Colorectal Cancer Cell oppervlakte-eiwit Profiling Met behulp van een antilichaam Microarray en fluorescentie Multiplexing

Het algemene doel van het volgende experiment is om de DOT scan-antilichaam microarray te gebruiken voor het moleculair profileren van oppervlakteantigenen op colorectaal kankerweise. Daarnaast wordt fluorescente multiplexing toegepast om celtypen met specifieke profielen binnen de gemengde populatie te onderscheiden. Cluster of differentiation- of CD-antigenen zijn geïdentificeerd als potentiële prognostische of metastatische biomarkers bij colorectale kanker.

Deze antigenen zijn ideale biomarkers omdat hun expressie vaak verandert bij tumorprogressie of door interactie met andere celtypen. In deze video maken we gebruik van de DOT scan antilichaam-microarray om levende cellen te vangen via de tot expressie gekomen oppervlakteantigenen. De DOT scan antilichaam-microarray bestaat uit een glazen objectglas met een laag nitrocellulose.

Het DOT scan antilichaam-microray-paneel is omrand door uitlijningspunten bestaande uit CD 29 en CD 44. Dubbele arrays zijn eveneens als punten op elke zijde van de array aangebracht. Het eerste paneel bestaat uit de oorspronkelijke 82 antilichamen van de DOT scan leukemie-microarray, waaraan 40 aanvullende antilichamen zijn toegevoegd die zijn geselecteerd op basis van hun prognostische potentieel als satelliet-microarray voor colorectale kanker.

En het laatste paneel bestaat uit isotype-controleantilichamen. Hierbij worden colorectale kankersweefsel en normaal darmslijmvlies gedigesteerd en gefilterd om een levensvatbare suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. De suspensie kan worden ingevroren of bewaard voor later gebruik.

De celsuspensie wordt gebruikt voor celvangst op een DOT scan antilichaam-microarray, waarbij antigenen die tot expressie komen op verschillende cel-subtypes worden geprofileerd via fluorescentie-multiplexing. De resulterende expressieprofielen tonen een significante verandering in antigeenexpressie tussen de colorectale kankercellen en een normaal darmslijmvlies. Dit verschil is ook terug te zien in de tumor-geassocieerde leukocytenpopulatie.

Hiërarchische clustering van verschillende tumorprofielen laat clustering van ziektekenmerken zien die overeenkomen met de stadia van colorectaal carcinoom. Hallo, ik ben Jerry van de School of Molecular Bioscience aan de University of Sydney in Australië, en vandaag laat ik u een experiment zien voor het profileren van oppervlakteantigenen op colorectaal carcinoomweefsel. Met behulp van een Dot scan antilichaam-microarray en fluorescentie-multiplexing maken Dot scan microarrays het mogelijk om ongeveer 140 oppervlakteantigenen op levende kankercellen en de bijbehorende inflammatoire leukocyten te profileren.

Subsets van cellen die op microarrays zijn vastgelegd, kunnen worden onderscheiden met behulp van fluorescentiegelabelde antilichamen die binden aan een sterk tot expressie gebrachte marker-antigeen op de cellen van belang. Tot drie verschillende subsets van cellen kunnen worden geprofileerd op een enkele microarray door gebruik te maken van geschikte fluorescente labels op antilichamen met drie verschillende specificiteiten. De DOT-scan microarray assay is een relatief eenvoudige methode en is reeds gebruikt voor celoppervlakprofilering van verschillende kankersoorten.

Een kenmerkend aspect van de DOT-scan is het vermogen om levende cellen vast te leggen via hun oppervlakteantigenen, waardoor het verkregen bindingspatroon een weerspiegeling is van het oppervlakteprofiel van de cel. Oppervlakteantigenen spelen een belangrijke rol bij tumorontwikkeling en metastasering, alsmede in de ontstekingsreactie om de kanker te bestrijden. Uitgebreide oppervlakteprofielen of immunofenotypes kunnen worden gebruikt als ziektekenmerken om de classificatie van kanker te verbeteren, wat een optimale behandeling na de chirurgie mogelijk maakt.

Oké, laten we beginnen. In het hier getoonde experiment worden klinische colorectale kankertumorstalen, gradaties A tot D, verzameld in Hank's buffer. Om te beginnen worden de tumoren met twee scalpels voorzichtig in plakjes van één millimeter dik gesneden.

Plaats de coupes in een oplossing van 2% collagenase type vier en 10% DNA voor digestie. Secties van normale darmslijmvliezen van dezelfde patiënt worden verzameld op 10 centimeter afstand van de primaire tumorlocatie. Dit dient als onze controle en wordt op identieke wijze verwerkt als het tumor monster.

Tumorverdijsting vindt plaats bij 37 °C gedurende één uur om de afbraak van bindweefsel te bevorderen; de DNase verwijdert DNA van beschadigde cellen. Na incubatie wordt de weefselsuspensie door een gaasfilter geleid, waarbij Hanks-buffer over het monster wordt gespoeld terwijl de zuiger van een spuit van 10 ml wordt gebruikt om de cellen door het filter te duwen. Dit proces wordt meerdere keren herhaald totdat de meeste cellen door het gaasfilter zijn gegaan.

Het gaas scheidt de cellen van eventueel onverteerd bindweefsel. Filter vervolgens de celsuspensie verder door deze op te zuigen in een spuit van 10 mL en te filteren door een fcon 200 micrometer filter, gevolgd door een fil con 50 micrometer filter. Deze fijnere filters moeten de verwijdering van overtollig slijm of DNA waarborgen, alsook celclusters opbreken om een levensvatbare enkelcellususpensie te verkrijgen.

Dezelfde behandeling wordt uitgevoerd voor het normale slijmvlies. We stelden vast dat het normale slijmvlies neigt meer bindweefsel te bevatten en dat er als gevolg hiervan meer wasbeurten nodig zijn om via de centrifuge tot een celstroom te komen bij 410 G bij 20 °C gedurende vijf minuten. Ter voorbereiding op de koude bewaring suspenderen we de celpellet met 750 µL foetaal kalfsserum, gevolgd door gelijke volumes foetaal kalfsserum met DMS.

Voeg de oplossing druppelsgewijs toe bij deze DMS onder constant roeren. Pipetteer een aliquot van het supernatant in een cryotube en plaats deze in een isoleercontainer. Deze monsters kunnen tot een jaar worden bewaard bij -80 °C.

De isolatie en DMSO moeten ervoor zorgen dat de cellen langzaam vrijkomen zonder uit elkaar te barsten. Een neveneffect van de opslag is de lysis van de populatie rode bloedcellen. Gelukkig zijn deze voor ons niet nodig.

Voor het experiment: haal de monsters uit de opslag en ontdooi ze snel. Resuspendeer de cel-suspensie in 10 mL Hank's-buffer in een waterbad van 37 °C; de buffer dient om de 10% DMSO en foetaal kalfsserum te verdunnen. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 410 ×g bij 20 °C.

Giet vervolgens het supernatant af en resuspendeer in 500 µL Hank's buffer; enkele cellen kunnen tijdens het vries- en dooi-proces zijn beschadigd, wat leidt tot de vrijgave van DNA in de suspensie. Om dit probleem tegen te gaan, wordt het monster geïncubeerd met 0,1% DNase bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd kan een telling van de celviabiliteit worden uitgevoerd.

Meng gelijke hoeveelheden triam blauw met 10 µL cel-suspensie en pipetteer 10 µL van het mengsel in een celteller. Onder de microscoop zien gezonde en levensvatbare cellen er helder uit. Daarentegen zullen niet-levensvatbare cellen met beschadigde membranen blauw kleuren.

Voor celvangst op de DOT scan antilichaam zijn minimaal 4 miljoen levensvatbare cellen vereist. MICRORAY neerslag. DNA-behandeling: was de cellen voor een tweede maal met 10 ml Hank's buffer en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 410 G en 20 °C.

We suspenderen het uiteindelijke celpellet in 200 µL RPMI-medium. Dit medium bevat relatief meer voedingsstoffen dan de Hanks-buffer en wordt gebruikt om de celvangst op de antilichaam-microarray te vergemakkelijken terwijl de cellevensvatbaarheid behouden blijft. De colorectale kankerscan antilichaam-microarray bestaat uit 140 verschillende antilichaamstippen die in duplo op de nitrocellulose zijn aangebracht.

Elke stip op de array bevat 10 nanoliters van een monoklonaal antilichaam tegen het celoppervlakantigeen. Om de antilichaam-microarray voor te bereiden, wordt deze in een bakje met PBS gedompeld om de nitrocellulose te bevochtigen; veeg daarna de glazen rand van de array af. Gebruik hiervoor Kim wipes en zorg ervoor dat het nitrocellulosegedeelte niet wordt aangeraakt. Plaats de microarray in een bakje en pipetteer de celsuspensie op de nitrocellulose.

Een gelijkmatige verspreiding van de celsuspensie zorgt ervoor dat alle antilichamen de potentie hebben om cellen vast te leggen. Incubeer de microarray gedurende één uur bij 37 °C. Tijdens de incubatie zullen verschillende cellen naar beneden drijven en in contact komen met de antilichamen op de array-cellen.

Het presenteren van oppervlakteantigenen die corresponderen met de antilichamen zal de cel na incubatie binden en vastleggen. Was de ongebonden cellen weg door de arrays voorzichtig onder te dompelen in drie opeenvolgende spoelingen van verse PPS. Fixeer de resterende cellen in een oplossing van 10% formaldehyd en PPS.

Pipette voorzichtig een ruime hoeveelheid fixeerder om de sectie met de nitrocellulose-load te bedekken. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Dip de microarrays vervolgens drie keer in verse PBS.

Laat de arrays 30 seconden in PBS weken bij elke wasbeurt, aangezien overschrijdende achtergrondruis de fluorescentie-multiplexing kan beïnvloeden. We kunnen nu controleren of er celbinding heeft plaatsgevonden door een microarray onder een lichtbron te houden voor een veel nauwkeurigere analyse. De DOT scan-scanner en analyse-software stellen ons in staat om het bindingspatroon te scannen en gekwantificeerde resultaten van antigeenexpressie in een gemengde celpopulatie te genereren.

De software vergelijkt de intensiteit van de celbinding met de achtergrondruis op een 8-bits grijswaardenrelaal. De intensiteitseenheden zijn genormaliseerd naar een maximale waarde van 256. Om de vergelijking tussen een array te vergemakkelijken, wordt elke positieve binding van isotype-controles afgetrokken van de antilichamen met de overeenkomstige IG-isotypen.

Voeg 200 µL blokkeringsbuffer toe aan de microarray en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Ter voorbereiding op fluorescentie-multiplexing worden 10 µL geconjugeerde CD3 en 20 µL Alexa-geconjugeerde EPAM toegevoegd aan 118 µL blokkeringsbuffer. Daarnaast worden twee µL hitte-geïnactiveerd serum aan het mengsel toegevoegd om aspecifieke binding te voorkomen.

Zodra het blokkeren is voltooid, wordt de blokkeringsbuffer vervangen door een multiplexoplossing en wordt deze gedurende 30 minuten in het donker geïncubeerd. Tijdens de incubatie bij kamertemperatuur zullen CD3-geconjugeerde antilichamen binden aan CD3-expresserende T-cellen die aan de array zijn gebonden, terwijl het EPAM-geconjugeerde antilichaam zal binden aan epitheelcellen of colorectale kankercellen op de array. Was vervolgens de microarray drie keer met verse PBS en laat ze in het donker drogen voordat ze worden gescand op fluorescentie.

Fluorescentie wordt gedetecteerd met een Typhoon FLA 9.000 scanner. Het FICO-profiel wordt gescand met een 523 nanometer laser en een 580 BP 30 emissiefilter; Alexa 647 wordt gescand met een 633 nanometer laser en een 670 BP 30 emissiefilter. De resulterende fluorescentiebeelden worden geconverteerd naar tiff-formaat voor analyse.

Met gebruik van DOT-scansoftware. Fluorescent multiplexing stelt ons in staat om antigeenprofielen van verschillende celpopulaties binnen hetzelfde weefselmonster te onderscheiden. De hier getoonde afbeeldingen zijn afkomstig van een colorectaal carcinoommonster.

Deze drie afbeeldingen tonen een optische scan, een fluorescentiescan voor CD3-expresserende cellen en een fluorescentiescan voor EPAM-expresserende cellen. De resultaten van de DOT-scan microray moeten consistente celbindingspatronen laten zien tussen de twee duble diatashapes. Intense alignment dot-binding langs de rand van de slide wijst erop dat er voldoende hoeveelheden cellen zijn vastgelegd.

Er kan een PDF-rapport worden gegenereerd om kwantitatieve waarden voor celbinding te verkrijgen. De staafgrafiek die de celbinding weergeeft, toont een verschil in antigeenexpressie tussen de normale mucosa en het tumormonster.

De optische resultaten gaven een algemene weergave van de antigeenexpressie op alle celtypen binnen het monster, terwijl de AAM-multiplexresultaten een duidelijker beeld geven van het verschil in antigeenexpressie tussen normale epitheelcellen en kankercellen. Hoewel veel van de differentieel tot expressie gekomen antigenen als groep bekende biomarkers voor colorectaal carcinoom zijn, bieden ze een veel nauwkeurigere ziektehandtekening voor stratificatie dan enig enkelvoudige biomarker ooit zou kunnen bereiken. De CD3-multiplexresultaten tonen meer T-cellen in het kankermonster vergeleken met het normale monster.

Vaak brengen de kankercellen van T-cellen activatiemarkers tot expressie, wat de mogelijkheid geeft dat deze T-cellen tumor-infiltrerende lymfocyten of ontsteking-geassocieerde T-cellen zijn. Grootschalige analyse kan worden uitgevoerd met multi experiment viewer versie 4.4, een open-source software voor heat maps en data-analyse. Hiërarchische clustering van colorectale kankersamples kan worden gebruikt om te correleren met het ziektestadium of de prognose van de patiënt.

Een uitgebreide bibliotheek met ziektekenmerken is een waardevol hulpmiddel bij de prognosevoorspelling bij patiënten met colorectaal carcinoom of bij het bepalen van het verloop van de postoperatieve behandeling. We hebben zojuist de procedure gedemonstreerd voor het profileren van de expressie van oppervlakteantigenen in een gemengde celpopulatie in colorectaal carcinoomweefsel met behulp van de DOT scan antilichaam-microarray en fluorescentie-multiplexing. Een belangrijk aspect van dit experiment om te onthouden, is dat er altijd vers weefsel moet worden gebruikt en dat er ten minste 4 miljoen levensvatbare cellen nodig zijn om dit experiment te laten slagen. Bedankt voor het bekijken van deze video en veel succes met uw experimenten.