Name: MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer hoe je een LentiPlex shRNA-bibliotheek gebruikt voor positieve selectiescreening in zoogdiercellen. Deze methode identificeert genen die celoverleving bevorderen bij behandeling met therapeutische middelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MISSIE is een geregistreerd handelsmerk van Sigma-Aldrich Biotechnologie LP LentiPlex is een handelsmerk van Sigma-Aldrich Biotechnologie LP

LentiPlex Samengevoegde Scherminstelling Te identificeren shRNA sequenties van belang, is het essentieel om het scherm zodanig dat de meerderheid van de cellen ontvangen slechts een shRNA bouwen. Door het gebruik van een lage MOI (multipliciteit van infectie), is de kans van meerdere integranten per cel sterk verminderd. Echter, transductie efficiëntie, en dus de gewenste MOIS, sterk afhankelijk van de doelcel type. Daarom is het noodzakelijk dat de bepaling van de optimale MOI wordt uitgevoerd voordat het scherm in een nieuwe cel type. 1. Transductie van Target Cellen met de missie LentiPlex Pooled shRNA Bibliotheek <ol><li> De werkelijke MOI gebruikt zal variëren voor de verschillende celtypes. Indien repliceert gewenst zijn dan is het aantal platen moeten dienovereenkomstig worden verhoogd. Daarnaast, meestal is het niet voordelig zijn om de verschillende subpools combineren. Het bijhouden van de subpools elkaar te scheiden zal helpen bij de deconvolutie proces. Zorgen voor proper etikettering van elke weefselkweek schotel met het subpool nummer dat is toegepast tijdens transductie. Een lage MOI wordt geadviseerd om de waarschijnlijkheid van meerdere integranten per cel te verminderen. </li><li> Dag 1 - Seed het juiste aantal van 60-mm gerechten met genoeg cellen tot ~ 70% confluentie te verkrijgen over de volgende dag (10 zwembaden in totaal, elk in drievoud uitgevoerd = 30 gerechten in totaal). Voor onze studie werden 60 mm gerechten bezaaid met 6 x 105 A549 cellen tot een confluentie van 70% voorafgaand aan de transductie. Dit zorgt ervoor dat cellen nog in de exponentiële groeifase. Groeicijfers is afhankelijk van celtype en moet worden bepaald voordat het scherm. </li><li> Laat cellen om zich te houden door incubatie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5% CO 2. </li><li> (Optioneel) Inclusief twee extra 60-mm gerechten voor transductie met negatieve controle shRNAs. Het etiket van de gerechten "Control A" voor SHC001H en "Control B" voor SHC002H. </li><li> Dag 2 - transduceren ee-cellen met de LentiPlex virale deeltjes. Op de dag van transductie, dooi de lentivirale deeltjes op het ijs. </li><li> Breng de ontdooide deeltjes om een ​​laminaire stroming kap en blijf op het ijs als niet onmiddellijk wordt gebruikt. </li><li> Bereken hoeveel van elke individuele virale sub-pool toe te voegen aan de cellen naar de MOI van een te krijgen in alle celcultuur gerechten. <ol><li> Voorbeeld: 1 x 10 6 cellen / schaaltje; virale titer = 5 x 10 8 TU / ml; een gewenste MOI van 1. i.) 1 x 10 6 cellen / schaaltje x (MOI van 1) = 1 x 10 6 transducerende units (TU) nodig ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml), verkregen uit de C van A = 2 pi van lentivirale stockoplossing moet worden toegevoegd aan het juiste gerecht. Verdun de berekende hoeveelheid van het virus in 100-300 pi van complete media om een ​​betere spreiding van het virus wanneer toegevoegd aan de celkweek gerecht te verzekeren. </li></ol></li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de pre-geënte cellen. Voeg complete media containing hexadimethrine bromide oplossing voor elk gerecht. De aanbevolen uiteindelijke concentratie van hexadimethrine bromide in de media is 8 pg / ml. Gebruik minder hexadimethrine bromide als je het te giftig zijn voor uw doelgroep cellen. </li><li> Voeg shRNA lentivirale deeltjes passende gerechten in overeenstemming met de vooraf bepaalde experimentele opzet. Zwenk de platen aan het virus gelijkmatig verdelen over cellen. </li><li> Incubeer 18-20 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5% CO 2. </li><li> (Optioneel) Herhaal drie tot acht op de identieke MOI met SHC001H (lege vector shRNA Control) in Control Dish A en SHC002H (scrambled shRNA controle) in Control Dish B. identiek deze gerechten Behandel de experimentele gerechten gedurende het experiment. </li><li> Dag 3 - Verander de media. Aspireren virus-bevattende media en voeg verse compleet media (zonder hexadimethrine bromide). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende de nacht. </li></ol> 2. Behandel verguldecellen met therapeutische component / reagens <ol><li> Dag 4 - Zuig media van putten en voeg verse media met therapeutische component op de optimale concentratie. Net als bij kweekomstandigheden, zullen behandelingen variëren en de juiste concentraties en duur moet vooraf worden bepaald. In onze studie gebruikten we 100 ng / mL van TRAIL en 1 uM van paclitaxel. Cellen werden behandeld gedurende 48 uur. </li><li> Overlevende cellen opnieuw worden gezaaid in de T75 kolven en toegestaan ​​om uit te breiden tot bijna 100% confluent. </li><li> (Optioneel) Aan het einde van de selectie, te inspecteren Controle Schotel A en Control Schotel Schotel B. A en B, moet elke schotel minder kolonies dan ten minste een van de samengevoegde bibliotheek gerechten. Als er een onverwacht hoog aantal kolonies in Dish A, dan ofwel de transductie-proces heeft beïnvloed een weg met betrekking tot de gewenste fenotype of de selectieve druk is niet voldoende sterk en re-optimalisatie van de test kan worden verlangd. Als Dish B bevat te veel kolonies, Dan is de expressie van shRNA en de betrokkenheid van de RNAi pathway kan een effect hebben op het fenotype van belang. Als dit het geval is herhalen met SHC001H, om ervoor te zorgen dat het effect niet specifiek is voor SHC002H. </li></ol> 3. Deconvolutie van een polyklonaal celpopulatie <ol><li> Oogst de heterogene populatie van cellen van elk subpool en isoleren genomisch DNA. In ons onderzoek werden cellen kort gewassen in PBS en getrypsiniseerd voordat genomisch DNA werd geïsoleerd met behulp van de GenElute zoogdieren Genomic Miniprep kit en geleverd protocol (Sigma-Aldrich, G1N70). Als alternatief kan een andere genomische zuivering kits die momenteel beschikbaar zijn op de markt worden gebruikt voor DNA-isolatie. Het is belangrijk om aanbevelingen op te volgen protocol voor het basisbedrag van gekweekte cellen. </li><li> PCR-amplificatie van targets. De shRNA template recovery procedure maakt versterking van de gehele pool van shRNA inserts van de geselecteerde cel bevolking, of het ophalen van de individueledual shRNA sjablonen van kolonies die individueel werden geplukt en uitgebreid. Na de versterking van shRNA inserts van controle en geselecteerde doelcellen, kan de PCR-producten worden gesequenced. </li><li> Deze PCR-amplificatie stap werd geoptimaliseerd met behulp van Sigma Readymix, Catalog No P2893. Andere reagentia kunnen worden gebruikt voor versterking, maar de fiets-voorwaarden en / of magnesium concentratie moet mogelijk worden aangepast voor een succesvolle versterking. Amplificatieprimers bij de concentratie 20 mm zijn meegeleverd met de LentiPlex kit. </li><li> Het opzetten van de PCR-reactie zoals beschreven in Tabel 1. Voeg de componenten in de aangegeven volgorde. De beschreven bedragen zijn voor een 50 pi reactie. Voor meer reacties, schaal van de master mix componenten door het gewenste aantal reacties en inclusief 10% overmaat. De hoeveelheid DNA-template te raden is 50-100 ng. </li><li> Het wordt sterk aanbevolen dat voor een reactie van de template bestaat uit de MISSION shRNA Human positieve controle Vector verdund tot de approprIATE concentratie. Succesvolle versterking met deze sjabloon geeft aan dat de PCR-test componenten en fietsen omstandigheden adequaat zijn. LET OP: Om te voorkomen dat overdracht besmetting van experimentele monsters en reagentia, wordt gesuggereerd dat de positieve controle worden verdund in een andere locatie dan waar de volgende PCR-reacties zijn ingesteld. </li><li> Sla het PCR-programma vermeld in tabel 2 in uw thermocycler. </li><li> Voor elk monster, combineer drie pi PCR-reactie met een pi van kleurstof en electrophorese samen met 5 pi van DirectLoad ™ PCR-100 bp Low Ladder, Catalogusnummer D3687 op een 1% agarose gel om de aanwezigheid van een 309 bp amplicon te bevestigen. </li><li> Subklonering van PCR amplicons: PCR-producten werden TOPO gekloond met behulp van de TOPO-TA klonering kit, volgende protocol van de fabrikant (Invitrogen, K4575-01). Het resultaat is dat een PCR-product wordt opgenomen in elke vector. </li><li> 250 Individuele bacteriële kolonies (elk met een individuele PCR-amplicon) werden geïsoleerd en groeienn in 2 ml culturen van LB met 100 mg / ml ampicilline. Plasmide DNA werd vervolgens geëxtraheerd met behulp van de GenElute Plasmide Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Gezuiverde plasmide DNA werd geknipt met EcoRI en elektroforese om de aanwezigheid van de insert te bevestigen. </li><li> Plasmide DNA monsters werden vervolgens sequentie bepaald en de shRNA plaats geïdentificeerd met behulp van de LentiPlex shRNA Sequence Zoek databank die bij de LentiPlex bibliotheek. </li></ol> 4. Target identificatie en validatie <ol><li> De shRNA volgorde initieert met 5'-GAAACACCGG-3 '. Geef ten minste de komende tien, maar minder dan 21 nucleotiden als de query sequentie in het vak Zoeken op de meegeleverde shRNA Sequence Zoek Access-database te vormen. </li><li> Kies de soort van de gepoolde shRNA. Optioneel, selecteert u de subpool waarvan de sequentie werd gevonden. </li><li> Klik nu op "Zoek Potential Hits" knop om de zoekopdracht uit te voeren. Dit moet welke de overeenkomstige TRC shRNA sequentie (s) die overeenkomen met ee sequencing data. Meer informatie over de TRC shRNA sequentie (s) geïdentificeerd en de bijbehorende gen doelen kunnen gemakkelijk worden gevonden bij Sigma-Aldrich is jouw favoriete Gene: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Geïdentificeerde doelwitgenen dient te worden gevalideerd door het herhalen van de oorspronkelijke screeningstest met de originele TRC kloon vermeerderd met ten minste twee extra shRNAs dat hetzelfde gen met behulp van een een shRNA tot een goed format doel. Echte hits zullen weer hetzelfde fenotype in een meerderheid van de putten. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een LentiPlex gepoolde scherm workflow wordt gedetailleerd beschreven in figuur 1. Getransduceerde cellen die verspreidden zich in de aanwezigheid van TRAIL en Paclitaxel mochten om uit te breiden tot de flessen werden confluent. Genomic DNA werd geoogst en onderworpen aan de PCR-amplificatie en klonen zoals geïllustreerd in figuur 1 A, alvorens te worden ingediend voor sequencing en shRNA identificatie, zoals beschreven in FIGUre een C. 250 klonen werd de sequentie van deze 25 waren vertegenwoordigd door meerdere klonen en de overige 225 werden vertegenwoordigd door slechts een kloon en waren niet nagestreefd op dit moment. Zoals weergegeven in figuur 2, werden verscheidene kandidaat-genen waaronder TBX3, PPP2CA, en AKT2 vertegenwoordigd door meerdere klonen. De T-box transcriptiefactor, TBX3 verscheen in een totaal vier klonen en is betrokken bij tumor migratie 5. PPP2CA downregulatie is aangetoond dat de groei van LNCaP cellen gekweekt in androgeen gebrekkige omstandigheden te behouden door het verlichten van de androgeen-ontbering-geïnduceerde cel cyclus arrest en het voorkomen van apoptose 6. AKT2 is een EVC-bèta serine / threonine-proteïne kinase en vermeende oncogen aangetoond dat verschillende rollen te spelen in de ontwikkeling van kanker zeven, acht. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> * Definitieve concentratie van Mg 2 + in de oplossing zal 3 mm;1,5 mM is bijdrage van het Taq Readymix en 1,5 mm van de magnesium chloride-oplossing. Tabel 1. Lentiplex PCR-reactie-omstandigheden <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabel 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 2"> Tabel 2. Lentiplex PCR amplificatie Program <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Figuur 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1a"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Figuur 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1b"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Figuur 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1c"> Figuur 1. (A) LentiPlex gepoolde scherm (B) Polyklonale deconvolutie workflow, en (C) de identificatie van shRNA doelen. A. LentiPlex gepoolde scherm. Eerste Seed cellen vervolgens, shRNA subpools toe te voegen, (10 zwembaden in totaal, elk in drievoud uitgevoerd, voor 30 gerechten in totaal). Vervolgens behandelen met therapeutische component / reagens (in ons geval, TRAIL en Paclitaxel, respectievelijk). Dan, overlevende cellen reseed in flesjes en laat uit te breiden. Oogst heterogene populatie van cellen van elk subpool en isoleren genomisch DNA. B. Polyklonale deconvolutie. Voer PCR voor DNA dat de shRNA insert versterken. Het PCR-product is uniform in grootte, maar polyklonale in de juiste volgorde, omdat de template gDNA was ook polyklonale. PCR-product wordt gekloneerd in de vector en vervolgens getransformeerd in competente bacteriën. C. Identificatie van shRNA targets. Individuele kolonies worden geïsoleerd en plasmide DNA wordt gewonnen. Elke kloon bevat de kloneringsvector met een individuele PCR-fragment. Plasmide DNA wordt verteerd om de aanwezigheid van de insert en gesequenced bevestigen. De shRNA insert wordt geïdentificeerd met behulp van de LentiPlex shRNA Sequence Search database. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Geïdentificeerd kandidaat Genen. 25 kandidaat-genen geïdentificeerd die had meerdere hits. 225 kandidaat-genen had slechts een hit en werden niet voortgezet. Zie Aanvullende tabel 1 voor een overzicht van de individuele klonen per kandidaat gen. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Aanvullende Tabel 1. Individuele TRC Bibliotheek klonen geïdentificeerd uit Polyclonal Sequencing Gene ID Hits gedetecteerd Clones.

<ol><li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+vs.+shRNA%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li>
<li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li>
<li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li>
<li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li>
<li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF%2FTbx3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li>
<li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2%2C+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine%2Fthreonine+kinases%2C+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li>
<li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+and+Akt2%3A+differentiating+the+aktion%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li>
<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li>
<li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li>
</ol>

Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago, en John Swarthout zijn in dienst van Sigma-Aldrich, welke tools en reagentia gebruikt in dit artikel maakt.

In deze studie presenteren we een genoom-brede scherm om genen die betrokken zijn bij cytotoxiciteit van A549 cellen volgende paclitaxel / TRAIL behandeling te identificeren. Het gebruik van een gepoolde aanpak in een genoom-brede scherm vermindert de tijd, kosten en investeringen in outillage normaal geassocieerd met conventionele gehuld schermen. Cruciaal voor het succes van het scherm zijn optimalisatie van experimenten op voorhand uitgevoerd. Transductie voorwaarden en MOI moeten empirisch worden bepaald. De selectie methode moet het mogelijk maken voor robuuste selectie van cellen die de weergave van de gewenste fenotype (bijvoorbeeld, overleving, oppervlakte-eiwit expressie, enz.). Optimaliseren van deze parameters zal het aantal ontdekte valse positieven. Hier werd gDNA geoogst uit de totale populatie van de geselecteerde cellen en vervolgens TOPO gekloond om individuele shRNA inserts te identificeren. Een mogelijke verbetering voor dit experiment zou zijn geweest om te selecteren op levende cellen met behulp van FACS om ervoor te zorgendat alleen levende cellen worden verzameld. Aan de vastgestelde doelstellingen zullen worden gevalideerd door transductie met target-specifieke shRNAs in een screeningstest. Echte hits zullen weer het fenotype in een meerderheid van de putten. De LentiPlex Gepoolde Bibliotheek is flexibel in de toepassing ervan. Het is compatibel met een breed scala aan afgeleide toepassingen en kan worden gebruikt met een positieve of negatieve selectie strategieën. Afhankelijk van de screening voorwaarden, deconvolutie van de shRNA inserts wordt bereikt via PCR / klonen, microarray, of next-generation sequencing 9, 10. Terwijl de kracht en de snelheid van deze technieken om RNAi schermen deconvolute goed ingeburgerd is, een concern met microarray en next-generation sequencing methoden is de beschikbaarheid van bio-informatica middelen en kennis die nodig is om correct te analyseren en de experimentele resultaten te interpreteren. De kosten verbonden aan deze technieken kunnen vaak tijden worden een belemmering voor de onderneming van genoom-wijde schermen. APCR / klonen gebaseerde aanpak, terwijl het niet zo krachtig als microarrays en next-generation sequencing is een effectief en goedkoper alternatief. Agilent biedt nu een aangepaste reeks op basis van de TRC shRNA bibliotheek om verdere steun in LentiPlex schermen. Deze opties kunnen de onderzoekers om LentiPlex te gebruiken om een ​​breed scala van cellulaire functies te bestuderen.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex Samengevoegde Array</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> A549 cellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = nl &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute Plasmide Miniprep kit</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine bromide</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

missie lentiplex gepoolde shrna library screening in zoogdiercellen

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA-interferentie (RNAi) is een intrinsieke cellulair mechanisme voor de regulatie van genexpressie. Het aanwenden van de aangeboren kracht van dit systeem stelt ons in staat om knockdown genexpressie niveaus in het verlies van gen-functie studies. Er zijn twee belangrijke methoden voor het uitvoeren van RNAi. De eerste is het gebruik van kleine interfererende RNA&#39;s (siRNA&#39;s), die chemisch zijn gesynthetiseerd, en de tweede maakt gebruik van korte-hairpin RNA (shRNAs) gecodeerd in plasmiden 1. De laatste kan worden getransfecteerd in cellen die direct of verpakt in replicatie incompetent lentivirale deeltjes. De belangrijkste voordelen van het gebruik van lentivirale shRNAs is het gemak van binnenkomst in een grote verscheidenheid van celtypes, hun vermogen om stabiel te integreren in het genoom voor de lange termijn-gen knockdown en selectie, en hun effectiviteit in het uitvoeren van high-throughput verlies van functie schermen. Om dit te vergemakkelijken hebben we de LentiPlex gepoolde shRNA bibliotheek. Het MISSION LentiPlex Human shRNA Gepoolde Library is een genoom-brede geproduceerd met behulp van lentivirale zwembad een gepatenteerd proces. De bibliotheek bestaat uit meer dan 75.000 shRNA construeert uit de TRC-collectie richt 15.000 + menselijke genen 2. Elke bibliotheek is getest voor shRNA vertegenwoordiging voor product vrij te geven aan uitgebreide bibliotheek dekking te verzekeren. De bibliotheek wordt geleverd in een kant-en-klare lentivirale formaat met titers van ten minste 5 x 10 8 TU / ml via p24 test en is vooraf verdeeld in tien subpools van zo&#39;n 8.000 shRNA bouwt elk. Amplificatie en sequencing primers zijn ook voorzien voor downstream target identificatie. Eerdere studies is een synergetische antitumor activiteit van TRAIL in combinatie met paclitaxel in A549-cellen, een humane longcarcinoom cellijn 3, 4. In deze studie tonen we de toepassing van een gepoolde LentiPlex shRNA bibliotheek om snel te voeren een positieve selectie scherm voor genen die betrokken zijn bij de cytotoxiciteit of A549 cellen bij blootstelling aan TRAIL en Paclitaxel. Een barrière die vaak ondervonden met high-throughput-schermen zijn de kosten en moeite met het deconvolutie, hebben we ook uitvoerig een kosten-effectieve aanpak van polyklonaal gebruik te maken van traditionele sequencing.

Hier gebruiken we een menselijke LentiPlex samengevoegde bibliotheek en traditionele sequencing methoden om gen-doelstellingen het bevorderen van overleving van de cel te identificeren. Laten we zien hoe op te zetten en deconvolute een LentiPlex scherm en valideren van de resultaten.

MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen

RNA-interferentie (RNAi) is een intrinsiek cellulair mechanisme voor de regulatie van genexpressie. Door gebruik te maken van de aangeboren kracht van dit systeem kunnen we ...

Het algemene doel van de volgende video is om het gebruik van een whole-genome short hairpin RNA- of shRNA-bibliotheek te demonstreren voor het snel uitvoeren van een positieve selectiescreening. Dit wordt bereikt door de doelcellen te transduceren met 10 subpools van de Mission LentiPlex gepoolde whole-genome shRNA-bibliotheek, gevolgd door de toevoeging van het therapeutische component. Als tweede stap wordt het shRNA-templatemateriaal teruggewonnen, wat de deconvolutie van de gepoolde screening mogelijk maakt.Het teruggewonnen S-H-R-N-A wordt vervolgens in de vector gekloond en getransformeerd in competente bacteriën. Vervolgens worden de plasmide-DNA-monsters gesequenced en worden de S-H-R-N-A-doelen geïdentificeerd met behulp van de lenti PLX, HRNA-sequentieresearchdatabase. De resultaten van het in deze video uitgevoerde experiment onthullen, op basis van het aantal sequencing-hits, de genen die betrokken zijn bij de cytotoxiciteit van een epitheliale tumorcellijn bij blootstelling aan antitumor pharmacological agents.Lin Duplex gepoold. De HRNA-bibliotheek bevat het RNAI-consortium of de TRC-collectie in 10 matrixbuizen en kan worden gebruikt om snel high-throughput studies naar het verlies van genfuncties uit te voeren. In deze studie wordt het gebruikt om snel een positieve selectiescreening uit te voeren voor genen die betrokken zijn bij de cytotoxiciteit van 5 49-cellen bij blootstelling aan trail en paclitaxel voorafgaand aan de transductie van doelcellen.Zaai het juiste aantal schalen van 60 millimeter in met voldoende cellen om de volgende dag een confluentie van ongeveer 70% te bereiken. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Groeisnelheden variëren per celtype en moeten worden bepaald voorafgaand aan het starten van de screening ter voorbereiding op de transductie van cellen met de mission lenti plex pooled S-H-R-N-A library; ontdooi de lentivirale particles op ijs en breng de ontdooide particles over naar een laminaire flowkast, waarbij ze op ijs worden bewaard als ze niet onmiddellijk worden gebruikt.Bereken hoeveel van elke individuele virale subpool moet worden toegevoegd aan de cellen om een multiplicity of infection of MOI van één te verkrijgen over alle cellen in de kweekschalen. Om de waarschijnlijkheid van meerdere integrines per cel te verkleinen wordt een lage MOI gebruikt; verdun de berekende hoeveelheid virus in 100 tot 300 µL compleet medium om een betere distributie van het virus te waarborgen bij toevoeging aan de kweekschaal, en verwijder vervolgens het medium van de voorbehandelde cellen. Voeg aan elke schaal compleet medium toe dat poly brain-oplossing bevat.Voeg HRNA lentivirale deeltjes toe aan de betreffende schalen in overeenstemming met het vooraf vastgestelde experimentele ontwerp. Draai de platen voorzichtig rond om het virus gelijkmatig over de cellen te verdelen. Incubeer 18 tot 20 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5% carbon dioxide.Aspireer de volgende dag het virusbevattende medium en voeg vers compleet medium zonder poly brain toe. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Aspireer op de vierde dag het medium van de cellen en voeg vers medium toe dat de therapeutische component bevat in een vooraf bepaalde optimale concentratie. Behandel de cellen vervolgens gedurende een vooraf bepaalde tijdsduur met deze component.In deze studie worden cellen gedurende 48 uur behandeld met 100 nanogram per milliliter trail en één micromolair paclitaxel. Na de behandeling moeten de overlevende cellen opnieuw worden gezaaid in T 75-flasks en mogen ze uitbreiden tot ze bijna 100% confluent zijn om polyklonale deconvolutie uit te voeren. De heterogene populatie cellen wordt geoogst uit elke subpool en het genomische DNA wordt geïsoleerd.Begin de procedure voor het herstel van het S-H-R-N-A-sjabloon met het opzetten van de PCR-reactie zoals beschreven in het geschreven protocol. Amplificatieprimers met een concentratie van 20 millimolar zijn inbegrepen bij de lenti plex kit. Bereid een positieve controle voor met behulp van de mission SHRA humane positieve controlevector, verdund tot de juiste concentratie als sjabloon.Een succesvolle amplificatie met dit template geeft aan dat de componenten van de PCR-assay en de cycluseigenschappen adequaat zijn. Sla het PCR-programma dat in het geschreven protocol staat op in de thermocycler en voer de doelamplificatie uit. Zodra de cyclus is voltooid, combineert u drie microliter van elke PCR-reactie met één microliter kleurstof en voert u elektroforese uit naast een 100 base pair low ladder op een 1% agarosegel om de aanwezigheid van een 309 base pair amplicon te bevestigen.Op dit punt worden de PCR-amplicons gesubkloneerd. Clone de PCR-producten met de topo ta cloning kit volgens het protocol van de fabrikant. Het resultaat is dat elk vectoréén PCR-product bevat. Zodra de subklonering is voltooid, worden 250 individuele bacteriële kolonies geïsoleerd, waarvan elke kolonie een individueel PCR-amplicon bevat.Kweek de individuele kolonies in culturen van twee milliliter, waaruit het plasmide-DNA kan worden geëxtraheerd met de Gen Elute plasmid mini prep kit; na digestie van het gezuiverde plasmide-DNA met EcoR1 kan de aanwezigheid van het insert worden bevestigd via elektroforese. Ten slotte kan het shRNA-insert in de gesequenced plasmide-DNA-monsters worden geïdentificeerd met de Plex HRNA-sequentiezoekdatabase die bij de PLX-bibliotheek wordt geleverd. Gebruik het zoekveld op het bijgevoegde S-H-R-N-A sequence search access database-formulier om het begin van de HRNA-sequentie te vinden.Voer de volgende 10 tot 21 nucleotiden van de querysequentie in. Selecteer vervolgens de soort van de gepoolde S-H-R-N-A. Selecteer optioneel de subpool waarin de sequentie is gevonden.Klik nu op de knop 'vind potentiële hits' om de zoekopdracht uit te voeren. Hiermee zouden de overeenkomstige T-R-C-S-H-R-N-A-sequenties moeten worden geïdentificeerd die overeenkomen met de sequentiegegevens. Sigma Aldrich, uw favoriete genwebsite, kan vervolgens worden gebruikt om meer informatie te vinden over de geïdentificeerde TR CS HRA-sequenties en de bijbehorende gen-targets. De geïdentificeerde targetgenen moeten worden gevalideerd door de oorspronkelijke screeningassay te herhalen met de oorspronkelijke TRC-kloon plus ten minste twee aanvullende RNA's die hetzelfde gen targeten, gebruikmakend van een formaat van één HRNA per 60 millimeter schaal.Echte hits zullen hetzelfde fenotype vertonen in een meerderheid van de schaaltjes. Klonen die de kloningsvector bevatten met één individueel PCR-fragment werden geïsoleerd met behulp van de SHRA-templateherstelprocedure en het HRNA-insert werd geïdentificeerd met behulp van de lenti plex SHRA-sequentiezoekdatabase. Er werden 250 klonen gesequenced.Van deze waren er 25 vertegenwoordigd door meerdere klonen, en de resterende 225 werden slechts door één kloon vertegenwoordigd en zijn niet verder onderzocht. Zoals hier getoond, werden verschillende kandidaatgenen, waaronder TBX3, PPP2, ca en AKT2, vertegenwoordigd door meerdere klonen. De T-box transcriptiefactor TBX3 kwam voor in in totaal vier klonen en is betrokken bij tumormigratie.Er is aangetoond dat downregulatie van PPP2CA de groei van LnCap-cellen die in androgeendeficiënte condities zijn gekweekt, in stand houdt door de door androgeendeprivatie geïnduceerde celcyclusstop op te heffen en apoptose te voorkomen. Bovendien is AKT2 een serine/threonine-proteïnekinase en putatief oncogen waarvan is aangetoond dat het verschillende rollen speelt bij kankerontwikkeling. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u deze methode kunt gebruiken.Gepoolde shRNA-bibliotheek van Len Plex om snel high-throughput studies naar het verlies van genfunctie uit te voeren.

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier gebruiken we een menselijke esiRNA bibliotheek in een high-throughput screen voor genen die betrokken zijn bij de celdeling. Laten we zien hoe het opzetten en uitvoeren een esiRNA schermen, en hoe te analyseren en valideren van de resultaten.

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

Wij rapporteren een kleine haarspeld RNA (shRNA) en de volgende generatie sequencing-gebaseerd protocol voor het identificeren van de regelgevers van de inactivering van het x-chromosoom in een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten aan de methyl CpG bindende eiwit 2) MeCP2) gen op het X-chromosoom inactief.

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Een CRISPR/sgRNA-bibliotheek is toegepast op het ondervragen van eiwit-codeert genen. De haalbaarheid van een bibliotheek van de sgRNA aan het licht brengen van de functie van een scheidingswand CTCF in genregulatie blijft echter onontgonnen. Hier beschrijven we een HOX loci specifieke sgRNA bibliotheek te verhelderen van de functie van CTCF grenzen in HOX loci.

HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.

Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Deze studie presenteert een dubbel CRISPRi-systeem gericht op lange niet-coderende RNA's in melanoomcellen. Het maakt combinatorische genknockdown en synthetische letale screening mogelijk, waarbij kankerspecifieke lncRNA-interacties worden geïdentificeerd voor mogelijke therapeutische strategieën.

Dubbele CRISPR-interferentiestrategie voor het richten op synthetische dodelijke interacties tussen niet-coderende RNA's in kankercellen

Dit protocol beschrijft een schaalbare intraductale CRISPR-screeningsbenadering die parallelle in vivo genknockout- en activatiestudies in de muismelkklier mogelijk maakt.

Parallelle in vivo screening van gen-knockout en activatie in de muismelkklier

Leer hoe je een LentiPlex shRNA-bibliotheek gebruikt voor positieve selectiescreening in zoogdiercellen. Deze methode identificeert genen die celoverleving bevorderen bij behandeling met therapeutische middelen.

MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen

Meer video's verkennen