Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen
31 oktober 2011
Dit artikel geeft de protocollen van de intrinsieke optische signalen en flavoproteins autofluorescentie signalen beeldvorming in kaart geur-opgeroepen activiteiten op het oppervlak van het reukorgaan in muizen.
Het algemene doel van dit experiment is om geur-geëvoegde activiteiten op het oppervlak van de reukbol van muizen in kaart te brengen met behulp van intrinsieke optische signalen en autofluorescente flavoproteïnesignalen of FAS-beeldvorming nadat de muis is verdoofd en de schedel is blootgesteld. Het bot boven de reukbol wordt verdund. Een botflap wordt getekend met de punt van een scalpelmes en vervolgens verwijderd. Er wordt een kamer gemaakt van tandcement en omringt het blootgestelde oppervlak van de reukbol.
Het is gevuld met aros en een dekglas wordt op deze voorbereiding geplaatst. Reukkaarten worden sequentieel verkregen in dezelfde muis met behulp van intrinsieke optische signalen en FAS-beeldvorming. Het beeldvormen van andere geëvoegde activiteiten in de reukbol van de muis met behulp van optische reflectie en autofluorescente signalen kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de speciale coating van bestellingen in de reukbol. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals twee doxy glucose beeldvorming of FMRI is dat het mogelijk maakt om order geëvoegde activiteiten op te nemen met een speciale resolutie van een enkele glamourlijst.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methoden aan het begin van hun werk moeilijkheden ondervinden omdat zowel chirurgische als instrumentele vaardigheden langzaam te verwerven zijn. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal om de aandacht te vestigen op de cruciale stappen van de chirurgische en beeldvormingsprocedures. Knijp in de achterste poot van de muis om de verdoving te bevestigen en verwijder het haar van de hoofdhuid met behulp van een haartrimmer.
Veeg eventueel overgebleven haar van de huid met steriel gaas gedrenkt in gedestilleerd water. Plaats de muis in het stereotaxische frame zodat de snuit zich in hetzelfde vlak bevindt als de achterkant van het hoofd. Om de reukbol horizontaal te positioneren, moet u de oor- en neusstaven stevig bevestigen om beweging te voorkomen.
Breng ooglijmiddel aan op de ogen om uitdroging tijdens de beeldvorming te voorkomen en desinfecteer vervolgens het hoofdhuidgebied met Betadine met behulp van steriele schaar. Maak een insnijding aan de achterkant van het hoofd tussen de oren, snijd vervolgens aan beide kanten naar de basis van het oor en in de voor-achterrichting naar het voorhoofd langs de oogleden. Voltooi het verwijderen van de hoofdhuid door de huid op de snuit door te snijden.
Gebruik de neusstaaf als gids. Plaats het dier onder een stereomicroscoop en gebruik een wattenstaafje gedrenkt in fysiologisch zout om het periosteum op de bovenkant van de schedel voorzichtig los te maken. Gebruik een paar pincetten om het resterende weefsel te verwijderen en schraap het oppervlak van de schedel met een scalpel om een schone voorbereiding te garanderen om het gebied van de reukbol gedurende het hele experiment vochtig te houden.
Plaats een stuk absorberbaar gelatine, spons gedrenkt in gedestilleerd water op het bot boven de reukbol tussen de ogen. Verwijder de gelatinespons en begin met voorzichtig schrabben van het bot met een scalpelmes nummer 10. Houd een constante hoek van 45 graden tussen het mes en het bot en beweeg het mes van de oogleden naar de sagittale kant van het bulbgebied.
Wees voorzichtig om geen verticale druk op het bot uit te oefenen of het bot boven de veneuze sinus te krabben tijdens het verdunningsproces. Stop elke vijf minuten en plaats een gehydrateerde gelatinespons op het bot om de voorbereiding af te koelen. Veeg de schedel met het sponsje om bot, stof te verwijderen en veeg periodiek het uiteinde van het scalpel om het schoon en scherp te houden.
Ga door totdat de sponsachtige botlaag of trabecula zichtbaar is. Wanneer de fijne vaat van de reukbol zichtbaar is, stop met het krabben van het bot en gebruik de punt van een nummer 11 scalpel om een rechthoekig gebied te tekenen en de reukbol te sluiten. Houd het raam binnen de grenzen van de veneuze sinussen en ga door met het krabben van het bot binnen het rechthoekige gebied.
Wees extra voorzichtig met de diepte van de punt van het scalpel om de dura-oppervlakte niet aan te raken. Om een idee te krijgen van de dikte van het resterende bot, duwt u het voorzichtig met de punt van een para-pincet. Als het bot onder druk buigt, gaat u naar de volgende stap.
Voeg een druppel fysiologisch zout toe en gebruik de punt van het scalpel horizontaal georiënteerd om het botflapje op te tillen. Verwijder voorzichtig de flap met pincetten om te voorkomen dat het resterende bot afscheurt. Zodra het oppervlak van de reukbol is blootgelegd, controleert u op afwezigheid van bloedingen of bloedvaten. Anastomose.
Veeg het gebied schoon met een gelatinespons gedrenkt in fysiologisch zout. Om de reukbol vochtig te houden, brengt u poly acrylaat tandcement aan met behulp van een 29 gauge spuit om een putje op het bot rond het schedelvenster te vormen. Plaats een druppel laagsmeltend aros over de dura en plaats een steriele dekglas over het schedelvenster voor beeldvorming.
Plaats het stereotaxische frame onder de stereomicroscoop met het schedelvenster gecentreerd in het gezichtsveld om de haarvaten in beeld te brengen. Schakel naar groen licht van 580 nanometer en maak een anatomisch controlebeeld om de staat van de voorbereiding tijdens de beeldvorming te controleren. Ga vervolgens door met het vastleggen van de stimulatieproeven met behulp van ofwel intrinsieke optische signaalbeeldvorming onder 630 nanometer verlichting of flavoproteïne autofluorescente signaalbeeldvorming Onder 480 nanometer verlichting. Een standaard beeldvormingssessie omvat een basislijn van vijf tot tien seconden waarbij alleen lucht wordt aangeleverd, gevolgd door de geurstimulatie gedurende drie tot tien seconden, afhankelijk van de gekozen geurconcentratie.
En tenslotte wordt 70 tot 82 seconden luchttoevoer geregistreerd voor basislijnherstel. Hierbij wordt de vaat van de reukbol beeldvormd via het schedel
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het in beeld brengen van intrinsieke optische signalen en autofluorescentiesignalen van flavoproteïnen om geur-evoqueerde activiteiten op het oppervlak van de bulbus olfactorius bij muizen in kaart te brengen. De beschreven methoden maken resolutie-rijke beeldvorming van de activiteit in de bulbus olfactorius mogelijk, wat inzicht biedt in de neurale mechanismen van reuk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Olfactorische verwerking
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de olfactorische verwerking is cruciaal voor inzichten in zintuiglijke perceptie.
- Beeldvormingstechnieken zoals intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie zijn waardevol voor het bestuderen van hersenactiviteit.
- Het in kaart brengen van geurevokeerde activiteiten kan de ruimtelijke organisatie van zintuiglijke reacties onthullen.
- Bestaande methoden kunnen de resolutie missen die nodig is voor gedetailleerde analyse.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het in kaart brengen van geur-opgewekte activiteiten in de olfactory bulb.
- Het gebruikmaken van intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie voor hoge-resolutie imaging.
- Het aantonen van de voordelen van deze imagingtechnieken ten opzichte van traditionele methoden.
Gebruikte methoden
- Muizen worden geanestheseerd en voorbeid voor beeldvorming door de bulbus olfactorius bloot te leggen.
- Het bot boven de bulbus olfactorius wordt uitgedund om beeldvorming mogelijk te maken.
- Sequentiële beeldvorming legt responsen op geurstimulatie vast met behulp van zowel intrinsieke optische signalen als flavoproteïne-autofluorescentie.
- Beeldvormingssessies bevatten baseline- en geurstimulatiefases om opgewekte activiteiten te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Door geuren opgewekte activiteiten worden gevisualiseerd als gebieden van absorptie en autofluorescentie.
- De resultaten tonen duidelijke activatiepatronen als reactie op verschillende geuren.
- Beide beeldvormingstechnieken bieden complementaire informatie over de activiteit van de reukbol.
- Een hoge ruimtelijke resolutie maakt gedetailleerde mapping van sensorische responsen mogelijk.
Conclusies
- De ontwikkelde protocollen maken een effectieve mapping van de activiteit in de bulbus olfactorius mogelijk.
- Intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie zijn krachtige instrumenten voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methoden kunnen ons begrip van de sensorische verwerking in de hersenen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het in kaart brengen van geur-opgewekte neurale activiteit in de bulbus olfactorius ondersteunt de validatie van targets bij de ontdekking van neurowetenschappelijke geneesmiddelen door de visualisatie mogelijk te maken van functionele neurale circuits die betrokken zijn bij sensorische verwerking. Deze benadering biedt mechanische risicovermindering voor verbindingen die gericht zijn op olfactorische paden of aanverwante neurologische aandoeningen door moleculaire interventies te koppelen aan meetbare veranderingen in neurale activatiepatronen. De techniek verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door een ziekterelateerd systeem te bieden om target-engagement en effecten op circuitniveau te beoordelen voorafgaand aan fenotypische screening.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door geur-geïnduceerde activatiepatronen in glomeruli te visualiseren als functionele modules van sensorische verwerking.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van de betrokkenheid van neurale circuits als reactie op sensorische stimuli.
- Predictieve waarde: Faciliteert portfolio-triage door target-modulatie te koppelen aan meetbare veranderingen in ruimtelijke activatiekaarten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door basislijn- en geëvoceerde activiteitsprofielen in de bulbus olfactorius vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via sequentiële beeldvorming van intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie onder gecontroleerde stimulatie.
- Schaalbaarheid: Benadrukt het hergebruik van het platform over verschillende stimulatieproeven en geurstoffen om betrouwbare evaluatie van verbindingen in de sensorische neurowetenschappen mogelijk te maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziekten door activatiepatronen van de bulbus olfactorius te koppelen aan sensorische verwerkingspaden die relevant zijn voor neurologische aandoeningen.
- Mechanistische risicoreductie: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door neurale responsen in kaart te brengen die doelwitgemedieerde veranderingen in de hersenactiviteit reflecteren.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt besluitvorming door kwantitatieve ruimtelijke read-outs te verschaffen die correleren met functionele uitkomsten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetesten in de vroege ontdekkingsfase tot lead-identificatie en preklinische validatie, door read-outs van neurale activiteit te leveren die bijdragen aan de zekerheid over het target en het mechanistische begrip.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie ondersteunt door de geur-evokeerde activering in glomeruli te visualiseren.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve outputs via sequentiële baseline- en stimulatie-imaging met gebruik van 630 nm en 480 nm verlichting.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals veranderingen in absorptie (intrinsieke optische signalen) en autofluorescentie-emissie (flavoproteïnesignalen) die vergelijking van neurale activering tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door activeringspatronen van de bulbus olfactorius te koppelen aan sensorische verwerkingspaden die relevant zijn voor therapeutische targeting.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor longitudinale studies en cross-compound vergelijkingen binnen hetzelfde preparaat.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets en vermindering van mechanistische ambiguïteit in sensorische verwerkingspaden.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van neurale activiteitsmapping over verschillende proeven en proefpersonen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een late fase binnen neurowetenschappelijke programma's.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van neurale activatiedrempels en ruimtelijke patronen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in neurowetenschappen, chirurgische preparatie en optische beeldvormingstechnieken.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een stereotaxisch frame, stereomicroscoop, lichtbronnen bij 580 nm, 630 nm en 480 nm, en systemen voor beeldacquisitie.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor chirurgische preparatie, anesthesiediepte en beeldvormingsparameters over verschillende laboratoria heen.
- Overwegingen voor adaptatie over modelsystemen heen, waarbij de huidige toepassing in de bulbus olfactorius van muizen wordt vermeld, met potentieel voor uitbreiding naar andere sensorische regio's.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal: onvermogen om olfactorische kaarten te visualiseren in vrij bewegende muizen en beperkte fotonpenetratie die de toegang tot ventrale olfactorische glomeruli beperkt.
