Imaging Feromoon Sensing in een muis Vomeronasal Acute Tissue Slice Voorbereiding

Het algemene doel van deze procedure is het maken van een acute weefselcoupe-preparatie van het RO-neusorgaan of VNO van de muis, om calcium-imagingexperimenten uit te voeren op subpopulaties en/of individuele neuronen in levend weefsel. Dit wordt bereikt door eerst het VNO uit de neus van de muis te extraheren en het vervolgens onder een dissectiemicroscoop in koud A CSF uit de kraakbeencapsule te micro-dissecteren. Vervolgens wordt het geïsoleerde VNO verticaal in een agarblok geplaatst en worden er met een microtoom acute coronale weefselcoupes gesneden om de integriteit van het weefsel te verifiëren.

Enkele coupes worden na immunohistochemie waargenomen onder een confocale microscoop. Andere coupes worden geladen met een calciumsensitieve kleurstof en vervolgens geperfuseerd met vermeende pheromonale liganden, waarna neuronale activatie wordt waargenomen middels calcium-imaging. Deze methode kan helpen bij het oplossen van kernvraagstukken binnen het vakgebied van de olfactoriek.

Honderden feromoonreceptoren worden bijvoorbeeld tot expressie gebracht in het vomeronasale orgaan, maar voor slechts enkele daarvan zijn liganden geïdentificeerd. Feromoonreceptoren zijn zeer moeilijk tot expressie te brengen in een heteroloog systeem. We moesten een efficiënte in vivo assay ontwikkelen om specifieke feromonen aan specifieke receptoren toe te wijzen.

We kunnen tactiele muizen gebruiken waarbij een specifieke subpopulatie neuronen onbekende receptoren tot expressie brengt en geïdentificeerd kan worden door de expressie van GFP. We zouden deze assay ook kunnen gebruiken om ionkanalen en enzymen die betrokken zijn bij de Fairmont-transductiecascade farmacologisch te onderzoeken en zo de procedure te demonstreren. Vandaag zijn Julian en Fabian aanwezig, twee onderzoekers uit mijn laboratorium, voordat we beginnen met de dissectie.

Bereid vers, koud, kunstmatig cerebrospinaal vocht, een CSF verzadigd met oxycarb, door alle ingrediënten behalve het calciumchloride te combineren. Verzadig de oplossing door er direct oxycarb doorheen te borrelen. Voeg vervolgens het calciumchloride toe en vul aan met dubbel gedestilleerd water tot het gewenste volume.

Houd de A CSF-oplossing op ijs tot gebruik. Na euthanasie en onthoofding van een volwassen muis, bereidt u een Petrischaal met koude en continu geoxygeneerde, gecarbonateerde A CSF. Plaats na het verwijderen van de onderkaak de kop van de muis in de Petrischaal.

Positioneer de kop van de muis onder de dissectiemicroscoop om het palatum te kunnen visualiseren. Maak vervolgens met microschaartjes een horizontale incisie in het bovenste gedeelte van het palatum en verwijder daarna het palatummembraan met microdissectiepincetten. Hydrateer en reinig de blootgestelde holte met A CSF.

Snijd het bovenste en onderste deel van het neustussenschot door. Extraheer vervolgens voorzichtig het neustussenschot met het VNO en plaats dit verticaal direct in schoon A CSF. Scheid de twee delen van het VNO met behulp van micro-dissectiepincetten.

Identificeer het kraakbenige kapsel van het VNO en verwijder dit vervolgens voorzichtig, waarbij u er zeker van bent dat alle kraakbenige fragmenten zijn verwijderd. Het geïsoleerde VNO, de kraakbenige fragmenten en het niet-gedisseceerde VNO worden hier aangegeven. Bereid eerst 3% low melting agarose voor en richt vervolgens de werkruimte in met de benodigde instrumenten. Vul de inbedmal met agarose en zorg ervoor dat de temperatuur onder de 41 °C ligt voordat u het gedisseceerde VNO onderdompelt. Positioneer het weefsel verticaal om coronale coupes te verkrijgen.

Plaats de inbedmal één minuut op ijs totdat de boor stolt. Verwijder na één minuut het boorblok, snijd de agar in een parametale vorm en plak deze vervolgens op de microtoomhouder. Snijd coronale VNO-coupes met de microtoom met een snelheid van 0,5 millimeters per seconde, een amplitude van 0,7 millimeters en een dikte van 100 micrometers in koude CSF.

Verzamel de weefselsneden met een penseel en plaats deze in een weefselkweekplaat gevuld met koud A CSF om te verifiëren dat de structurele integriteit van de verzamelde weefselsneden behouden is; deze kunnen vervolgens worden gefixeerd en daarna immunokleuringen ondergaan voor cytoskeletcomponenten of andere eiwitten van belang. Hier demonstreert immunokleuring tegen geacetyleerd tubuline in paars de structurele integriteit van de weefselsneden. Bovendien laat de observatie van een specifieke neuronale populatie, waarbij een specifieke feromoonreceptor is gelabeld met GFP, de geconserveerde neuronale morfologie zien; bij werkzaamheden in een donkere kamer kunnen neuronen met kleine ovale cellichamen en lange dendrieten die het oppervlak van het lumen bereiken en eindigen in microvilli worden waargenomen.

Incubeer de VNO-coupes gedurende één uur bij 37 °C in een laadoplossing van koude A CSF met 7 µM URA 2:00 AM en 0,1% onic. Bewaar de geladen coupes op ijs met oxycarbonatie tot gebruik. Gebruik een penseel om de geladen coupes in een perfusiekamer met A CSF te plaatsen en zet de coupes vast met een weefselcoupe-anker.

Plaats de perfusiekamer op de objecttafel van een microscoop voor calcium-imaging en perfuseer continu met oxy-gecarbonateerde A CSF bij kamertemperatuur. Observeer de geladen VNO-coupes met behulp van de fluorescentiegolflengten die overeenkomen met de kleurstof, wat 340 tot 380 nanometers is voor four O 2:00 AM. Gebruik de geschikte software om veranderingen in de intracellulaire calciumratio te registreren. Een perfusiesysteem is noodzakelijk om chemische stimulatie op te wekken.

Hier is een coronale doorsnede van vno-weefsel van een muis waarbij de subpopulatie neuronen die de V one RB two feromoonreceptor tot expressie brengt ook GFP tot expressie brengt, immunogekleurd tegen het geacetyleerde tubuline-eiwit, weergegeven in paars. Opnamen met een hogere vergroting van de doorsnede tonen het behoud van de weefselintegriteit. Neuronen met lange dendrieten zijn te zien die het oppervlak van het lumen bereiken, en de expressie van het structurele eiwit is zichtbaar in de dendritische knoppen en microvilli voor calciumimaging.

FU-geladen weefselcoupes worden eerst gevisualiseerd met Hoffman-fasecontrast om het interessegebied te lokaliseren; beginnend bij het bloedvat, de eerste witte pijl, beweegt de waarnemer langzaam naar het lumen, de tweede witte pijl, en de neuro-epitheliale regio. Het ovale cellichaam van het RO-nasale neuron, de derde witte pijl, kan worden geïdentificeerd aan zijn lange en dunne dendriet.

De vierde witte pijl die in het lumen steekt, de neuronale dendritische knobbel. De vijfde witte pijl geeft microvilli aan die in contact staan met cellen geladen met feromonen RA; hier getoond bij three 80 nanometers, waarna ze sequentieel worden belicht bij three 40 en three 80 nanometers, en deze fluorescentie-golflengteverhouding correspondeert met de intracellulaire calciumveranderingen in de geselecteerde neuronen, zwarte, rode en blauwe cirkels. Een TP wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van de neuronen te bepalen.

Let op het bereik van de calciumresponsen die worden vertoond door de drie geselecteerde neuronen en het feit dat neuron nummer twee (rode cirkel) niet reageert op een TP en daarom zal worden uitgesloten van verdere analyse. Chemische stimulatie wordt vervolgens bereikt met behulp van zowel urine als een mengsel van muisferomonen, waarbij in de diepte van de weefselsnit wordt gekeken. Een subpopulatie neuronen die zowel GFP als de V1RR2-receptor tot expressie brengt, kan worden gelokaliseerd.

Hier wordt een neuron dat zowel GFP als de V1RB2-receptor tot expressie brengt, getoond naast een neuron dat geen V1RB2 tot expressie brengt. Beide cellen zijn geladen met URA-2:00 AM en het V1RB2-exprimerende neuron vertoont een calciumpiek als reactie op de perfusie van het ligand van de receptor, 2-heptanon. Interessant is dat het niet-V1RB2-exprimerende neuron ook reageert op 2-heptanon, wat de complexiteit van pheromone-codering in het VNO demonstreert.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de muis moet extraheren en microdissecteren voor het mar-celorgaan om acute weefselsnedes voor te bereiden. Dit protocol is ook aanpasbaar voor fysiologisch onderzoek met behulp van alternatieve calciumkleurstoffen en microscoopopstellingen. Veel succes met uw experiment.