRNA doelen, de meeste voorspelde genen niet experimentele validatie testen, en veel feitelijke prestatiedoelstellingen worden niet voorspeld. Aangezien computeralgoritmen gebaseerd op vooraf bepaalde doel functies ze niet toe ontdekking targets die afwijken van hetgeen reeds bekend. Een aantal experimentele systemen zijn met succes gebruikt om te identificeren of te ontdekken functionele miRNA doelen in levende cellen. Deze globale screening methoden omvatten microarrays en RNA-sequencing, RNA co-immunoprecipitatie (RIP), en stabiele isotopen Labeling met aminozuren in Cell cultuur (SILAC), een proteomics methode (beoordeeld in [7]). Elke methode heeft voor-en nadelen. Aangezien miRNA gericht destabiliseert vaak een mRNA en leidt tot de afbraak, verlies or winst in mRNA niveau na de invoering van een miRNA na te bootsen of remmer respectievelijk, kan identificeren miRNA doelen. Dit verlies of winst van mRNA wordt gemakkelijk gedetecteerd door middel van microarray of diep-sequencing. Terwijl mRNA detectiemethoden zijn eenvoudiger en gevoeliger dan eiwitten detectiemethoden, zal mRNA detectie missen elke miRNA targets die niet worden afgebroken. Recente rapporten van de Bartell lab vergelijken van miRNA doel de resultaten van RNA-detectie met die van SILAC [8] of ribosoom profilering [9] blijkt dat zoogdieren miRNAs voornamelijk te handelen door het verminderen van doel-mRNA niveaus. Maar veel andere laboratoria werken met individuele miRNA waargenomen doelen verandering in de eiwitten, maar geen verandering in mRNA niveau. Verslagen van wat lijken te translationeel regelgeving zonder waarneembare mRNA verlies zijn onder andere: miR-10b op HOXD10 [10], miR221/222 op p27kip1 [11], miR-21 op Pdcd4 [12], miR-126 op p85β [13] , miR-34 op SIRT1 [14], miR-21 op PTEN [15], miR-302d op Arid4b [16], miR-200C op JAG1 [17], en miR-299, 297, 567, eene 609 voor VEGFA [18]. Bovendien Clancy et al. [19] onlangs gemeld dat translationele regulatie door laten we-7 werd pas ontdekt wanneer individuele mRNA isovormen dat het laat-7 doelplaats bevatten werden selectief gedetecteerd. Dit laatste blijkt dat, tenminste in sommige gevallen translationele regeling kan worden vergeten een samengesteld profiel - dat, wanneer alle mRNA isovormen gedetecteerd als een mRNA - zoals verkregen met vele microarray en sequentie-analyses. Co-immunoprecipitatie van miRNA-mRNA-complexen via Argonaute (meestal ago2) of een andere geassocieerd eiwit (RNA immunoprecipitatie, of RIP) zal isoleren miRNA doelen los van Verordening mechanisme. Daarnaast, RIP detecteert endogene, en vermoedelijk biologisch relevante, interacties. Het is echter niet bekend of alle miRNA-mRNA interacties functioneel zijn, en RIP zou missen mRNA doelen die associëren slechts tijdelijk of snel afgebroken. Bovendien moeten bepaalde miRNA-mRNA partners worden afgeleid bioinformatitisch omdat alle miRNA-mRNA paar co-neergeslagen bij elkaar. Tot slot, SILAC identificeert direct het eindproduct van miRNA regelgeving, het eiwit zelf, maar is ongevoelig en daardoor mist zeldzame eiwitten en kleine vouw veranderingen in eiwit niveaus. In het licht van de beperkingen met de huidige miRNA target identificatie methoden, voelden we ons een extra wereldwijde test om functionele miRNA targets te identificeren door een alternatief mechanisme nodig was. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we een vergunning een technologie uitgevonden door Joop Gaken en Azim Mohamedali van King&#39;s College in Londen. Hun uitvinding is een dubbele selectie fusie-eiwit, in het bijzonder, een thymidine kinase-zeocine fusie, gereguleerd door een cDNA-bibliotheek van de potentiële miRNA doelsequenties in zijn 3&#39;UTR. Stabiel getransfecteerde cellen met expressie en TKzeo-cDNA constructen kunnen worden geselecteerd zeocine, zoals in figuur 2. Na het uiten van een miRNA van belang, kan dat miRNA&#39;s doelstellingen worden gekozen with ganciclovir, zoals in figuur 3. Ganciclovir doodt cellen die thymidine kinase, dat wil zeggen, alle cellen die TKzeo-cDNA ontbreekt een streefcijfer voor de miRNA van belang. Gerichte cDNA kan worden geïsoleerd door PCR amplificatie van DNA uit cellen die ganciclovir behulp van primers die de flank cDNA en PCR-producten kunnen worden gesequenced om targets te identificeren overleven. Wij hebben de King&#39;s College in technologie in een nieuwe tool voor wereldwijde identificatie en de ontdekking van functionele menselijke miRNA doelen - De opdracht Target ID Library. Met de Target ID Bibliotheek, kunnen gebruikers isoleren miRNA doelstellingen door een reeks van zoogdiercelculturen transfectie en drugs selectie stappen. De bibliotheek is zeer uitgebreid, en bevat 66-79% van de menselijke genen. De eerste resultaten geven aan dat beide eerder ontdekt en nieuwe doelen kunnen worden geïsoleerd van de MISSION Target ID Library. Hoewel het protocol van enige lengte,het gebruik van de Target ID bibliotheek moet een standaard moleculaire lab technieken - zoogdiercellen cultuur, transfectie, drugs-selectie, PCR en sequencing - en daarom moet goed van de mogelijkheden van de meeste biologen. Wij stellen voor dat voldoende aandacht wordt besteed aan een goede opzet van het experiment, het optimaliseren van kweekomstandigheden, en vooral, pre-testen van elk nieuw type cel optimaal geneesmiddel te bepalen voor de selectie stappen (kill-curves) naar succes met de Target ID Bibliotheek te garanderen. Zoals bij alle miRNA target identificatie methoden, is het sterk aanbevolen om doelstellingen die zijn geformuleerd screening van de Target ID Library worden gevalideerd met een tweede methode, zoals microarray, qRT-PCR, reporter assay (dat wil zeggen, luciferase), of West-analyse.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute zoogdieren Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Specifieke Nucleofectie khet </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocine </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Target ID Bibliotheek </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genoom-brede scherm voor mirna doelen met behulp van de mission target id bibliotheek

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

De Target ID bibliotheek is ontworpen om te helpen bij ontdekking en identificatie van microRNA (miRNA) doelstellingen. De Target ID Library is een plasmide-gebaseerde, genoom-brede cDNA-bibliotheek gekloneerd in de 3&#39;UTR stroomafwaarts van de dual-selectie fusie-eiwit, thymidinekinase-zeocine (TKzeo). De eerste ronde van selectie is voor een stabiele transformanten, gevolgd met de introductie van een miRNA van belang, en ten slotte, het selecteren van cDNA&#39;s met de miRNA&#39;s doel. Geselecteerde cDNA&#39;s worden geïdentificeerd door sequencing (zie Figuur 1-3 voor Target ID Bibliotheek Workflow en details). Om brede dekking van het menselijk transcriptoom te garanderen, werden Target ID Bibliotheek cDNA&#39;s gegenereerd via oligo-dT priming het gebruik van een pool van totaal RNA bereid uit meerdere menselijke weefsels en cellijnen. Resulterende cDNA van 0,5 tot 4 kb, met een gemiddelde grootte van 1,2 kb en werden gekloneerd in de p3TKzeo dubbele selectie plasmide (zie figuur 4 voor plasmide kaart). Het gen doelen weergegeven in de litheek is te vinden op de Sigma-Aldrich webpagina. Resultaten van Illumina sequentie (tabel 3) blijkt dat de bibliotheek 16922 van 21.518 unieke genen in UCSC RefGene (79%) of 14.000 genen met 10 of meer staat (66%) omvat.

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

De Target ID Library is ontworpen om te helpen bij de ontdekking en identificatie van microRNA (miRNA)-targets. De Target ID Library is een plasmide-gebaseerde, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het uitvoeren van een high-throughput genoombrede screening van micro-RNA-targets met behulp van de target ID-bibliotheek. Dit wordt bereikt door celtransfectie met het bibliotheekplasmide. Na de transfectie van een genoombrede collectie gekloonde cDNA's volgt selectie op stabiele cellijnen.De gevestigde bibliotheekcellen worden vervolgens getransfecteerd met het micro RNA-expressieconstruct om co-expressie van het micro RNA-doelwit en thymidinekinase mogelijk te maken. Op dit punt wordt ganciclovir gebruikt om cellen te selecteren die specifieke micro RNA-doelwitten tot expressie brengen, door selectie tegen de expressie van thymidinekinase. De CD NA die de micro RNA-doelwitplaatsen bevatten, worden vervolgens PCR-geamplificeerd met behulp van de target ID-amplificatieprimers om de micro RNA-bibliotheekdoelwitten te sequensen en te identificeren.Uiteindelijk worden resultaten verkregen waarmee specifieke micro RNA-doelen in cellen worden geïdentificeerd op basis van deep sequencing-analyse. De mission target ID-bibliotheek is ontworpen om te helpen bij de ontdekking en identificatie van gentargets voor micro RNA. Hier demonstreren wij het gebruik en de toepassing ervan.Kies vóór de start van dit protocol een cellijn die de betreffende IRA niet of in lage mate tot expressie brengt, kweek deze en breid de cellen uit om ongeveer 2 × 10⁷ cellen bij 80% confluentie te verkrijgen. Na trypsinering worden de cellen overgebracht naar een steriele schroefdopbuis van 15 ml en worden de getrypsiniseerde cellen gepelletteerd bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Na verwijdering van het medium wordt de celpellet geresuspendeerd om te wassen; centrifugeer de cellen opnieuw en herhaal de wasstap een tweede keer.Bereid ondertussen voldoende 0,5 milliliter buisjes voor voor het aantal transfecties door twee microgram van de doel-ID-bibliotheek aan elk buisje toe te voegen. Resuspendeer nu het celpellet in het 15 milliliter buisje met behulp van 600 microliters maxim Nucle affection-oplossing per transfectie. Voer dit uit voor één reactie tegelijk.Voeg 100 µL cellen toe aan het aliquot en twee µg plasmide, en meng dit met de pipetpunt. Breng elk mengsel over naar een nuclear effector vete. Plaats één vete in het nuclear effector-instrument en voer een geoptimaliseerd programma uit dat geschikt is voor de gebruikte cellijn.Vul vervolgens een transferpipet met voorverwarmd medium. Neem de getransfecteerde cellen op met dezelfde pipet en breng deze over naar een enkele put van een eerder geprepareerde zes-puts plaat. Herhaal dit proces voor elke NU nucleaire affectie na de NU nucleaire affectie.Plaats de cellen terug in de groeikamer voor een incubatie gedurende de nacht tot de volgende dag. Vervang het medium en laat de cellen drie tot vijf dagen herstellen. Zodra de cellen zijn hersteld, wordt het medium verwijderd en wordt volledig medium toegevoegd met de juiste concentratie eosine om te selecteren op stabiele integratie en expressie van het TKZO-fusieprotein.De eosineconcentratie kan vooraf worden bepaald zoals beschreven in de tekst. Controleer de cellen op eosineselectie via de celviabiliteit. Vervang het medium elke twee tot drie dagen door vers medium dat eosine bevat.Zodra de cellen in de zeswellsplaat confluent zijn, worden ze overgezet en uitgebreid naar grotere kolfjes. Er wordt een kill curve-analyse uitgevoerd om de minimale letale dosis vast te stellen voor de selectiereagentia die in de studie worden gebruikt. Om ongewenste fenotypische reacties te voorkomen, worden de cellen voor het uitvoeren van de kill curves eerst geplaatst in elke put van een 96-wellsplaat die 120 µL vers medium bevat; de analyse vindt de volgende dag plaats.Voeg het geneesmiddel toe aan de geselecteerde wells. Antibiotica G four 18 of pure mycin worden gebruikt voor selectie op integratie van het mirna-expressieconstruct, of acyclovir wordt gebruikt voor selectie tegen thymidinekinase-expressie. Controleer tijdens de incubatie elke twee dagen de celviabiliteit voor elke drugconcentratie. Vervang het medium dat het selectiereagens bevat elke drie dagen.Nadat de drugconcentraties zijn bepaald, moet voor dat celtype en experiment de minimale concentratie selectiereagens worden gebruikt die na de gewenste tijd volledige celdood veroorzaakt. Bereid een transfectie voor MI voor door de target ID Library-cellen te kweken en uit te breiden tot twee keer 10⁷ cellen. Trypsiniseer wanneer de cellen een confluentie van meer dan 80% hebben.Breng de cellen over naar een steriele schroefbuis van 15 milliliter en centrifugeer deze bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het medium en was het celpellet tweemaal zoals voorheen. Voeg vervolgens voor elke transfectie twee microgram van het MIRA-expressieplasmide toe aan een buisje van 0,5 milliliter.Voer de nucleaire infectie van het mRNA in de bibliotheekcellen uit met dezelfde methode die werd gebruikt voor de transfectie van de target ID-bibliotheek. Nadat de cellen drie tot vijf dagen hebben kunnen herstellen, wordt het medium vervangen door compleet medium met het juiste antibioticaniveau, zoals bepaald op basis van de kill curve-test.Controleer de cellen op antibioticaselectie en vervang het medium elke twee tot drie dagen door medium dat het antibioticum bevat. Zodra de cellen in de zes-wellsplaat confluent zijn, wordt de pool gepasseerd en worden de cellen uitgebreid naar grotere kolfjes. Vervang, zoals voorheen, het medium door vers medium met de juiste concentraties GCV en antibioticum.Controleer de cellen op thymidinekinase-expressie en mRNA-expressie via de celviabiliteit en breid de overlevende cellen uit in de aanwezigheid van GCV en antibiotica. Bereid vervolgens genomisch DNA voor uit de GCV-geselecteerde cellen. Amplificeer de geselecteerde library-inserts via PCR met kit-primers en subcloneer deze zoals beschreven in het schriftelijke protocol.Sequentiereacties kunnen vervolgens worden uitgevoerd met amplificatieprimers. Identificeer in een laatste stap de gentargets door blast-alignment van sequenties met het menselijke transcriptoom voor bekende transcripten en het menselijke genoom voor nieuwe transcripten. Een mere 3 73-expressieconstruct werd stabiel getransfecteerd in de MC zeven-bibliotheek en geselecteerd in medium met ganciclovir om cellen die mere 3 73-targets tot expressie brengen te verrijken.GCV heeft geen effect op MCF seven-cellen zonder bibliotheek omdat deze geen thymidinekinase tot expressie brengen. Aan de andere kant brengen C seven-bibliotheekcellen wel thymidinekinase tot expressie, maar worden ze niet volledig gedood door ganciclovir bij 8 of 16 µM, zoals blijkt uit de opname van brilliant blue door de levende cellen. De bibliotheekcellen stoppen echter wel met groeien in GCV, zoals blijkt uit de kleur van de fenolrood-kleurstof in hun medium.De gearresteerde cellen verzuren hun medium niet en de kleur blijft roodachtig. In plaats van te veranderen naar oranje, werden gele doelsequenties geïsoleerd uit de overlevende cellen. Deze werden via PCR geamplificeerd en gesequenced.Er werden bijna 12 miljoen cDNA-reads verkregen die toegewezen konden worden aan bijna 12.000 unieke genen. Van deze unieke genen werden er 234 als betrouwbare hits beschouwd op basis van de hitfrequentie, en deze waren specifiek voor mere 3 73. Een eerste vergelijking wees uit dat 10 van de unieke genen die met de target-ID-bibliotheek zijn geïdentificeerd, ook voorkomen in de lijst met eerder geïdentificeerde mere 3 73-targets in TarBase.Daarom zijn deze 10 waarschijnlijk valide targets van mere 3 73 en worden ze momenteel gekarakteriseerd om geselecteerde hits experimenteel te valideren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de mission target ID-bibliotheek kan worden gebruikt om een high-throughput genoombrede screening uit te voeren naar micro RNA-gentargets.

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier gebruiken we een menselijke esiRNA bibliotheek in een high-throughput screen voor genen die betrokken zijn bij de celdeling. Laten we zien hoe het opzetten en uitvoeren een esiRNA schermen, en hoe te analyseren en valideren van de resultaten.

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

MicroRNA (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie en is aangetoond dat een rol spelen bij talrijke biologische processen. Om beter te begrijpen miRNA-UTR interacties, hebben we een genoom-brede collectie van drie UTR luciferase reporters gepaard met een nieuw luciferase gen en assay reagens, het LightSwitch systeem.

Het identificeren van doelen van Human microRNA&#39;s met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3&#39;UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Luminofore identificatie van functionele elementen in 3’ niet-getransleerde gebieden (3’UTR's) (3’LIFE) is een techniek om functionele regulatie in 3’UTR's door miRNA's of andere regulerende factoren te identificeren. Dit protocol maakt gebruik van high-throughput methodologie zoals 96-well transfectie en luciferase assays om honderden vermeende interacties voor functionele repressie te screenen.

Detectie van miRNA Doelen in High-throughput Met de 3&#39;LIFE Assay

Het identificeren van nieuwe geneesmiddeldoelen die overgaan van preklinisch onderzoek naar menselijke proeven is een wetenschappelijke prioriteit. Daartoe beschrijven we hier een functionele genoombenadering voor het onderzoeken van de impact van gendepletie op kankerstamlijnsferoïden, die menselijke kankers beter modelleren in vivo.

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.

Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Hierin presenteren we een nieuwe en volledig geautomatiseerde miRNA-pijplijn, mirMachine die 1) bekende en nieuwe miRNA's nauwkeuriger kan identificeren en 2) volledig geautomatiseerd en vrij beschikbaar is. Gebruikers kunnen nu een kort indieningsscript uitvoeren om de volledig geautomatiseerde mirMachine-pijplijn uit te voeren.

mirMachine: een one-stop-shop voor miRNA-annotatie van planten

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer hoe je een genoom-brede screen uitvoert voor miRNA-doelen met behulp van de MISSION Target ID-bibliotheek. Deze methode maakt identificatie van micro RNA-targets mogelijk via celtransfectie en selectie met ganciclovir.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

Meer video's verkennen