Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen
31 oktober 2011
Dit artikel geeft de protocollen van de intrinsieke optische signalen en flavoproteins autofluorescentie signalen beeldvorming in kaart geur-opgeroepen activiteiten op het oppervlak van het reukorgaan in muizen.
Het algemene doel van dit experiment is om geur-geëvoegde activiteiten op het oppervlak van de reukbol van muizen in kaart te brengen met behulp van intrinsieke optische signalen en autofluorescente flavoproteïnesignalen of FAS-beeldvorming nadat de muis is verdoofd en de schedel is blootgesteld. Het bot boven de reukbol wordt verdund. Een botflap wordt getekend met de punt van een scalpelmes en vervolgens verwijderd. Er wordt een kamer gemaakt van tandcement en omringt het blootgestelde oppervlak van de reukbol.
Het is gevuld met aros en een dekglas wordt op deze voorbereiding geplaatst. Reukkaarten worden sequentieel verkregen in dezelfde muis met behulp van intrinsieke optische signalen en FAS-beeldvorming. Het beeldvormen van andere geëvoegde activiteiten in de reukbol van de muis met behulp van optische reflectie en autofluorescente signalen kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de speciale coating van bestellingen in de reukbol. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals twee doxy glucose beeldvorming of FMRI is dat het mogelijk maakt om order geëvoegde activiteiten op te nemen met een speciale resolutie van een enkele glamourlijst.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methoden aan het begin van hun werk moeilijkheden ondervinden omdat zowel chirurgische als instrumentele vaardigheden langzaam te verwerven zijn. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal om de aandacht te vestigen op de cruciale stappen van de chirurgische en beeldvormingsprocedures. Knijp in de achterste poot van de muis om de verdoving te bevestigen en verwijder het haar van de hoofdhuid met behulp van een haartrimmer.
Veeg eventueel overgebleven haar van de huid met steriel gaas gedrenkt in gedestilleerd water. Plaats de muis in het stereotaxische frame zodat de snuit zich in hetzelfde vlak bevindt als de achterkant van het hoofd. Om de reukbol horizontaal te positioneren, moet u de oor- en neusstaven stevig bevestigen om beweging te voorkomen.
Breng ooglijmiddel aan op de ogen om uitdroging tijdens de beeldvorming te voorkomen en desinfecteer vervolgens het hoofdhuidgebied met Betadine met behulp van steriele schaar. Maak een insnijding aan de achterkant van het hoofd tussen de oren, snijd vervolgens aan beide kanten naar de basis van het oor en in de voor-achterrichting naar het voorhoofd langs de oogleden. Voltooi het verwijderen van de hoofdhuid door de huid op de snuit door te snijden.
Gebruik de neusstaaf als gids. Plaats het dier onder een stereomicroscoop en gebruik een wattenstaafje gedrenkt in fysiologisch zout om het periosteum op de bovenkant van de schedel voorzichtig los te maken. Gebruik een paar pincetten om het resterende weefsel te verwijderen en schraap het oppervlak van de schedel met een scalpel om een schone voorbereiding te garanderen om het gebied van de reukbol gedurende het hele experiment vochtig te houden.
Plaats een stuk absorberbaar gelatine, spons gedrenkt in gedestilleerd water op het bot boven de reukbol tussen de ogen. Verwijder de gelatinespons en begin met voorzichtig schrabben van het bot met een scalpelmes nummer 10. Houd een constante hoek van 45 graden tussen het mes en het bot en beweeg het mes van de oogleden naar de sagittale kant van het bulbgebied.
Wees voorzichtig om geen verticale druk op het bot uit te oefenen of het bot boven de veneuze sinus te krabben tijdens het verdunningsproces. Stop elke vijf minuten en plaats een gehydrateerde gelatinespons op het bot om de voorbereiding af te koelen. Veeg de schedel met het sponsje om bot, stof te verwijderen en veeg periodiek het uiteinde van het scalpel om het schoon en scherp te houden.
Ga door totdat de sponsachtige botlaag of trabecula zichtbaar is. Wanneer de fijne vaat van de reukbol zichtbaar is, stop met het krabben van het bot en gebruik de punt van een nummer 11 scalpel om een rechthoekig gebied te tekenen en de reukbol te sluiten. Houd het raam binnen de grenzen van de veneuze sinussen en ga door met het krabben van het bot binnen het rechthoekige gebied.
Wees extra voorzichtig met de diepte van de punt van het scalpel om de dura-oppervlakte niet aan te raken. Om een idee te krijgen van de dikte van het resterende bot, duwt u het voorzichtig met de punt van een para-pincet. Als het bot onder druk buigt, gaat u naar de volgende stap.
Voeg een druppel fysiologisch zout toe en gebruik de punt van het scalpel horizontaal georiënteerd om het botflapje op te tillen. Verwijder voorzichtig de flap met pincetten om te voorkomen dat het resterende bot afscheurt. Zodra het oppervlak van de reukbol is blootgelegd, controleert u op afwezigheid van bloedingen of bloedvaten. Anastomose.
Veeg het gebied schoon met een gelatinespons gedrenkt in fysiologisch zout. Om de reukbol vochtig te houden, brengt u poly acrylaat tandcement aan met behulp van een 29 gauge spuit om een putje op het bot rond het schedelvenster te vormen. Plaats een druppel laagsmeltend aros over de dura en plaats een steriele dekglas over het schedelvenster voor beeldvorming.
Plaats het stereotaxische frame onder de stereomicroscoop met het schedelvenster gecentreerd in het gezichtsveld om de haarvaten in beeld te brengen. Schakel naar groen licht van 580 nanometer en maak een anatomisch controlebeeld om de staat van de voorbereiding tijdens de beeldvorming te controleren. Ga vervolgens door met het vastleggen van de stimulatieproeven met behulp van ofwel intrinsieke optische signaalbeeldvorming onder 630 nanometer verlichting of flavoproteïne autofluorescente signaalbeeldvorming Onder 480 nanometer verlichting. Een standaard beeldvormingssessie omvat een basislijn van vijf tot tien seconden waarbij alleen lucht wordt aangeleverd, gevolgd door de geurstimulatie gedurende drie tot tien seconden, afhankelijk van de gekozen geurconcentratie.
En tenslotte wordt 70 tot 82 seconden luchttoevoer geregistreerd voor basislijnherstel. Hierbij wordt de vaat van de reukbol beeldvormd via het schedel
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het beeldvormen van intrinsieke optische signalen en flavoproteïne autofluorescentiesignalen om geur-geïnduceerde activiteiten aan het oppervlak van de reukbol bij muizen in kaart te brengen. De beschreven methoden maken hoge resolutie beeldvorming van reukbolactiviteit mogelijk en geven inzicht in de neurale mechanismen van reuk.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Reukverwerking
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van reukverwerking is cruciaal voor inzicht in sensorische perceptie.
- Beeldvormingstechnieken zoals intrinsieke optische signalen en flavoproteïne autofluorescentie zijn waardevol voor het bestuderen van hersenactiviteit.
- Het in kaart brengen van geur-geïnduceerde activiteiten kan de ruimtelijke organisatie van sensorische reacties onthullen.
- Bestaande methoden missen mogelijk de resolutie die nodig is voor gedetailleerde analyse.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het in kaart brengen van geur-geïnduceerde activiteiten in de reukbol.
- Om intrinsieke optische signalen en flavoproteïne autofluorescentie te gebruiken voor hoge resolutie beeldvorming.
- Om de voordelen van deze beeldvormingstechnieken ten opzichte van traditionele methoden te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Muizen worden verdoofd en voorbereid voor beeldvorming door de reukbol bloot te leggen.
- Het bot boven de reukbol wordt verdund om beeldvorming mogelijk te maken.
- Sequentiële beeldvorming legt reacties op geurstimulatie vast met behulp van zowel intrinsieke optische signalen als flavoproteïne autofluorescentie.
- Beeldvormingssessies omvatten baseline- en geurstimulatiefasen om geïnduceerde activiteiten te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Geur-geïnduceerde activiteiten worden gevisualiseerd als gebieden van absorptie en autofluorescentie.
- Resultaten tonen verschillende activeringspatronen in reactie op verschillende geuren.
- Beide beeldvormingstechnieken leveren complementaire informatie over reukbolactiviteit.
- Hoge ruimtelijke resolutie maakt gedetailleerde in kaart brenging van sensorische reacties mogelijk.
Conclusies
- De ontwikkelde protocollen maken effectieve in kaart brenging van reukbolactiviteit mogelijk.
- Intrinsieke optische signalen en flavoproteïne autofluorescentie zijn krachtige tools voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methoden kunnen ons begrip van sensorische verwerking in de hersenen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Mapping odor-evoked neural activity in the olfactory bulb supports target validation in neuroscience drug discovery by enabling visualization of functional neural circuits involved in sensory processing. This approach provides mechanistic de-risking for compounds targeting olfactory pathways or related neurological disorders by linking molecular interventions to measurable changes in neural activation patterns. The technique enhances predictive confidence in early discovery by offering a disease-relevant system to assess target engagement and circuit-level effects prior to phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing odor-evoked activation patterns in glomeruli as functional modules of sensory processing.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of neural circuit engagement in response to sensory stimuli.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking target modulation to measurable changes in spatial activation maps.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and evoked activity profiles in the olfactory bulb.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sequential imaging of intrinsic optical signals and flavoprotein autofluorescence under controlled stimulation.
- Scalability: Highlights platform reuse across stimulation trials and odorants to enable reliable compound evaluation in sensory neuroscience.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to neurological disorders.
- Mechanistic De-risking: Describes continuity from discovery through preclinical validation by mapping neural responses that reflect target-mediated changes in brain activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by providing quantitative spatial readouts that correlate with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation by providing neural activity readouts that inform target confidence and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by visualizing odor-evoked activation in glomeruli.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through sequential baseline and stimulation imaging using 630 nm and 480 nm illumination.
- Analytics: Highlights measurements such as absorbance changes (intrinsic optical signals) and autofluorescence emission (flavoprotein signals) that enable comparison of neural activation across conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to therapeutic targeting.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for longitudinal studies and cross-compound comparison in the same preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in sensory processing pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of neural activity mapping across trials and subjects.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neuroscience programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on neural activation thresholds and spatial patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neuroscience, surgical preparation, and optical imaging techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including stereotaxic frame, stereo microscope, light sources at 580 nm, 630 nm, and 480 nm, and image acquisition systems.
- Cross-team standardization requirements for surgical preparation, anesthesia depth, and imaging parameters across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, noting current application in mouse olfactory bulb with potential for extension to other sensory regions.
- Practical limitations supported by source material: inability to visualize olfactory maps in freely moving mice and limited photon penetration restricting access to ventral olfactory glomeruli.
