Name: Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer genoombewerking met CompoZr ZFNs voor het creëren van knock-out cellijnen via gerichte mutaties. Deze methode biedt precisie en reproduceerbaarheid voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Custom ZFN ontwerpproces <ol><li> Om de ZFN ontwerp-proces te versnellen, moet een onderzoeker te bieden: </li><ul><li> Informatie over de target-gen, zoals het gen naam, soort, en gen annotatie / identificatienummer. </li><li> Een duidelijk vermeld over-all doel van het experiment (bijvoorbeeld Knockout of Knockin) </li><li> Een factoren van het gen doel dat atypische genstructuur bijzondere biologie betrokken bij de genetische locus of een homologe gebieden elders in het genoom bevatten. </li><li> De specifieke bereik van DNA-sequentie voor de zinkvinger nucleasen te richten op. </li></ul><li> De Sigma bioinformatica team voert in silico ZFN ontwerp tot de ontwikkeling van de eerste zinkvinger doelsites. </li><li> Eerste ZFN doelsites worden geleverd aan een ZFN wetenschappelijke technisch consultant. Voor meer technisch complexe projecten, is dit Sigma wetenschapper werkt samen met de onderzoekers de ontwikkeling van de project strategie. </li><li de sigma bio-informatica-team voert een analyse met zfn algoritmes voor het genereren van in silico ontwerpen. dit omvat hele genoom zoeken off-target sites herhaal maskers en snp-analyse elke potenti doelplaats.><li> Bio-informatica biedt de top ZFN doel sites om de onderzoeker voor de beoordeling. Na goedkeuring van de potentiële ZFN doelplaatsen, wordt deze informatie verstrekt aan de ZFN Production team om de ZFN productieproces beginnen. </li></ol> 2. Aangepast ZFN Productie <ol><li> De Sigma archief van zinkvinger modules wordt gebruikt om de goedgekeurde ZFN ontwerpen monteren. </li><li> Elke ZFN ontwerp wordt gemonteerd en de volgorde gecontroleerd op een high throughput klonen platform. </li><li> Zodra de productie van alle ZFN ontwerpen voltooid is, elke ZFN wordt verzonden naar validatie. </li></ol> 3. Validatie van Custom ZFNs <ol><li> ZFN projecten inmens, muis, rat of CHO soorten worden gevalideerd in goed gekarakteriseerde cellijnen voor elke soort, is een gist gebaseerde test gebruikt worden voor andere organismen of celtypen. </li><li> ZFN constructen worden geleverd in de juiste cellijn door nucleofectie en de ZFNs worden uitgedrukt. </li><li> DNA wordt geoogst uit de pool van ZFN getransfecteerde cellen en de regio van belang is PCR versterkt. </li><li> De Cel-1 test wordt uitgevoerd op het PCR-product. Gel elektroforese wordt uitgevoerd op de Cel-1-test tot gevalideerde ZFN activiteit. </li><li> De hoogste activiteit ZFN ontwerp zoals bevestigd door de Cel-1-test wordt vervolgens aan de klant verstrekt. ZFNs worden in mRNA en plasmide DNA met PCR-primers voor de Cel-1 assay en genomisch DNA als een positieve controle. </li></ol> 4. Levering van gevalideerde ZFNs door Nucleofectie <ol><li> Zaad de cellen een dichtheid van 2x10 cellen 5 / ml dag voor nucleofectie. </li><li> Op de dag van nucleofectie,nemen cellijn Nucleofector Kit V en laat warm tot kamertemperatuur. </li><li> Voeg de aanvulling op de Nucleofectie Solution V volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Tel de cellen. Celdichtheid moet tussen 2,5 5x10 5 cellen / ml. </li><li> Vul een 6-wells plaat met 2 ml medium in elk putje voorverwarmen in een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 20 minuten voor nucleofectie. </li><li> Centrifugeer 2x10 6 cellen per transfectie (8x10 6 in totaal) op 200xg gedurende 5 minuten. </li><li> Tweemaal wassen cellen met 20 ml Balanced Salt Solution Hank's (HBSS). </li><li> Bereid experimentele buizen: (zie tabel in Custom ZFN technische bulletin) </li><li> Verwijder de 6-wells plaat met daarin media van stap (6,5) van de incubator. </li><li> Resuspenderen cellen in 400 ul (100 ul / reactie) van Nucleofectie Solution V. </li><li> Een reactie tegelijk worden 100 pi cellen elke DNA of mRNA bevattende buis. TransfER het mengsel in een 2 mm elektroporatie cuvette en nucleofect op een Nucleofector met het juiste programma. </li><li> Onmiddellijk na nucleofectie van elk monster, gebruikt een transferpipet ~ 500 ul medium toegevoegd voorverwarmde van de 6-wells plaat in stap (6.9) van de cuvet. Vervolgens voorzichtig overbrengen cellen van de cuvet van de resterende voorverwarmde medium in de 6-wells plaat. </li><li> Werk alle reacties en geeft het 6-well plaat de CO2 incubator bij 37 ° C. </li></ol> 5. Oogsten Genomic DNA na Levering van ZFNs <ol><li> 6-wells plaat - niet oogsten alle gepoolde cellen. Het is belangrijk om de cultuur te behouden om cellen om enkele cel verdunning kloon hebben na bevestigt u dat u Cel-1 spijsvertering producten. Een tot drie dagen na het verzamelen nucleofectie de cellen chromosomaal DNA voor te bereiden met behulp van de GenElute zoogdieren Genomic DNA Miniprep Kit. </li></ol> 6. Cel-1-test <li> PCR versterken het genomisch DNA van de ZFN getransfecteerde monsters en de positieve controle genomisch DNA die in de kit, met behulp van de meegeleverde primers. De PCR-reactie is ingesteld met de volgende voorwaarden: (zie tabel in Custom ZFN technische bulletin). </li><li> Om heteroduplexen van de PCR-homoduplexes genereren neemt 10 pi PCR-reactie van elk ZFN behandelde monster plus de controle en gebruik de volgende programma op een thermocycler: 95 ° C, 10 minuten 95 ° C tot 85 ° C, 2 ° C / seconde 85 ° C tot 25 ° C -0,1 ° C / seconde 4 ° C, voor onbepaalde tijd </li><li> Voeg 1 pi enhancer en 1 pi Nuclease S (van Transgenomic catalogusnummer 706025) aan elk reactievat en incuberen bij 42 ° C gedurende 20-40 minuten. </li><li> Voer de vertering op een 10% PAGE-TBE gel met de juiste markeringen, zoals DirectLoad widerange DNA Ladder (catalogusnummer D7058) (zie resultaten in Custom ZFN technische bulletin). </li><li> Opce positief signaal is aangetroffen in ZFN behandelde populaties door de cel-I bepaling, ga dan naar klonale isolatie en karakterisering. </li> 7. Klonale Isolatie en karakterisering <ol><li> Single-cell kloon van de ZFN behandelde monsters door middel van standaard methoden, met inbegrip FACS en verdunning klonen. </li><li> Laat het klonen voldoende vervolgens uit te breiden, wat deel van de cellen te splitsen voor genomisch DNA oogst, het bevriezen terug de rest als dwarshelling materiaal. </li><li> Amplify genomisch DNA van de klonen met behulp van de Cel-I primers en de amplicon door de Cel-I test (met en zonder WT DNA verrijkt in) te analyseren, of gebruik dit amplicon rechtstreeks naar genotypering. </li><li> Genotype kandidaat-klonen geïdentificeerd als zijnde bewerkt allelen door de voorkeur. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Een voorbeeld van de volledige CompoZr ZFN werkstroom in figuur 2. ZFNs worden geleverdom cellen waar binden en klieven geschikte DNA sequentie die een dubbelstrengs onderbreking (DSB) maakt. Het natuurlijke herstelproces, niet-homologe eind mee (NHEJ), herstelt de DSB. In sommige gevallen afwijkende NHEJ resulteert in een deletie, insertie of substitutie van nucleotiden. PCR amplificatie van de geoogste genomisch DNA resultaten heteroduplex vorming van wild type en aangepast amplicons na de denaturatiestap / hybridisatie stap van de PCR-reactie. Toevoeging van de Cel-1-enzym resulteert in een splitsing van heteroduplex moleculen. Cel-1 resultaten worden opgelost door PAGE-analyse te ZFN decollete te bevestigen. Figuur 3 geeft een schematische weergave van de Cel-1-test en de verwachte resultaten. Representatieve Cel-1 resultaten zijn opgenomen in figuren 4 en 5 figuur 4 bevat de resultaten van een zeer actieve paar ZFNs (21%) in K562 cellen. Figuur 5 bevat de resultaten van een minder actieve paar (2,4%) in ZFNsK562 cellen. ZFN activiteit bevestigd in beide figuren van de aanwezigheid van twee PCR-fragmenten onder de ouderlijke PCR fragment. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vertegenwoordiging gebonden zinkvinger nucleasen. ZFNs zijn ontworpen eiwitten uit een zinkvinger DNA-bindende domein gefuseerd aan de splitsing domein van de Foki restrictie-endonuclease. Wanneer gebonden als heterodimeer ZFNs een dubbelstrengs onderbreking een gebruiker bepaalde DNA-sequentie. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schematische voorstelling van de Custom ZFN Dienst Workflow. Grafische weergave van de workflow van een genetisch gemodificeerde cellijn door het gebruik CompoZr ZFNs te genereren. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Schematische voorstelling van de Cel-1 test en de resultaten. A) ZFN plasmide o r mRNA wordt aan cellen. B) Uitgedrukt ZFNs binden en snijden de doelsequentie om een ​​dubbelstrengs onderbreking (DSB) in een deel van cellen. C) afwijkend herstel van ongeveer DSB door niet-homologe eind verbinden resulteert in nucleotide insertie of deletie. D) Genomisch DNA wordt gewonnen uit de getransfecteerde verzameling van cellen en versterkt de locus van belang. EF) PCR-product wordt gedenatureerd en opnieuw gegloeid het creëren van heteroduplex vorming van wild type en gewijzigd amplicons. G) Cel-1 mismatch endonuclease testresultaten in splitsing van heteroduplex moleculen. H) Cel-1 enzym verteert worden opgelost door PAGE. De waargenomen verhouding gekliefd product parenterale band, bepaald door ImageJ software blijkt de fractie gesneden en efficiëntie van de ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Cel-1 resultaten van 21% actief ZFNs ImageJ software is te vinden op.:_blank "&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Cel-1 het gevolg is van 2,4% actieve ZFNs ImageJ software is beschikbaar op:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

<ol><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022(2010).</li>
<li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433(2009).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li>
<li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li>
<li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li>
</ol>

Onderzoekers kunnen ZFN gemodificeerde cellen of dieren aan medewerkers onder de standaard voor onderzoek License Agreement. In dit geval Sigma vraagt ​​dat een inzake overdracht van materiaal wordt gebracht tussen Sigma, de ZFN klant en de medewerker. De licentieovereenkomst voor onderzoek kan worden bekeken op: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Als er een potentieel voor een commerciële toepassing met behulp van ZFN gemodificeerde cellen Sigma dan vraagt ​​dat een commerciële licentie wordt ingevoerd. Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Sigma, Inc

Zodra ZFN-gemodificeerde cellen worden geïsoleerd ze permanent te hebben en erfelijke DNA-wijzigingen. Dit resulteert in het vermogen om stabiel gemodificeerde cellijnen of ras dieren gewenste genetische modificaties genereren onderzoek. CompoZr maat ZFNs een stevige werkwijze voor genoom bewerking in een grote verscheidenheid van celtypen. Publicatie van de succesvolle genoom bewerken met ZFNs omvat, maar is niet beperkt tot menselijke cellijnen, muis, rat, zebravis, kikker, varkens en CHO onderzoeksmodellen. 3,4,5,6,7,8,9 De mogelijkheid om een te creëren dubbelstrengs onderbreking op de gewenste doelgebied in het opgegeven celtype wordt gegarandeerd wanneer de ZFNs goed geleverd in een cel. Het is ook mogelijk om sequentiële zinkvinger wijzigingen uit te voeren om een cel in om meer dan een genetische modificatie hebben binnen een cel. 10 De mogelijkheid om een specifieke doelgroep volgorde te selecteren en alleen te wijzigen dat bepaalde locus is een primaire oorzaak voor de mogelijkheid om meerdere te creëren modificatieskationen. De CompoZr Custom ZFN certificaat van analyse wordt gegenereerd met de zeer reagentia die in de kit dus zorgen dat alle componenten van de kit grondig zijn gevalideerd voor succes van de klant. Kritische stappen van de workflow van begin tot eind worden hieronder weergegeven: Cell klonen De mogelijkheid om te isoleren en uit te breiden een bepaalde cellijn moet worden getest voor het begin van elke ZFN experimenten. Enkele cellen worden geïsoleerd en uitgebreid zodat een klonaal afgeleide populatie mogelijk is. Sommige cellijnen zijn recalcitrante in deze kwestie, en trucs, zoals verrijking voor bewerkte klonen, of cultuur met geconditioneerde media kan helpen om deze uitdagingen te overwinnen. Levering efficiëntie Optimalisatie van levering efficiëntie is een must voor de levering van de ZFNs. Vele werkwijzen kunnen worden toegepast met inbegrip lipide gebaseerde transfectiesystemen, elektroporatie en nucleofectiop. De ideale levering methode bestaat uit een die de meest optimale mix van levering efficiëntie en de overleving van de cel biedt. Kwantificeren van deze efficiëntie kan worden geschat door het leveren van een GFP controle plasmide en kwantificeren door visuele inspectie of FACS 24-48u na de levering. Cel-I bepaling Het is noodzakelijk dat Cel-I test wordt uitgevoerd in parallel met de nodige controles om ervoor te zorgen dat de PCR, de spijsvertering, en elektroforese parameters niet zal bemoeien met de interpretatie van ZFN experiment. Elk pakket omvat de controle genomisch DNA dat wordt gebruikt om de Cel-I beeld in het certificaat van onderzoek te creëren. Versterking van de controle-DNA met de meegeleverde primers, gevolgd door Cel-I-test kan de gebruiker om de resultaten te vergelijken met die welke in de Certificate of Analysis (BvL) beeld, en isoleer eventuele inefficiënties in dit aspect van een experiment. Een passende negatieve controle, zoals een mock, of GFP behandeld celmonster mogelijk te toelichting van een niet-specifieke splitsing mogelijk te maken. Kwalitatieve / Kwantitatieve analyse van single-cell klonen Na ZFN behandeling cel klonen kunnen populaties van cellen worden gescreend voor het bewerken van de locus van belang door een aantal methoden. Cel-I bepaling kan worden uitgevoerd op genomisch DNA van klonen voor het identificeren van kandidaat-klonen voor verdere genotypering. Het is belangrijk spike WT PCR amplicon in het monster amplicons een 1:1 verhouding voordat de Cel-I verteren als homozygote mutant klonen bevatten homogene moleculen, dus brengen negatieve Cel-I assay resultaat. Een alternatieve methode voor het screenen van deze kandidaat klonen een PCR primer landing ontwerpen rechtstreeks op de ZFN doelplaats. In combinatie met een van de besturingszones primers, een negatieve test resultaat geeft verlies van WT sequentie. Een heterozygote kloon die ten minste een allel WT ygewasopbrengst PCR-signaal, maar kan worden gescheiden van volledig WT klonen door het uitvoeren van de PCR in het kader van SYBR qPCR. Zodra kandidaat klonen zijn geïdentificeerd door de bovenstaande werkwijzen, kunnen zij worden getypeerd door standaard pyrosequencing, diepe sequencing of andere sequentie methoden. Voor sequentie methoden moet een amplicon gemaakt van de genomische DNA klonen gegenereerd. Voor traditionele pyrosequencing allelen kan worden gescheiden door TA-klonen van de PCR-product, en de volgorde van de individuele kolonies. Voor de methoden zoals diep sequentie deze stap is niet nodig. Homologie Directed Repair (HDR) Dit protocol biedt de methode voor ZFN gemedieerde gen knock-out via NHEJ. De integratie van transgenen kan ook worden uitgevoerd door invoering van een donor plasmide met homologie armen die flank een ZFN cut site. 11 In dit scenario, de ZFN gemaakt dubbelstrengs breuk wordt hersteld door HDR in plaats van NHEJ. HDR gericht integration van transgenen kan worden bevestigd met vergelijkbare methoden om de procedures die in dit protocol. Problemen oplossen Levering van ZFNs ZFN levering en expressie-levering kan worden gecontroleerd door levering van een GFP of andere dergelijke plasmide voor visualisatie en / of kwantificering. Lage expressie door promoter onverenigbaarheid met het celtype van belang kunnen worden overwonnen door aflevering van ZFNs in mRNA formaat. Bovendien kan de koude schokmethode worden gebruikt om verdere verhoging van de effectiviteit van ZFNs in cellen. MRNA 12 Als wordt gebruikt is het noodzakelijk dat cellen voor gewassen te leveren zodat alle serum-afgeleid RNAses zijn verwijderd. Ook is het goed de mRNA op ijs ontdooien en de toe te voegen aan de cellen op het laatste moment een kans op aantasting minimaliseren. Cel-I bepaling De oprichting van de Cel-I ASSAy is specifiek en voldoende versterking van het locus van belang. Als niet-specifieke amplificatie producten worden waargenomen gebruik maken van standaard PCR het oplossen van problemen om de specificiteit zoals de optimalisering van template bedrag, primer concentratie, en fietsen parameters te verhogen. Voer PAGE analyse tegenover standaard agarose electroforese deze methode niet voldoende resolutie en de gevoeligheid. Cel-I digest voorwaarden kan ook worden geoptimaliseerd als er geen verteerd product of overmatig smeren wordt waargenomen. Titratie van de hoeveelheid Cel-1 nuclease en / of lengte van de spijsvertering tijd kan worden getitreerd om deze aspecten te verbeteren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Nuclease S (Cel-1 Enzyme) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expand High Fidelity PCR-systeem </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Cell Line Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP Endotoxine-Free Plasmide Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genoom bewerken met compozr custom zinc finger nucleasen (zfns)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genoom bewerken is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om genfunctie en de genetische basis van ziekte te verduidelijken. Traditionele gen het bewerken van methoden, zoals de chemische-based mutagenese of random integratie van DNA-sequenties kennen willekeurige genetische veranderingen in een algemeen inefficiënte manier en vereisen integratie van ongewenste synthetische sequenties of het gebruik van afwijkende cultuur voorwaarden, mogelijk verwarrende biologische studie. Daarentegen kan kortstondige ZFN expressie in een cel het nauwkeurig, erfelijke gen bewerking op zeer efficiënte wijze zonder toediening van stoffen of integratie van synthetische transgenen. Zinkvinger nucleasen (ZFNs) zijn enzymen die binden en snijd verschillende sequenties van dubbelstrengs DNA (dsDNA). Een functionele CompoZr ZFN unit bestaat uit twee individuele monomere proteïnen die een DNA &quot;half-site&quot; binden van ongeveer 15 tot 18 nucleotiden (zie figuur 1). Wanneer twee ZFN monoMers &quot;home&quot; om hun aangrenzende doelsites het DNA-splitsing domeinen dimeriseren en maak een dubbelstrengs breuken (DSB) in het DNA. 1 Inleiding van ZFN-gemedieerde DSB&#39;s in het genoom legt een basis voor zeer efficiënte genoom bewerken. Imperfect reparatie van DSB&#39;s in een cel via de niet-homologe end-joining (NHEJ) DNA-reparatie-traject kan leiden tot kleine inserties en deleties (indels). Instelling van indels in het gen coderende sequentie van een cel kan leiden tot frameshift en vervolgens functionele knockout van een locus met genen hoog rendement. 2 Hoewel dit protocol beschrijft het gebruik van ZFNs een knockout maken integratie van transgenen ook via homologie-gericht reparatie bij de ZFN cut site. De CompoZr Custom ZFN service staat voor een systematische, uitgebreide en goed gekarakteriseerde aanpak voor gerichte gen-editing voor de wetenschappelijke gemeenschap met ZFN technologie. Sigma wetenschappers werken nauw samen met onderzoekers op 1) perform due diligence-onderzoek met inbegrip van analyse van relevante structuur van genen, biologie en model systeem op grond van de projectdoelen, 2) toepassing van deze kennis op een goede targeting strategie, 3 te ontwikkelen), dan ontwerpen, bouwen, en functioneel ZFNs te valideren voor de activiteit in een relevante cellijn. De onderzoeker ontvangt positieve controle genomisch DNA primers en klaar voor gebruik ZFN reagentia geleverd zowel plasmide DNA in vitro getranscribeerde mRNA formaat. Deze reagentia kunnen vervolgens worden geleverd voor transiënte expressie in de cel van de onderzoeker lijn of celtype van de keuze. Monsters worden vervolgens getest gen bewerking op de plaats van belang door standaard moleculair-biologische technieken zoals PCR amplificatie, enzymatische digest en elektroforese. Na een positief signaal voor gen-bewerking wordt gedetecteerd in de oorspronkelijke populatie, cellen zijn eencellige gekloond en gegenotypeerd voor de identificatie van mutant klonen / allelen.

De CompoZr Custom Zink-vinger Nuclease (ZFN) Service maakt een nauwkeurige genoom bewerken in een organisme of cel lijn op elk locus bepaald door de gebruiker. In dit artikel beschrijft het proces voor het ontwerp, de fabricage, validatie en implementatie van de CompoZr Custom ZFN Service.

Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs)

Genoomredigering is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om genfuncties en de genetische basis van ziekten te ontrafelen. Traditionele methoden voor genredigering zoals ...

Het algemene doel van deze procedure is het gebruik van een op maat gemaakte zinkvingernuclease of ZFN om een disruptieve mutatie op een specifieke locus te introduceren, om uiteindelijk een knockout-cellijn te creëren. Dit wordt bereikt door eerst de DNA-sequentie van het doelgen te analyseren met het composer-algoritme om in silico ZFN-ontwerpen te genereren. De ZFN's worden geassembleerd, via nucleaire affectie in cellen gebracht en gescreend op activiteit bij hun respectievelijke genetische doelplaatsen om een knockout-cellijn te genereren.Het celtype van belang wordt eerst behandeld met een actieve ZFN. Vervolgens wordt deze populatie gesegregeerd tot individuele cellen. Ten slotte worden deze clonale populaties uitgebreid voor verdere genotypische karakterisering. Klonen met disruptieve non-homologe end-joining-gebeurtenissen op de doellocatie kunnen verder worden bestudeerd in de context van functionele gene knockout.Uiteindelijk is genetische karakterisering, inclusief de cell one-assay en DNA-sequencing, noodzakelijk om de geobserveerde veranderingen in het cellulaire fenotype als gevolg van ZFN-gemedieerde genetische modificatie te bevestigen. Het belangrijkste voordeel van zinkvingernucleasen ten opzichte van bestaande methoden zoals traditionele homologe recombinatie is dat ZFN-gestuurde genbewerking onderzoekers in staat stelt om specifieke en voorspelbare genetische modificaties aan te brengen zonder selectie.Dit omvat gene knock-outs, genmodificaties en genintegraties. Het ZFN-ontwerpproces begint met vereenvoudigde bio-informatische studies, die zich richten op het identificeren van unieke sequentieregio's die voldoende aantal en kwaliteit zinkvinger-bindingsmotieven bevatten die gunstig zijn voor het uitvoeren van een gene knockout. Een duidelijk geformuleerde experimentele strategie zal dit proces aanzienlijk vergemakkelijken, evenals informatie over het doelgen, zoals een atypische genstructuur, specifieke biologie die betrokken is bij de genetische locus en eventuele homologe regio's elders in het genoom.Voor complexere projecten werkt een sigma-wetenschapper nauw samen met de onderzoekers. De ZFN's worden in silico ontworpen en de off-target sites in het gehele genoom worden voorspeld. Voor elke potentiële ZFN-targetsite worden daarnaast repeat-masking en snip-analyse uitgevoerd.De beste ZFN-doelplaatsen worden gecontroleerd vóór de productie van de ZFN's. Onderzoekers vragen zich vaak af of ZFN's geschikt zijn voor hun project. Om deze vraag zo goed mogelijk te beantwoorden, moeten we rekening houden met enkele belangrijke overwegingen.Kunt u efficiënt afleveren en een typische expressiecassette tot expressie brengen in uw celtype van belang? Kunt u enkelvoudige celklonen isoleren en vervolgens expanderen? En ten slotte, is er een nadelig effect op de celgroei of celviabiliteit als gevolg van het uitschakelen van uw gen van belang?De antwoorden op deze vragen kunnen de haalbaarheid van een project wel of niet strikt bepalen. Ze stellen ons echter wel in staat om in te schatten hoe eenvoudig of moeilijk een specifiek project kan zijn, of ze kunnen licht werpen op bepaalde aspecten van de workflow die cruciaal zijn voor het succes. Sigma gebruikt zijn archief van zinkvingermodules om de goedgekeurde ZFN-ontwerpen te assembleren.Elk ZFN-ontwerp wordt geassembleerd en sequentie-geverifieerd op een high-throughput kloningsplatform. Vervolgens worden de ZF NS in de vorm van plasmide-DNA afgeleverd aan de relevante, goed gekarakteriseerde cellijn, waar ze binnen 24 tot 48 uur voldoende tot expressie komen. Daarna wordt genomisch DNA geoogst uit elke pool van ZFN-behandelde cellen, gevolgd door PCR-amplificatie van de ZFN-doelplaats.Er wordt een cell one-assay uitgevoerd op de PCR-producten en de ZFN-activiteiten worden beoordeeld via gelelektroforese. Het ZFN-ontwerp met de hoogste activiteit wordt geleverd. Daarnaast wordt positieve controle-genomisch DNA verstrekt, samen met PCR-primers om de resultaten uit het analysecertificaat te reproduceren.Om uw ZFN-experiment te starten, begint u met het uitplaten van de cellen bij een dichtheid van 200 000 cellen per milliliter op de dag vóór de nucleofectie. Tel de volgende dag de cellen voordat u verdergaat. Als hun dichtheid tussen de 250 000 en 500 000 cellen per milliliter ligt, bereidt u de nucleofectie-oplossing voor de cellijn waarmee u werkt volgens het protocol van de fabrikant.Vul nu een six-wellplaat met twee milliliters medium per well en verwarm de plaat gedurende ten minste 20 minuten in een incubator. Centrifugeer 2 miljoen cellen per nucleofectie. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 10 milliliters HBSS. Herhaal vervolgens de wasprocedure nog één of twee keer. ZFN's geleverd in mRNA-formaat leveren doorgaans hogere genbewerkingsfrequenties op dan dezelfde ZFN's geleverd in plasmidaal DNA-formaat.Het afleveren van ZF NS in mRNA-formaat vereist echter dat we enkele extra voorzorgsmaatregelen nemen om degradatie te voorkomen. Was eerst uw cellen met twee tot drie grote volumes PBS of HBSS om serumafgeleide RNA's te verwijderen. Houd uw mRNA daarnaast gedurende het gehele experiment op ijs.Voeg tot slot het mRNA op het allerlaatste moment toe aan de cellen om degradatie te voorkomen. Bereid vervolgens de experimentele buisjes voor volgens de tabel in het specifieke ZFN-technisch bulletin. Resuspendeer voor elke transfectie de cellen in 100 µL nucleffectiesolutie V. Bereid telkens één reactie tegelijk.Voeg 100 µL cellen toe aan elke buis die DNA of mRNA bevat. Draag vervolgens elk mengsel over naar een electroporatiecuvet van twee millimeter. Behandel de cellen met het juiste programma direct na de nuclefectie van elk monster.Gebruik een transferpipet om een halve milliliter verwarmd medium uit een well van de voorbereide six-wellplaat toe te voegen. Breng de cellen voorzichtig vanuit de qve terug naar het resterende medium. Voltooi alle reacties in die well en plaats de plaat gedurende één tot drie dagen terug in de incubator.Isoleer na nucleofectie genomisch DNA met de genal loop mammalian genomic DNA mini prep kit zonder alle samengevoegde cellen te oogsten. Gebruik vervolgens de meegeleverde primers voor PCR om het genomisch DNA uit de ZFN-getransfecteerde monsters en het in de kit meegeleverde positieve controle-genomisch DNA te amplificeren.Verteer elk PCR-product met één µL enhancer en één µL nuclease s. Incubeer deze gedurende 20 tot 40 minuten bij 42 °C. Voer vervolgens de digesties uit op een 10% TBE-gel met geschikte markers, zoals een direct load wide range DNA ladder, nadat de met ZFN behandelde monsters via single-cell cloning zijn geïsoleerd en de klonen voldoende zijn uitgebreid.Oogst een deel van de cellen voor genomisch DNA, zet de kweek van de resterende cellen voort of vries deze in als reservemateriaal. Amplificeer het genomische DNA met behulp van de cell one primers en analyseer het product via de cell one assay, met en zonder toevoeging van wild-type amplicon in een verhouding van één-op-één. Gebruik dit amplicon alternatief om direct over te gaan tot genotypering van kandidaatklonen via sequencing of andere voorkeursmethoden.In dit voorbeeld werd de cell one-assay gebruikt om de activiteit van een paar ZF NS en K 5 62-cellen te schatten. De glan representeert de positieve controle en de Z-baan toont knipproducten; op basis van deze gegevens wordt de frequentie van mismatch-PCR-fragmenten geschat, waarbij de schatting van de ZF N-activiteit uitkwam op 21%, wat zeer hoog is. Hier tonen we de activiteit van een ander paar Z fns.Dit ZFN-paar was aanzienlijk minder actief dan het andere, maar nog steeds effectief. Naar schatting heeft het indels veroorzaakt in 2,4% van de celpopulatie. Enkele van de meer kritische parameters bij het werken met ZF X omvatten de optimalisatie van de aflevering en expressie in uw celtype.Door deze parameters te optimaliseren, kan men de hoeveelheid tijd en inspanning die nodig is om de gen-knock-out te isoleren, aanzienlijk verminderen. Clone Z fns vormen een zeer nauwkeurig instrument voor gerichte genoommodificatie wanneer ze correct en in de juiste context worden gebruikt. Ze kunnen wetenschappers een zeer snelle en efficiënte methode bieden voor het bestuderen van de biologie van vrijwel elk genproduct of elke signaalroute.

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique of zinc-finger nuclease-based genome editing in human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs can potentially be differentiated into various cell types, this technology is helpful for in vitro pathological and pharmacological studies in a patient-specific manner.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: A Technique for Modifying Genome in Human Pluripotent Stem Cells by Double-Stranded Homology Dependant Repair Mechanism

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Dit protocol beschrijft een aanpak om nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisembryo's te vergemakkelijken met behulp van CRISPR-Cas9-technologie. Een fenotyperingspijplijn wordt gepresenteerd om de toepasbaarheid van deze technieken aan te tonen om een long QT-syndroom-geassocieerde genvariant te modelleren.

CRISPR-Cas9-gemedieerde nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisharten

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

Leer genoombewerking met CompoZr ZFNs voor het creëren van knock-out cellijnen via gerichte mutaties. Deze methode biedt precisie en reproduceerbaarheid voor genetisch onderzoek.

Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs)

Meer video's verkennen