Name: Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer hoe je geur-opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius in kaart brengt met intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie. Deze technieken bieden hoge ruimtelijke resolutie voor gedetailleerde neurale beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het &quot;Agence Nationale de la Recherche &#39;te verlenen ANR-09-JCJC-0117-01 en&#39; Neuropôle de Recherche Francilien-NERF&quot; subsidie ​​voor Romain Chery. Wij danken Françoise Lefebvre voor de software ontwikkeling in C + + / Qt, en Laurent Pinot en Batiste Janvier voor hulp in de ontwikkeling van de optische beeldvorming setup.

1. De voorbereiding van het dier voor beeldvorming (volgens de Europese aanbevelingen voor de zorg en het gebruik van proefdieren, 86/609/EEG richtlijn) <ol><li> 6 tot 8 weken oud C57Bl6 mannelijke muizen worden verdoofd met een cocktail van ketamine (10mg/kg) en xylazine (100mg/kg) intraperitonealy geïnjecteerd. Operatie begint wanneer de muis niet meer reageert op achterpoot knijpen. Gedurende het hele experiment is het dier op een verwarmings-pad. Lichaamstemperatuur is continu bewaakt en gehandhaafd op 37 ° C. Diepte van de anesthesie is gedurende de gehele operatie en imaging sessie door het controleren van de afwezigheid van ledematen te trekken. Een subcutane injectie van 20% van de initiële narcose cocktail is anders toegediend. </li><li> Met behulp van klippers, verwijder het haar van de hoofdhuid. Reinig de blootgestelde huid van de resterende haren met behulp van steriel gaas gedrenkt met een zoutoplossing. </li><li> Plaats de muis in de stereotaxisch frame. De snuit moet in hetzelfde vlak als de achterkant van het hoofd,om de oppervlakte van de bulbus olfactorius ingesteld op de horizontale. Secure stevig het oor en neus bars om bewegingen te voorkomen tijdens de beeldvorming. </li><li> Toe te passen oogzalf op de ogen van de dieren aan het drogen en pijn te voorkomen. </li><li> Desinfecteer alle chirurgische instrumenten met 70 ° ethanol en de hoofdhuid met opeenvolgende bochten van betadine. </li><li> Op de huid over de schedel te verwijderen, te beginnen door het maken van een incisie in de huid met een schaar aan de achterkant van het hoofd tussen de oren. Snij vervolgens aan beide kanten naar de basis van het oor en in de achterwaartse richting naar het voorhoofd langs de oogleden. Finish het verwijderen van de hoofdhuid door het snijden van de huid op de top van de snuit dicht bij de neus bar. </li><li> Onder binoculaire waarneming, gebruik dan een wattenstaafje gedrenkt met zoutoplossing om het periost zachtjes los op de top van de schedel. Gebruik een pincet om de resterende weefsel te verwijderen en het oppervlak van de schedel schrapen met een scalpel een schone voorbereiding te hebben. </li><li>De OB is een symmetrische structuur bestaat uit twee hemibulbs die gelegen zijn tussen de oogleden. Ze zijn beperkt in de rostrale en in de caudale richting door een veneuze sinus, en gescheiden door de pijlnaad. Leg een stukje van absorbeerbare gelatine spons doordrenkt met gedestilleerd water op het bot boven de OB. Het is belangrijk om dit bot gebied vochtig gedurende het experiment. </li></ol> 2. Voorbereiden van de craniale venster <ol><li> Haal de gelatine spons en beginnen met het voorzichtig schrapen het bot met n ° 10 scalpel. Houd een constante hoek van 45 ° tussen het blad en het bot, en verplaats het blad van de oogleden aan de sagittale kant van de bollenstreek. Doen verticale druk niet van toepassing op het bot of krassen op het bot boven de veneuze sinus. </li><li> Tijdens het proces dunner, stop elke 5min en plaats een gehydrateerd gelatine spons op het bot af te koelen van de voorbereiding. Wattenstaafje de schedel met de spons aan het bot stof te verwijderen. </li><li> Houden vegen enkoeling als alternatief tot het visualiseren van de trabekels, de sponsachtige bot laag. De fijne bloedvaten van de OB moet zichtbaar zijn in dit stadium. Stop krassen op het bot, en start met de scalpel van de tip loodrecht op "tekenen" een rechthoekig gebied omsluiten van de OB. In dit stadium n ° 11 scalpel kan worden gebruikt. Houd de operatie binnen de grenzen van de veneuze sinussen die moeten worden veilig van een scalpel een beroerte. </li><li> Dig geleidelijk de gevormde rechthoekige sleuf door gebruik te maken opeenvolgende bewegingen van de scalpel. Veeg de tip van de scalpel periodiek aan het schoon en houd het scherp. Wees extra voorzichtig met de diepte van de tip om te voorkomen dat het aanraken van de dura oppervlak. </li><li> Om een ​​gevoel van de dikte van het resterende bot te krijgen, duw hem met de punt van een pincet. Als het bot flap plooien onder druk, ga dan naar de volgende stap. </li><li> Onder een druppel zoutoplossing, horizontaal gebruik maken van de tip van de scalpel gericht op tillen het bot flap. Het verwijderen van de klep gedaan moet worden carefully om te vermijden dat de resterende bot. </li><li> Zodra de OB het oppervlak is blootgesteld, te controleren op de afwezigheid van bloeden of bloedvaten anastomose. Verwonden van de dura of het weefsel oppervlak zal verminderen de kans op het verkrijgen van optische signalen. Veeg het gebied met een gelatine spons gedrenkt in een zoutoplossing om de lamp vochtig te houden. </li><li> Van toepassing zijn polyacrylaat tandheelkundig cement om een ​​goed formulier op het bot rondom het raam. </li><li> Breng een druppel laag smeltpunt agarose (1,2%) over de dura, en zet een steriele dekking van glas op de afmetingen van het venster. Tijdens de opnamesessie, kan een kleine hoeveelheid van de agarose worden toegevoegd, om de uitdroging te compenseren. Agarose wordt voorkomen dat de OB te bewegen met de ademhaling en een plat oppervlak voor optische beeldvorming te bieden. </li></ol> 3. Optische beeldvorming setup voor reuk-activiteit in kaart brengen van <ol><li> De olfactorische stimulatie moet nauwkeurig zijn omschreven in de tijd en de intensiteit van het gebruik van een olfactometer. We maken gebruik van een aangepaste aangepaste versie van multivial perfusie-systeem Valvebank 8II van Automatiseer Scientific geassocieerd met een eenvoudige luchtcompressor (gecomprimeerde ademlucht geschikt zou zijn als ook). Dit systeem zorgt voor accurate en snelle externe klep te controleren. Oplossingen van pure geurende worden verdund in minerale olie op de gekozen concentratie. Het activeren van de dorsale OB aldehyden, zoals hexanal worden vaak gebruikt. Een exacte volume van de verdunde odorant (20 tot 50μl) is geladen op een filtreerpapier en geplaatst in een spuit reservoir. Door de perfusie-systeem, wordt de druk geregeld lucht geleverd aan het systeem, zorgt voor een constante snelheid van geodoriseerde lucht flux levering aan het dier neus tijdens de opening van de afsluiter. Geurstof wordt geleverd door middel van een Tygon R-3603 Vacuum Tubing (Saint-Gobain Corporation) die de lucht bij een debiet van ~ 1000ml/min. Vermijd besmetting tussen geur-en residuele hoeveelheden van geurende in de slang. Indien beschikbaar, kan de reproduceerbaarheid van de geurstof stimulus te controgelogen door het gebruik van een vlam ionisatie detector (microFID 2020 Photovac). </li><li> De optische opstelling is ingeschakeld. Het bestaat uit een gekoelde interlaced 12 bits CCD-camera (ORCA AG Hamamatsu) geassocieerd met een fluorescentie stereomicroscoop (Leica MZ16), een computergestuurde olfactometer en gestabiliseerd excitatie-lampen met de juiste bandpass interferentie filters. Een regeling beschrijft onze opstelling wordt gegeven in figuur 2. Voor Intrinsieke optische signalen Imaging (IOSI), een 200W halogeen lamp (Oriel QTH) gekoppeld aan een fiber ring licht (Schott) aangesloten rond de microscoop doel worden gebruikt om stabiele en gelijkmatige verlichting te bieden. Voor Flavoprotein autofluorescentie Signals Imaging (fasi), een 150 W metaal halide lamp (Leica) met een 5mm kern vloeibaar lichtgeleider voorzien in een nog gelokaliseerd excitatie van de fluorescentie door de epi-verlichting poort van de stereomicroscoop. Beeldacquisitie en hardware synchronisatie worden gerealiseerd door aangepaste software. De open source software micromanager kan ook worden gebruikt om de optische opstelling en acquisitie controle. </li></ol> 4. Optische beeldvorming <ol><li> Plaats de stereotaxisch frame onder de stereomicroscoop, de craniale raam in het midden van het gezichtsveld (zie Fig. 2A voor een schematische voorstelling van de optische opstelling). </li><li> Stem de microscoop te richten op de haarvaten. Voorafgaand aan stimulatie onderzoeken (zie beschrijving in 5) een beeld van de lamp is genomen in het kader 560nm (groen) licht (fiber ring), die een goed contrast voor de bloedvaten beeldvorming biedt. Dit beeld wordt gebruikt als een anatomische controle om de stand van de voorbereiding te controleren en is verworven meerdere malen tijdens het experiment. </li><li> Voor IOS beeldvorming, het gereflecteerde licht intensiteit is opgenomen door de CCD-camera onder 630 + / -10 nm (rood) verlichting. De beelden werden op full frame (geen binning) met 5 frames per seconde, die overeenkomen met een belichtingstijd van ongeveer 150 ms. Vermogen van de lichtbron wordt aangepast aan re ach grijswaarden van ten minste ~ 3000 op de OB gebied, dicht bij de verzadiging van de CCD pixels putten. Daarmee maakt het mogelijk om gebruik te maken van de 12bits dynamiek van de CCD te zwakke intensiteit veranderingen tijdens de activering vast te leggen. Maximum IOS amplitudes te bereiken ~ 1%. </li><li> Voor FAS imaging fluorescentie is verworven in het kader excitatie van 480Nm + /-20nm (blauw) epiflurorescence licht. Een high-pass filter op 515 Nm is ingesteld om licht te vangen. De beelden werden op 5 frames per seconde met een binning van 4 bij 4 om de gevoeligheid te maximaliseren. Excitatielicht vermogen wordt eveneens aangepast aan de IOS met grijze niveaus van 3000 op de OB-gebied. Maximum FAS amplitudes te bereiken ~ 3%. Voor beide beeldvormende modaliteiten, de diepte van het veld in het onderwerp vlak is hetzelfde en werd gemeten op 0,5 mm voor een vergroting van ongeveer 4 keer. </li><li> Lampje moet worden uitgeschakeld tussen de beeldvorming proeven om te voorkomen dat verwarming en fotobleken van het preparaat. </li></ol>le "&gt; 5. Imaging studies <ol><li> Standaard beeldvorming sessie omvatte een baseline van 5 tot 10 s waar alleen de lucht is uitgebracht, gevolgd door de geur stimulatie voor 3 tot 10s afhankelijk van de gekozen geur concentratie, en 70 tot en 82s zijn verder opgenomen met een constante luchtstroom voor baseline herstel (Fig. 2A). Aan het einde van de proef, is licht uitgeschakeld en zuivere lucht is geleverd voor de inter trial interval duur (1 tot 3 minuten) uit te spoelen resterende geurmoleculen en zintuiglijke gewenning te vermijden. Geur studies werden doorschoten met blanco trials (luchttoevoer). </li><li> Geur-opgeroepen geactiveerde zones worden gevisualiseerd als ruwweg bolvormige gebieden op de kaarten en afgestemd op de grootte van de individuele glomeruli (80 tot 200μm in diameter 9). Beeldverwerking wordt uitgelegd in figuur 2B. Olfactorische kaarten zijn weergegeven in figuur 3. Strijdig zijn met andere sensorische systeem, de signaal-ruis verhouding in de OB was voldoende om geur-geëvoceerde responsen op te lossen in enkele studies (Fig. 3B voor IOS en Fig. 3D voor FAS). </li><li> Muizen zijn direct geëuthanaseerd aan het einde van de beeldvormende bijeenkomst met behulp van methoden in overeenstemming met de Europese aanbevelingen voor de zorg en het gebruik van proefdieren. </li></ol> 6. Representatieve resultaten (zie de olfactorische kaarten in figuur 3): <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Structurele organisatie van de voornaamste reukorgaan in knaagdieren. Olfactorische sensorische neuronen, primaire zintuigcellen zich in het hoofdgebouw olfactorische epitheel, drukken dezelfde odorant receptor en samenkomen op dezelfde glomeruli in de OB. Olfactorische glomeruli, de ronde neuropils (gestippelde cirkels), bevinden zich aan de oppervlakte van de OB. Merk op dat een zeer dichte en complexe vasculaire netwerk is aanwezig op de glomerulaire niveau. Afkortingen (boven / beneden): ONL: reukzenuw laag; GL: glomerulaire laag, EPL: externe plexiform laag; MCL:mitralisklep cellaag, GCL: granule cell laag. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 reflectie en fluorescentie-signalen opnemen in vivo. A. Wide-field optische beeldvorming setup. De hersenen van een verdoofde muis is blootgesteld aan rood (IOS) of blauw (FAS) licht door ofwel een ringvormige fiber ring bevestigd aan de optiek lens of een epi-verlichting-poort van een microscoop. Geuren worden geladen in verzegelde flesjes en geodoriseerde lucht wordt geleverd aan het dier neus (groen licht: open ventiel). B. Opname protocol en verwerking van gegevens. IOS en FAS worden geboekt als reeks individuele studies (jaren '90 van de duur). Het diagram toont de tijdlijn van een enkele studie: baseline varieert van 5 tot 10s, stimulatie van 3 tot en met 10s, en keer terug naar de uitgangswaarde van 70 tot 82s. Beeldverwerking vereist pixel-voor-pixel aftrekken van de intensiteit waarden tijdens de baseline de intensiteit van de waarden tijdens periodes van stimulatie (voor FAS) or stimulatie plus weer tot de uitgangswaarde (voor IOS). Dit verschil wordt vervolgens gedeeld door baseline waarden om een variatie te krijgen in% (zie de resulterende beelden in Fig. 3). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Geur opgewekte activiteit van kaarten in de OB met behulp van IOS en FAS beeldvorming. A. vaatstelsel van de dorsale OB zichtbaar onder groen licht. BC. IOS afgebeeld (een onderzoek ten opzichte van drie trials gemiddeld respectievelijk) voor een 10s presentatie van 20% hexanal. Witte pijlen geven de bolvormige regio's van belang geactiveerd door deze geur. Deze activatie kaarten werden verkregen met behulp van de frames gemiddeld tijdens de eerste seconden na het einde van de geur stimulatie (maximaal reflectie variatie -0,63% in A en -0,52% in B). Let op de zwarte zones van absorptie waar de geur activering heeft plaatsgevonden. CD. FAS verworven opeenvolgend in dezelfde muis voor dezelfde geurstof (een onderzoek ten opzichte van drie gemiddeld trials respectievely). Deze activatie kaarten werden verkregen met behulp van de frames gemiddeld tijdens de eerste seconden na het begin van geur stimulatie (maximaal fluorescentie variatie +0.72% in D en +0.66% in E). Merk op dat de witte zones van autofluorescentie emissie aangegeven met zwarte pijlen overeen met de zwarte zones in IOS. De korrelige aspect gezien in de FAS kaart is te wijten aan de 4 bij 4 binning die nodig zijn voor de verbetering van de gevoeligheid. FAS beelden werden niet gecorrigeerd door autofluorescentie bleken. Werkelijke afmetingen van foto's BE: 0,7 mm breed x 1,2 mm lang.

<ol><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li>
<li>Chance, B., Cohen, P., J&246, bsis, &amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li>
<li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+549+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).</li>
<li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb%3A+domain+organization+and+odorant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).</li>
<li>Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+intrinsic+optical+signals+in+the+olfactory+bulb+are+coupled+to+glutamate+release+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake.</a> Neuron. 52, 335-345 (2006).</li>
<li>Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+diversity+in+an+odor+map+on+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb.</a> Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).</li>
<li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).</li>
<li>Meister, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+and+topography+in+an+odor+map+on+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).</li>
<li>Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+total+cerebral+hemoglobin+concentration%2C+oxygenation%2C+and+blood+flow+during+functional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation.</a> Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).</li>
<li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain%3A+insights+from+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Optics.+Express%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li>
<li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper). Photonics West Conference, , (2011).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

In dit artikel geven we IOS en FAS beeldvormingstechnieken voor in vivo-opnames van geur-opgeroepen de activiteiten in de muis OB. Om dit doel te bereiken een relatief eenvoudige en betaalbare wide-field optische beeldvorming setup nodig is. De overname van beeldgegevens vereist training om de fijne chirurgische ingrepen uit te voeren en voorkomen schade aan de dura of hersenweefsel. In het bijzonder zullen grote bloeden te absorberen fotonen opgenomen voor beeldvorming en uiteindelijk het experiment. Een voordeel van IOS en FAS beeldvorming is om te voorkomen dat de injectie van tl-tracers die zouden kunnen leiden in cellulaire toxiciteit of ongewenste neveneffecten. Ze maken het mogelijk om vragen over olfactorische kaarten dus ruimtelijke codering van zintuiglijke prikkels aan te pakken. In tegenstelling tot twee-deoxyglucose imaging, bieden ze de mogelijkheid om de afbeelding meerdere geuren in een enkel dier. Echter, omdat foton penetratie is beperkt in het weefsel, zijn IOS en FAS beperkt tot het dorsale deel van de OBen kunnen niet worden opgenomen van de ventrale regio&#39;s. Endogene optisch signaal imaging biedt uitstekende ruimtelijke resolutie voor in vivo beeldvorming. Technische verbeteringen betreffen kwantitatieve berekeningen van vasculaire componenten in de reflectie-signalen 8,9 en dynamiek van bloed-oxygenatie en volume tijdens de zintuiglijke activering 10. Meerdere golflengten beeldvorming van IOS imaging methoden zijn op dit moment ontwikkeld in ons laboratorium aan de totale hemoglobineconcentratie en zuurstofvoorziening in de OB volledig te kwantificeren tijdens de zintuiglijke activering. Deze spectroscopische optische metingen toegevoegd aan FAS beeldvorming geeft de mogelijkheid om de onopgeloste relatie tussen vasculaire en intracellulaire dynamiek te beantwoorden tijdens de zintuiglijke activering 11,12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van The Regent </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, type III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50G </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> Aldrich </td><td> 115606-100ML </td></tr></tbody></table>

imaging geur-opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie signalen

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In de hersenen activeert sensorische stimulatie verdeelde populaties van neuronen waaronder functionele modules die deelnemen aan de codering van de stimulus. Functionele optische beeldvorming technieken zijn voordelig voor de activering van deze modules in sensorische cortex met een hoge ruimtelijke resolutie te visualiseren. In deze context, endogene optische signalen die voortvloeien uit de moleculaire mechanismen die verband houden met neuroenergetics zijn waardevolle bronnen van tegenstelling tot de ruimtelijke kaarten van zintuiglijke prikkels over grote velden in de knaagdieren hersenen vast te leggen. Hier presenteren we twee technieken gebaseerd op veranderingen van de endogene optische eigenschappen van het hersenweefsel tijdens de activering. Eerst de intrinsieke optische signalen (IOS) worden geproduceerd door een lokale verandering in rood licht reflectie als gevolg van: (i) de absorptie door veranderingen in het bloed zuurstof niveau en bloedvolume (ii) foton verstrooiing. Het gebruik van in vivo IOS om ruimtelijke kaarten registreren begon in het midden van de jaren 1980 met de observatiover van optische kaarten van whisker vaten in de rat en de oriëntatie kolommen in de kat een visuele cortex. IOS beeldvorming van het oppervlak van de knaagdieren belangrijkste bulbus olfactorius (OB) in reactie op de geurstoffen werd later aangetoond door Larry Katz groep 2. De tweede benadering is gebaseerd op flavoprotein autofluorescentie signalen (FAS) als gevolg van veranderingen in de redox toestand van deze mitochondriale metabole intermediairen. Meer bepaald, is de techniek die gebaseerd is op de groene fluorescentie als gevolg van geoxideerde toestand van flavoproteins wanneer het weefsel wordt opgewekt met blauw licht. Hoewel dergelijke signalen waren waarschijnlijk een van de eerste fluorescerende moleculen opgenomen voor de studie van de hersenactiviteit door de pionier studies van Britton Kansen en collega&#39;s 3, was het niet tot voor kort dat ze zijn gebruikt voor het in kaart brengen van de hersenactiviteit in vivo. FAS beeldvorming werd voor het eerst toegepast op de somatosensorische cortex bij knaagdieren in reactie op achterpoot stimulatie door de groep Katsuei Shibuki&#39;s 4. De olfactorische systeem is van essentieel belang voor het voortbestaan ​​van de overgrote meerderheid van de levende soorten, omdat het maakt een efficiënte opsporing en identificatie van chemische stoffen in het milieu (voedsel, roofdieren). De OB is het eerste relais van olfactorische informatieverwerking in de hersenen. Het ontvangt afferente projecties van de olfactorische primaire sensorische neuronen die vluchtige geurstof moleculen te detecteren. Elke sensorische neuron drukt slechts een type odorant receptor en neuronen die hetzelfde type receptor sturen hun zenuwen processen naar dezelfde goed gedefinieerde microregions van ~ 100 urn 3 samengesteld van discrete neuropil, de olfactorische glomerulus (afb. 1). In de afgelopen tien jaar heeft IOS beeldvorming bevorderd de functionele exploratie van de OB 5, 6, 7, die is uitgegroeid tot een van de meest bestudeerde zintuiglijke structuren. Het in kaart brengen van OB activiteit met FAS imaging is nog niet uitgevoerd. Hier, we tonen de opeenvolgende stappen van een efficiënt protocol voor IOS en FAS beeldvorming aan geur-activiteiten opgeroepen kaart in de muis OB.

Dit artikel geeft de protocollen van de intrinsieke optische signalen en flavoproteins autofluorescentie signalen beeldvorming in kaart geur-opgeroepen activiteiten op het oppervlak van het reukorgaan in muizen.

Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen

In de hersenen activeert sensorische stimulatie verspreide populaties neuronen binnen functionele modules die deelnemen aan de codering van de stimulus. ...

Het algemene doel van dit experiment is om geurevoked activiteiten aan het oppervlak van de bulbus olfactorius van muizen in kaart te brengen met behulp van intrinsieke optische signalen en flavoproteïne autofluorescentiesignalen of FAS-imaging, nadat de muis is geanestheseerd en de schedel is blootgelegd. Het bot boven de bulbus olfactorius wordt dunner gemaakt. Met de punt van een scalpelblad wordt een botlap getrokken en vervolgens verwijderd; er wordt een kamer van tandheelkundig cement gemaakt die het blootgelegde oppervlak van de bulbus olfactorius omringt.Het wordt gevuld met ARO's en er wordt een dekglas bovenop deze preparatie geplaatst. Olfactorische kaarten worden sequentieel verkregen in dezelfde muis met behulp van intrinsieke optische signalen en FAS-imaging. Het imagen van andere opgewekte activiteiten in de olfactorische bol van de muis met behulp van optische reflectie- en autofluorescentiesignalen kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen over de ruimtelijke organisatie van glomeruli in de olfactorische bol. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals 2-deoxyglucose-imaging of fMRI, is dat het mogelijk maakt om opgewekte activiteiten vast te leggen met een ruimtelijke resolutie van een enkele glomerulus.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden in het begin van hun werk problemen ondervinden, omdat zowel de chirurgische als de instrumentele vaardigheden traag worden verworven. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel om de aandacht te vestigen op de cruciale stappen van de chirurgische en beeldvormingsprocedures. Knijp in de achterpoot van de muis om de anesthesie te bevestigen en verwijder het haar van de schedel met een trimmer.Verwijder eventueel resterend haar van de huid met steriele gaasjes gedrenkt in gedestilleerd water. Plaats de muis in het stereotaxische frame zodanig dat de snuit in hetzelfde vlak ligt als de achterkant van de kop. Om de bulbus olfactorius horizontaal te positioneren, moeten de oor- en neusstaven stevig worden vastgezet om beweging te voorkomen.Breng oogsalf aan in de ogen om uitdroging tijdens de beeldvorming te voorkomen en desinfecteer vervolgens het gebied van de hoofdhuid met Betadine met behulp van steriele scharen. Maak een incisie in de achterkant van de kop tussen de oren, snijd vervolgens aan beide zijden richting de basis van het oor en in anterieur-posterieure richting naar het voorhoofd langs de oogleden. Voltooi het verwijderen van de hoofdhuid door de huid op de snuit door te snijden.Gebruik de neusstrip als gids. Plaats het dier onder een stereomicroscoop en gebruik een met fysiologische zoutoplossing gedrenkt wattenstaafje om het periost op de bovenkant van de schedel voorzichtig los te maken. Gebruik een pincet om het resterende weefsel te verwijderen en schraap het schedeloppervlak met een scalpel om een schone preparatie te waarborgen, zodat het gebied van de bulbus olfactorius gedurende het experiment vochtig blijft.Plaats een stukje absorbeerbare gelatinespons, gedrenkt in gedestilleerd water, op het bot boven de bulbus olfactorius die tussen de ogen ligt. Verwijder de gelatinespons en begin met het voorzichtig afschrapen van het bot met een scalpelblad nummer 10. Houd een constante hoek van 45 graden aan tussen het blad en het bot en beweeg het blad van de oogleden naar de sagittale zijde van het gebied rond de bulbus.Zorg ervoor dat er tijdens het verdunnen geen verticale druk op het bot wordt uitgeoefend en dat het bot boven de veneuze sinus niet wordt bekrast. Stop elke vijf minuten en plaats een gehydrateerde gelatinespons op het bot om het preparaat af te koelen. Veeg de schedel met de spons om botstof te verwijderen en veeg de punt van het scalpel periodiek af om deze schoon en scherp te houden.Zet dit voort totdat de spongieuze botlaag of trabekel zichtbaar is. Wanneer de fijne vasculatuur van de bulbus olfactorius zichtbaar is, stop dan met het schrapen van het bot en gebruik de punt van een scalpel nr. 11 om een rechthoekig gebied rond de bulbus olfactorius uit te tekenen. Houd het venster binnen de begrenzing van de veneuze sinussen en ga verder met het schrapen van het bot binnen het rechthoekige gebied.Wees uiterst voorzichtig met de diepte van de scalpelpunt om contact met het dura-oppervlak te vermijden. Om een indruk te krijgen van de dikte van het resterende bot, kan dit voorzichtig worden weggeduwd met de punt van een pincet. Als het bot onder druk buigt, kunt u overgaan naar de volgende stap.Voeg een druppel zoutoplossing toe en gebruik de punt van het scalpel, horizontaal georiënteerd, om de botlap op te lichten. Verwijder de lap voorzichtig met een pincet om te voorkomen dat het resterende bot scheurt. Zodra het oppervlak van de bulbus olfactorius is blootgelegd, moet worden gecontroleerd op de afwezigheid van bloedingen of bloedvaten. Anastomose.Veeg het gebied schoon met een gelatinespons gedrenkt in zoutoplossing. Om de bulbus olfactorius vochtig te houden, brengt u polyacrylaat-tandcement aan met een spuit met een 29 gauge naald om een reservoir op het bot rond het craniële venster te vormen. Plaats een druppel laagsmeltende agarose over de dura mater en plaats een steriel dekglas over het craniële venster voor beeldvorming.Plaats het stereotaxische frame onder de stereomicroscoop met het schedervenster gecentreerd in het gezichtsveld en stel dit scherp om de haarvaten zichtbaar te maken. Schakel over naar groen licht van 580 nanometer en leg een anatomisch controlebeeld vast om de staat van de preparatie tijdens de beeldvorming te controleren. Ga vervolgens over tot het vastleggen van de stimulatie-experimenten met behulp van intrinsic optical signal imaging onder 630 nanometers verlichting of flavoproteïne-autofluorescente signaalbeeldvorming onder 480 nanometers verlichting. Een standaard beeldvormingssessie omvat een basislijn van vijf tot 10 seconden waarbij alleen lucht wordt toegediend, gevolgd door de geurstimulatie gedurende drie tot 10 seconden, afhankelijk van de gekozen geurconcentratie.Ten slotte wordt er een luchttoevoer van 70 tot 82 seconden vastgelegd voor de baseline-herstelperiode. Hierbij wordt de vatenstructuur van de bulbus olfactorius via het schedervenster in beeld gebracht, gevolgd door de resultaten van een stimulatie-experiment waarbij h sinal als odorant wordt gebruikt, vastgelegd met zowel iOS- als FAS-imaging. Bij de iOS-imaging wordt de door geuren opgewekte activiteit weergegeven als donkere absorptiegebieden; de door AL geactiveerde gebieden worden aangegeven door de witte pijlen, en actieve gebieden zijn zichtbaar in zowel enkele als gemiddelde meervoudige trials.Bij het overschakelen naar FAS-beeldvorming in dezelfde muis wordt de opgewekte activiteit in de OD nu getoond als witte gebieden van autofluorescentie-emissie, aangewezen door de zwarte pijlen, en kan deze ook worden waargenomen in zowel enkele als gemiddelde meervoudige trials. Merk op dat zowel de zwarte absorptiezones die zichtbaar zijn bij iOS-beeldvorming als de witte gebieden van autofluorescentie-emissie die zichtbaar zijn bij FAS-beeldvorming, elkaar overlappen. Deze ruimtelijke overeenkomst bevestigt dat beide technieken de visualisatie van dezelfde olfactorische glomeruli mogelijk maken. Zodra de master-beeldvorming is ingesteld, kunnen opgewekte activiteiten met behulp van optische reflectantie- en autofluorescentiesignalen in één uur voor de chirurgie en een paar uur voor de beeldacquisitie worden uitgevoerd.De belangrijkste nadelen van het gebruik van deze optische beeldgevingsmethoden zijn het feit dat ze niet kunnen worden toegepast om olfactorische kaarten te visualiseren in vrij bewegende muizen. En vanwege de beperkte penetratie van fotonen in biologische weefsels bieden ze geen toegang tot de ventrale olfactorische glomeruli na hun ontwikkeling in de late jaren negentig, bij het registreren van intrinsieke signalen in het olfactorische systeem. Misschien biedt dit een weg voor onderzoekers op het gebied van optische beeldvorming om de kenmerken van de speciale coating van od te onderzoeken.Autofluorescentie-imaging van flavoproteïnen in de bulbus olfactorius is een veelbelovende techniek om nieuwe inzichten te verkrijgen in de specifieke coating van OD met behulp van endogene optische signalen.

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatieve, gemakkelijk te voeren, en betrouwbare manier te beoordelen olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Dit protocol beschrijft een recording setup, muis weefsel voorbereiding, het verzamelen van gegevens, en de elementaire data-analyse.

Het analyseren Reacties van Mouse Olfactorische sensorische neuronen Met behulp van de Air-fase Electroolfactogram opnemen

We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal...

Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo</em

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Source: Zhang, L., et al. Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the process of applying NIr light to a shaved mouse scalp to activate vestibular neurons and stimulate superoxide dismutase-1 (SOD-1) production, supporting neuronal function. The procedure highlights NIr therapy as a neuroprotective strategy.

Modulating Sensory Neuronal Signaling in a Mouse Model Using Near Infrared Light

We beschrijven een protocol voor in vivo markering van olfactorische sensorische neuronen door middel van elektroporatie en vervolgens confocale laser-scanning of multifotonmicroscopie om de neuronale morfologie en de ontwikkeling ervan in de loop van de tijd te visualiseren.

Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer In Vivo

We presenteren een eenvoudige en onbevooroordeelde olfactorische test bij muizen. Met dit protocol kunnen olfactorische discriminatie, voorkeur, vermijding en gevoeligheid voor een nieuwe geur in vergelijking met water worden beoordeeld in sessies van enkel gedrag. Deze methode is geïndiceerd voor een enkele experimentator en de analyse is gebaseerd op computerondersteunde videoverwerking.

Eenvoudig en Computer-assisted Olfactorische testen voor Muizen

Hier beschrijven we een protocol voor het meten en analyseren van temperatuurresponsen in de reukbol van Xenopus laevis. Reukreceptorneuronen en mitralvormige cellen worden differentieel gekleurd, waarna calciumveranderingen worden geregistreerd, wat een gevoeligheid aangeeft van sommige neurale netwerken in de bol voor temperatuurdalingen die in de neus worden geïnduceerd.

Opname-temperatuur-geïnduceerde neuronale activiteit door middel van monitoring Calcium Veranderingen in de Olfactorische Bulb van<em&gt; Xenopus laevis</em

Olfactorische zintuiglijke neuronen vormen een grote verscheidenheid aan axon-sorterende moleculen om een ​​goede neurale schakeling te vormen. Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuring methode om combinatorische expressies van axon-sorterende moleculen te visualiseren bij de axon termini van olfactorische sensorische neuronen.

Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes

Hier trainen we muizen op een associative Leeropdracht voor het testen van de discriminatie van de geur. Dit protocol voorziet ook in studies over leren-geïnduceerde structurele veranderingen in de hersenen.

Een objectieve en reproduceerbare Test van olfactorische leren en discriminatie in muizen

Dit protocol onderzoekt de relatie tussen hersenen en gedrag in hippocampus CA1 bij muizen die door een geurpluim navigeren. We bieden een stapsgewijs protocol, inclusief chirurgie om toegang te krijgen tot beeldvorming van de hippocampus, gedragstraining, miniscope GCaMP6f-opname en verwerking van de hersenen, en gedragsgegevens om de muispositie te decoderen van ROI neurale activiteit.

Miniscoop registreert calciumsignalen op de hippocampus van muizen die door een geurpluim navigeren

Dit protocol beschrijft de constructie van een olfactometer voor go/no-go olfactorische gedragsexperimenten. Stapsgewijze instructies, samen met afbeeldingen, worden meegeleverd om de succesvolle constructie van de olfactometer te garanderen. Informatie voor het oplossen van problemen die zich tijdens het proces voordoen, is ook inbegrepen.

Constructie van een olfactometer voor onderzoek naar olfactorisch gedrag bij knaagdieren

Leer hoe je geur-opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius in kaart brengt met intrinsieke optische signalen en flavoproteïne-autofluorescentie. Deze technieken bieden hoge ruimtelijke resolutie voor gedetailleerde neurale beeldvorming.

Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen (Video) | JoVE Journal

Imaging Geur-Opgeroepen activiteiten in de muis bulbus olfactorius met behulp van optische reflectie en autofluorescentie Signalen

Meer video's verkennen