Het veranderen van de richting en oriëntatie van het elektrisch veld Tijdens elektrische pulsen Application Verbetert de Plasmide Gene Transfer In vitro
12 september 2011
Gen transfectie door elektroporatie is ongeveer twee keer verbeterd wanneer oriëntatie van het elektrisch veld wordt gewijzigd tijdens de puls toepassing, terwijl de levensvatbaarheid van de cellen wordt niet beïnvloed. De toename van de transfectie-gen wordt veroorzaakt door de toename van het membraan gebied dat is gemaakt bevoegd voor DNA binnenkomst in de cel.
Genoverdracht via elektroden is een fysieke methode die wordt gebruikt om genen in cellen te brengen door middel van korte en intense elektrische pulsen. Bij een succesvolle genoverdracht via elektroden zijn verschillende stappen betrokken: de vorming van een complex tussen het DNA en het celmembraan, de translocatie van DNA door het gepolariseerde membraan, de overdracht van DNA vanuit het cytoplasma naar de nucleus en de genexpressie voor de genoverdracht via elektroden. Er worden verschillende elektrische pulsprotocollen gebruikt om een maximale gentransfectie te bereiken.
Een van deze methoden is het wijzigen van de oriëntatie van het elektrische veld tijdens de afgifte van de pulsen. In deze video demonstreren we het verschil in de efficiëntie van genoverdracht via elektroden wanneer alle pulsen in dezelfde richting worden afgegeven en wanneer de pulsen afwisselend worden afgegeven. Door de oriëntatie van het elektrische veld te wijzigen, werden experimenten uitgevoerd op Chinese hamster ovary-cellen, CHOK1, voor het experiment.
Volg deze stappen: kweek de cellen gedurende 24 uur in een kweekfles in de incubator. Bereid op de dag van het experiment een celsuspensie voor met trypsine in een 0,25% trypsin-EDTA-oplossing en tel de cellen. Centrifugeer de cellen vijf minuten lang bij 1000 tpm bij 4 °C en resuspendeer de celpellets in ISO OSM Miller natriumfosfaatbuffer tot een celdichtheid van 5 miljoen cellen per milliliter. Breng het monster over naar de juiste schaal. De cellen worden blootgesteld aan een elektrisch veld in een pipetpunt met geïntegreerde elektroden die zijn aangesloten op een prototype hoogspanningsgenerator.
Deze elektroden maken het mogelijk om een relatief homogeen elektrisch veld in verschillende richtingen toe te passen. De tip en de generator zijn ontwikkeld in het laboratorium van de faculteit Biocybernetica en Elektrotechniek van de Universiteit van Luana. Voeg plasmid E-G-F-P-N one toe aan een celsuspensie met een concentratie van 10 micrograms per milliliter.
Meng de cellen grondig met het plasmide-DNA en incubeer het mengsel gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur voordat de elektrische pulsen worden toegediend. Zuig 100 µL van de cel-suspensie op in de pipetpunt met geïntegreerde elektroden. In dit experiment wordt een reeks van acht rechthoekige pulsen toegediend met een prototype-generator voor hoge spanning, waarbij in het eerste protocol verschillende elektrische veldprotocollen worden gebruikt.
Alle pulsen worden in dezelfde richting afgegeven, terwijl bij het tweede protocol de pulsen worden afgegeven door de oriëntatie van het elektrische veld te wijzigen. Het tweede protocol kan alleen worden gebruikt met een geschikte pulsgenerator die de toepassing van elektrische pulsen in verschillende richtingen mogelijk maakt. Verplaats de cellen direct na de pulsapplicatie vanuit de pipetpunt naar zeswells platen en voeg foetaal runderserum toe.
Incubeer 25% van het monstervolume met cellen gedurende vijf minuten bij 37 °C. Om het herstel van het celmembraan mogelijk te maken, worden twee milliliter HAMF 12 aan elk monster in de zes-wells plaat toegevoegd en worden de cellen 24 uur lang bij 37 °C geïncubeerd in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer in de incubator. De efficiëntie van de gen-elektrotransfer wordt bepaald als het percentage cellen dat GFP tot expressie brengt 24 uur na de toepassing van de puls.
De cellen worden geobserveerd met een fluorescentiemicroscoop in de acquisitiesoftware. Stel de excitatiegolflengte in op 488 nanometer en kies een geschikt banddoorlaatfilter voor het groene fluorescentiebeeld om de cellen te detecteren die GFP tot expressie brengen. Leg ten minste vijf beelden vast, zowel fasecontrast als groene fluorescentie bij 20 maal vergroting.
Tel de cellen in de fasecontrastafbeelding en de cellen die GFP tot expressie brengen in de groene fluorescentieafbeelding bij dezelfde objectievergroting. Bepaal het percentage van de gen-elektrotransfer-efficiëntie door het aantal cellen dat GFP tot expressie brengt te delen door het totaal aantal cellen in elke overeenkomstige afbeelding. Het percentage cellen dat GFP tot expressie brengt wanneer alle pulsen in dezelfde richting worden afgegeven en wanneer pulsen worden afgegeven door de oriëntatie van het elektrische veld te wijzigen, wordt gepresenteerd. Door de oriëntatie van het elektrische veld te wijzigen, neemt het percentage cellen dat GFP tot expressie brengt significant toe.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt gentransfectie via elektroporatie, waarbij de nadruk ligt op de invloed van de oriëntatie van het elektrische veld op de transfectie-efficiëntie. De resultaten geven aan dat het wijzigen van de richting van het elektrische veld tijdens de pulsapplicatie de gentransfectiesnelheden kan verdubbelen zonder de celviabiliteit in gevaar te brengen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Gentherapie
- Celbiologie
- Elektroporatietechnieken
Achtergrond
- Genoverdracht via elektroden is een methode om genen in cellen te brengen.
- Hierbij worden korte, intense elektrische pulsen toegepast om de entry van DNA te vergemakkelijken.
- Voor een succesvolle transfectie moet het DNA het celmembraan passeren en de nucleus binnendringen.
- Verschillende protocollen voor elektrische pulsen kunnen de transfectie-efficiëntie verhogen.
Doel van de studie
- Om het effect van de oriëntatie van het elektrisch veld op de efficiëntie van gentransfectie te evalueren.
- Om vast te stellen of het wijzigen van de oriëntatie de celviabiliteit beïnvloedt.
- Om het proces te demonstreren met behulp van Chinese hamster ovary (CHO)-cellen.
Gebruikte methoden
- Toepassing van elektrische pulsen op CHO-cellen.
- Vergelijking van de transfectie-efficiëntie bij variërende oriëntaties van het elektrische veld.
- Beoordeling van de celviabiliteit na transfectie.
- Analyse van de DNA-opname in cellen en de daaropvolgende genexpressie.
Belangrijkste Resultaten
- De efficiëntie van gentransfectie verbeterde met ongeveer factor twee door een gewijzigde oriëntatie van het elektrische veld.
- Er werd geen significante impact op de celviabiliteit waargenomen.
- Een vergroot membraanoppervlak droeg bij aan een verbeterde DNA-instroom.
- De effectiviteit van verschillende elektrische pulsprotocollen werd aangetoond.
Conclusies
- Het wijzigen van de oriëntatie van het elektrisch veld tijdens de pulstoepassing verbetert de gentransfectie aanzienlijk.
- Deze methode kan worden geoptimaliseerd zonder de gezondheid van de cellen in gevaar te brengen.
- Verder onderzoek kan aanvullende protocollen verkennen voor een verbeterde genoverdracht.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het optimaliseren van de oriëntatie van het elektrische veld tijdens electroporatie verhoogt de efficiëntie van plasmide-genoverdracht, wat een niet-virale strategie biedt om de transfectieopbrengsten te verbeteren in workflows voor vroege targetvalidatie en lead-identificatie. Deze benadering ondersteunt mechanistische risicoreductie door de DNA-instroom te vergroten via een uitgebreide membraancompetentie zonder de celviabiliteit in gevaar te brengen, waardoor het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen wordt verbeterd. De methode maakt reproduceerbare, schaalbare genlevering mogelijk voor assay-ontwikkeling en fenotypische screeningtoepassingen in biofarmaceutische R&D.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Vergroot het membraanoppervlak dat toegankelijk is voor DNA-entry, waardoor de transfectie-efficiëntie verbetert en functionele targetvalidatie in studies naar recombinante eiwitexpressie wordt ondersteund.
- Operationele waarde: Maakt een consistente afgifte van plasmiden over celpopulaties mogelijk, wat de variabiliteit bij hypothesetoetsing in een vroeg stadium en pathway-verduidelijking vermindert.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt kwantitatieve, op fluorescentie gebaseerde uitlezingen van de efficiëntie van genoverdracht die compatibel zijn met high-content screeningplatforms.
- Operationele waarde: Standaardiseert electroporatieparameters middels geïntegreerde elektrodetips en programmeerbare pulsgeneratoren, wat de reproduceerbaarheid van assays tussen laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Ondersteunt de schaalbare preparatie van getransfecteerde cellijnen voor downstream target engagement- en biomarkerassays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de levensvatbaarheid van cellen na transfectie, waardoor longitudinale studies naar genexpressie en fenotypische effecten in ziekte-relevante systemen mogelijk worden.
- Operationele waarde: Faciliteert de generatie van stabiele of transiënt getransfecteerde preklinische modellen met behulp van CHO-cellen, een veelgebruikte gastheer voor de productie van biologics en padanalyse.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij een efficiënte genoverdracht vereist is om de targetfunctie te beoordelen en signaalpaden in cellulaire modellen te moduleren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests door betrouwbare overexpressie of knockdown van genen van belang in zoogdiercellen mogelijk te maken.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve transfectie-outputs die vergelijking van genetische constructen of regulatoire elementen mogelijk maken.
- Analytics: Genereert op percentages gebaseerde efficiëntiemetrieken (GFP+ cellen/totaal aantal cellen) die statistische vergelijking tussen pulse-protocollen mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door levensvatbare getransfecteerde cellen te produceren die geschikt zijn voor verdere validatie in 3D-modellen of co-culturesystemen.
- Enterprise Hergebruik: Vertegenwoordigt een herbruikbare electroporatiecapaciteit die toepasbaar is op meerdere projecten waarbij plasmid-afgifte in adherente cellijnen of suspensiecellijnen vereist is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de resultaten van genoverdracht door de transfectie-efficiëntie te verhogen via biofysische optimalisatie van de pulsparameters.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van genoverdrachtsprocedures door gedefinieerde pulstreinen en controle over de veldoriëntatie.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij targetvalidatie door voldoende transgeenexpressie voor fenotypische beoordeling te waarborgen, waardoor vals-negatieven worden geminimaliseerd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische targets mogelijk op basis van de haalbare expressieniveaus in cellulaire assays.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in mammalenceltuctuur, plasmidepreparatie en fluorescentiemicroscopie voor de beoordeling van de transfectie-efficiëntie.
- Afhankelijk van toegang tot hoogspanningspulsgeneratoren die in staat zijn tot programmeerbare veranderingen in de oriëntatie van het elektrische veld en compatibele tips met geïntegreerde elektroden.
- Noodzaak tot standaardisatie van pulsparameters (voltage, duur, aantal) en celdichtheid over experimenten heen om vergelijkbaarheid te garanderen.
- Omvat optimalisatie van de DNA-celverhouding en incubatietijden om de transfectie-efficiëntie in balans te brengen met cellulaire stress.
- Beperkt tot adherente of suspensie-cellijnen die compatibel zijn met elektroporatie; primaire of gevoelige cellen kunnen alternatieve afleveringsmethoden vereisen.
