Name: Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer een sferoïde-assay om TGF-β-geïnduceerde invasie te meten in 3D-collageen met MCF10A-cellijnen. Deze methode kwantificeert invasieve gebieden beter dan traditionele 2D-scratch-assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar dat Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, USA) voor de reagentia en Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Kanker Intitute, Detroit, USA) voor de cellijnen.

1. Voorbereiding van de Methocel oplossing (500 ml) <ol><li> Autoclaaf 6 g methylcellulose in een 500 ml fles met een magneetroerder. </li><li> Los van de methylcellulose in 250 ml voorverwarmd DMEM/F12 zonder serum (60 ° C) gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 250 ml van DMEM/F12 (RT) met 10% paard serum. Mix 's nachts (4 ° C). </li><li> Wis de oplossing door centrifugeren (5000g, 2h, 4 ° C). </li><li> Neem het heldere zeer viskeuze oplossing voor een nieuwe buis (ongeveer 90-95% van de voorraad-oplossing). </li><li> Bewaren bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. Sferoïde cultuur <ol><li> Bereid een 20% Methocel-oplossing (10 ml en 40 ml Methocel groeimedium). </li><li> Twee keer wassen cellen met PBS, voeg 0,1% trypsine en incubeer cellen bij 37 ° C </li><li> Resuspendeer cellen in groeimedium en tellen de cellen. </li><li> Maak een suspensie van 10 000 cellen per ml in 20% Methocel. </li><li> Voeg de celsuspensie aan de 96 goed met ronde bodem suspension platen (100 ul per putje). </li><li> De volgende dag, controleer dan de bolvormige formatie in de suspensie platen. Sferoïden klaar voor gebruik na 1-3 dagen. </li></ol> 3. Vervaardiging van collageen <ol><li> Voor te bereiden op het ijs een oplossing van 8 ml collageen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH en 3 druppels 0,1 N HCl. Controleer of de pH 7,4 door het spotten van een deel van de oplossing op pH-indicator strips. Stel de pH indien buiten bereik. </li><li> Voeg 50 ul van geneutraliseerd collageen-oplossing in de putjes van een plaat met 96 putjes </li><li> Incubeer bij 37 ° C totdat het collageen is gestold (90 min). </li><li> Bereid Methocel-collageen-ligand-oplossingen op het ijs: voor elke ligand pipet een deel van de oplossing van collageen. Voeg 20 ng per ml TGF-β collageen. Na verdunning met Methocel en de verspreiding over de verschillende lagen, zal de uiteindelijke concentratie van TGF-β worden 5 ng / ml Meng door vortexen. Voeg een deel van Methocel-oplossing. En door vortexen gemengd. </li></ol> 4. Sferoïde insluitenDing <ol><li> Plaats een 200 ul tip dat ongeveer 5 mm van de tip afgesneden heeft, op een 200 ul pipet. Zuigen een sferoïde met de pipet en zorgvuldig het medium afzien in een leeg bord. Kijk als de bolvormige blijft binnen de tip. De sferoïde is zichtbaar als een witte stip. Zonder dat het loslaten van de zuiger, zuigen 100 ul collageen-Methocel mengsel en afzien van de spheroïde in het collageen mengsel in een collageen gecoate 96 well. Doe dit voor 12 sferoïden voor elke conditie. </li><li> Laat collageen ten minste 30 minuten stollen bij 37 ° C </li><li> Verwijder de luchtbellen met een 200 ul tip. </li><li> Voeg 50 pl medium met 1,6% serum en inhibitoren opgelost in DMSO. Voor de SB-431542 toe te voegen 4 pl stockoplossing (10 mm) tot 1 ml medium. Na de diffusie, zal de uiteindelijke concentratie van de remmer worden 10 uM. TGF-β en remmers blijven de loop van het experiment. Maak foto's van de sferoïden onder de microscoop met behulp van 40x vergroting. </li><li> Na 48h van de stimulatie met TGF-β en / of remmers, foto's nemen van de sferoïden onder de microscoop met behulp van 40x vergroting. </li><li> Meet de oppervlakte van de binnenvallende sferoïden na 2 dagen en trek het startgebied. Het meten van de oppervlakte van een sferoïde: Open het beeld van de sferoïde in Adobe Photoshop Extended (figuur 2A) en selecteer het gereedschap Snelle selectie (figuur 2B). De muisaanwijzer verandert in een cirkel met een 'plus' (+) teken (figuur 2C). Tijdens het slepen met de cursor over de afgeplatte bol is, zal Photoshop herkent de grenzen van de sferoïde. Als een gebied buiten de sferoïde is geselecteerd, kan dit gebied worden uitgesloten van de selectie door op de Alt-toets of door gebruik te maken van de negatieve selectie tool die wordt aangegeven door een (-) teken in de werkbalk. De cursor verandert in een cirkel met een 'min' (-) teken en door het slepen van de cursor over de verkeerd gekozen gebied, is dit gebied uit de selectie verwijderd (figuur 2D). Indien nodig, meerdere regio's kunnen worden geselecteerd door op de ShIFT-knop. Om te werken nauwkeuriger, kan de grootte van de muisaanwijzer worden aangepast door het veranderen van de borstel diameter in de werkbalk (figuur 2E). Wanneer de hele sferoïde is geselecteerd, is de oppervlakte van de selectie berekende via analyse-maatregel in de menubalk of door te drukken op Ctrl + Shift + M (figuur 2F). De meting opname venster verschijnt met de bestandsnaam en het gebied van de selectie in pixels, evenals andere gegevens (figuur 2G). Als er meerdere selecties worden gemeten, de eerste regel geeft de som van alle gebieden. De metingen van de individuele selecties worden gepresenteerd in de lijnen hieronder. De gegevens van alle metingen kunnen worden geëxporteerd naar een tekstbestand en geopend in Excel. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van de bolvormige assay met MCF10A1 (M1) normale borst-epitheliale cellen, H-RAS getransformeerd MCF10AneoT (M2) cellen en M2-afgeleide MCF10CA1a (M4) wordt gegeven in figuur 3. M1 cellen toonde slechts zwakke invasie zonderstimulatie, maar viel significant beter op stimulatie door TGF-β. In tegenstelling, de RAS-getransformeerde M1-M2 afgeleide binnengevallen efficiënt al zonder toevoeging van stimuli, en dit werd verder verhoogd 4-5 keer op TGF-β behandeling. M4 cellen toonde de sterkste invasie, zowel met als zonder TGF-β toevoeging. Vervolgens onderzochten we of we konden met de TGF-β-geïnduceerde invasie grijpen in dit bolvormige model met behulp van chemische remmers. Voor dit doel gebruiken we SB-431542, een ATP-analoog en selectieve remmer van de kinase-activiteit van TβRI, evenals activine type IB receptor (ActRIB) en activine receptor-like kinase (ALK) 7 12. Zoals verwacht, SB-431542 krachtig remde TGF-β-geïnduceerde invasie van M1, M2 en M4 cellen (afb. 4), wat aangeeft dat TGF-β-geïnduceerde invasie is TβRI-kinase afhankelijk. Daarnaast is de basale invasie van de sferoïden ook werd sterk geremd, wat suggereert dat basale inval is ook deonafhankelijke op de TGF-β. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram van de 3D-sferoïde test. Eerst worden de cellen geplateerd onder niet-klevende omstandigheden in u-vormige suspensies platen. Cellen aggregrate in multcellular sferoïden en kan worden ingebed in een collageen matrix. In dit collageen matrix, zijn ze in staat om binnen te vallen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Kwantificering van de oppervlakte van de sferoïden met behulp van Adobe Photoshop Extended. (A) Het beeld van de bolvormige wordt geopend in Adobe Photoshop Extendend (B) Selectie van het gereedschap Snelle selectie (C) Het slepen van de cursor over de bolvormige op het gebied van de bolvormige (D) Verwijdering van een wongly opgenomen gebied met behulp van de te selecteren negatieve gereedschap Snelle selectie (E) Aanpassing van de borstel grootte van het gereedschap Snelle selectie om nauwkeuriger Selecteer het gebied dat (F) Selectie van demeting op te nemen opdracht (G) Voorbeeld van een meting op te nemen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. TGF-β-geïnduceerde invasie van sferoïden van spontaan vereeuwigd MCF10A1 (M1) (A), RAS-getransformeerde MCF10AneoT (M2 (B) en haar uitgezaaide afgeleide MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 en M4 spheroids embedded in collageen werden behandeld met 5ng/ml van TGF-β voor 48u zoals aangegeven. AC vertegenwoordiger van foto's genomen op de dag van inbedding en twee dagen later. D Relatieve invasie werd gekwantificeerd als gebied verschil op dag 2 minus dag 0. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± sd Aangepast uit 13. <img alt="Figuur 4a" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4a"> <img alt="Figuur 4b" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4b"> Figuur 4. Basal en TGF-β-geïnduceerde sferoïde invasie wordt geremd by SB-431542. M1, M2 en M4 spheroids werden ingebed in collageen en behandeld met TGF-β 5ng/ml en / of 10 uM SB-431.542 zoals aangegeven. Vertegenwoordiger van foto's genomen na 2 dagen (A). Relatieve invasie werd gekwantificeerd als gebied verschil op dag 2 minus dag 0 (B). De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± sd Aangepast uit 13.

<ol><li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li>
<li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+TGF-%CE%B21+and+TGF-%CE%B2+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li>
<li>Sheen-Chen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Surg%22%5BJournal%5D)">Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer.</a> Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).</li>
<li>ten Dijke, P., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+TGF-%CE%B2-Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">New insights into TGF-β-Smad signaling.</a> Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).</li>
<li>Moustakas, A., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Smad+TGF-%CE%B2+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-Smad TGF-β signals.</a> J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).</li>
<li>Soule, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+human+breast+epithelial+cell+line%2C+MCF-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10.</a> Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).</li>
<li>Strickland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+premalignant+MCF10AT+generates+heterogeneous+malignant+variants+with+characteristic+histologic+types+and+immunohistochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers.</a> Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).</li>
<li>Santner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+multicellular-mediated+resistance+to+alkylating+agents+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).</li>
<li>Inman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-b+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).</li>
<li>Wiercinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSmad+pathway+induces+breast+cancer+cell+invasion+through+the+up-regulation+of+matrix+metalloproteinase+2+and+9+in+a+spheroid+invasion+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system.</a> Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).</li>
<li>Tang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC. Med. 6, 11-11 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).</li>
<li>Lee, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).</li>
<li>Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> 30, 256-256 (2011).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-Activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> 10, 314-314 (2011).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten.

We hebben een sferoïde model waarin MCF10A1 cellen en zijn kwaadaardige derivaten binnen te vallen in een collageen matrix in een TGF-β-afhankelijke manier. Eerst worden sferoïden gevormd in 96-wells ronde bodem schorsing platen in de aanwezigheid van methylcellulose. Natuurlijk kan ook de U-vormige poly-HEMA gecoate platen worden gebruikt voor dit doel. Methylcellulose is absoluut noodzakelijk in deze stap, aangezien cellen zullen sterven in de afwezigheid van methylcellulose. TGF-β wordt direct toegevoegd aan de colla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Geavanceerde BioMatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> pH indicator strips </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well schorsing platen </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well hechting TC platen </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

sferoïde assay voor tgf-β-geïnduceerde invasion measure

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-β heeft tegengestelde rollen in borstkanker progressie door te fungeren als een tumor suppressor in de beginfase, maar het stimuleren van invasie en metastase in een later stadium 1,2. Bovendien is TGF-β vaak tot overexpressie gebracht in borstkanker en de uitdrukking ervan correleert met een slechte prognose en metastase 3,4. De mechanismen waarmee TGF-β induceert invasie niet goed begrepen. TGF-β lokt haar cellulaire reacties via TGF-β type II (TβRII) en type I (TβRI) receptoren. Bij de TGF-β-geïnduceerde heteromeric complex vorming, TβRII fosforyleert de TβRI. De geactiveerde TβRI initieert zijn intracellulaire canonieke signaalroute door fosforylatie receptor Smads (R-Smads), dat wil zeggen Smad2 en Smad3. Deze geactiveerde R-Smads vorm heteromeric complexen met Smad4, die zich ophopen in de kern en het reguleren van de transcriptie van doelwitgenen 5. In aanvulling op de eerder described Smad pad, receptor activering resulteert in de activering van een aantal andere niet-Smad signaalwegen, bijvoorbeeld Mitogeen Activated Protein Kinase (MAPK) wegen 6. De studie van de rol van TGF-β in verschillende stadia van borstkanker, hebben we gebruik gemaakt van de MCF10A cel systeem. Dit systeem bestaat uit spontaan vereeuwigd MCF10A1 (M1) borst epitheelcellen 7, de H-RAS getransformeerd M1-derivaat MCF10AneoT (M2), die premaligne letsels veroorzaakt bij muizen 8, en de M2-afgeleide MCF10CA1a (M4), dat werd vastgesteld op basis van M2 xenografts en vormen hoogwaardig carcinomen met de mogelijkheid om uitzaaien naar de longen 9. Dit MCF10A serie biedt de mogelijkheid om de reacties van cellen te bestuderen met verschillende graden van maligniteit die niet vertekend door een verschillende genetische achtergrond. Voor de analyse van TGF-β-geïnduceerde invasie genereerden wij homotypic MCF10A sferoïde celculturen embeT OEGEVOEGDE in een 3D-collageen-matrix in vitro (figuur 1). Dergelijke modellen sterk lijken op menselijke tumoren in vivo door de oprichting van een gradiënt van zuurstof en voedingsstoffen, wat resulteert in actieve en invasieve cellen aan de buitenkant en rustende of zelfs necrotische cellen in de binnenkant van de sferoïde 10. Sferoïde gebaseerde testen hebben ook aangetoond dat resistentie tegen geneesmiddelen beter samenvatten dan monolaagculturen 11. Dit MCF10 3D-model-systeem liet ons toe om de impact van de TGF-β signalering te onderzoeken op de invasieve eigenschappen van borst-cellen in verschillende stadia van maligniteit.

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

TGF-&beta; speelt tegengestelde rollen in de progressie van borstkanker door in de beginfase als tumorsuppressor te fungeren, maar vervolgens invasie en metastase te stimuleren ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect te meten van potentiële regulatoren van TGF beta-geïnduceerde invasie in een driedimensionale omgeving. Dit wordt bereikt door eerst sferoïden van de cellen te maken. De PHE worden vervolgens ingebed in collageen, wat een 3D-omgeving biedt.Vervolgens wordt het invasieve gebied gekwantificeerd. Om het effect van de behandeling op de door TGF beta geïnduceerde invasie te bepalen, laten de resultaten zien dat modulatoren van het TGF-beta-pad de invasieve eigenschap van de steroïden in een 3D collageenmatrix beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de scratch assay, is dat deze de 3D-omgeving beter nabootst.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de T-meter-gebieden, zoals de identificatie van nieuwe genen die betrokken zijn bij TGF-beta-geïnduceerde invasie. Om de methylcellulose-oplossing voor de TGF-beta-geïnduceerde invasie-assay te bereiden, begint u met het autoclaveren van 6 g Methylcellulose in een fles van 500 ml met een magnetische roerstaaf. Los de Methylcellulose gedurende 20 minuten op in 250 ml voorverwarmd DMEM/F12 zonder serum, voeg 250 ml DMEM/F12 op kamertemperatuur toe met 10% paarden serum, en meng dit gedurende de nacht bij 4 °C. Clarificeer de volgende dag de oplossing door centrifugatie bij 5.000 ×g gedurende twee uur bij 4 °C.Overbreng de heldere, sterk viskeuze oplossing naar een nieuwe buis en bewaar deze bij vier graden Celsius tot gebruik voor het kweken van phe. Bereid een 20% methylceloplossing met 10 milliliters van de bereide methylcelstock en 40 milliliters groeimedium. Was MCF 10 A-cellen tweemaal met PBS.Voeg 0,1%trypsine toe en incubeer de cellen bij 37 °C totdat alle cellen zijn losgekomen. Resuspendeer de cellen in 10 milliliters groeimedium en tel de cellen met een celteller. Bereid een suspensie van 10.000 cellen per milliliter in 20%methylcel.Voeg voor elke testconditie 100 µL van de celsuspensie toe aan 12 wells van een 96-well round bottom suspensieplaat. Incubeer de cellen overnight in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2. Controleer de volgende dag op de vorming van sferoïden.Sferoïden zijn binnen één tot drie dagen klaar voor gebruik. Bereid op ijs een oplossing voor van acht milliliter collageen, één milliliter 10 XPBS, één milliliter 0,1 normaal natriumhydroxide en drie druppels 0,1 normaal zoutzuur. Controleer met pH-indicatiestrips of de pH van de oplossing 7,4 is.Pas de pH aan als deze buiten het bereik valt. Voeg 50 µL geneutraliseerde collageenoplossing toe aan de wells van een 96-wellplaat en incubeer bij 37 °C gedurende ongeveer 90 minuten of totdat het collageen is gestold. Bereid voor elk te testen ligand een methylcel-collageenligandoplossing op ijs.Begin met één milliliter collageenoplossing per behandeling en voeg 20 nanogram TGF beta toe voor een eindconcentratie van vijf nanogram per milliliter, gemengd door vortexen. Voeg vervolgens één milliliter methylceloplossing toe voor een eindvolume van twee milliliter en vortex. Om een steroïde in te bedden, plaatst u een 200 microliter pipetpunt, waarvan vijf millimeter of meer van de punt is afgesneden, op een 200 microliter pipet.Neem vervolgens één S-sferoïde op met de pipet. Dispenseer het medium voorzichtig in een lege plaat, waarbij u ervoor zorgt dat de S-sferoïde in de tip blijft. Laat de plunjer niet los.Neem 100 µL van het mengsel van collageen en gemethyleerde cellen op en breng het collageenmengsel voor de S-sferoïden over in een collageen-gecoate well van een 96-wells plaat. Vul 12 wells per conditie. Laat het collageen gedurende ten minste 30 minuten stollen bij 37 °C en verwijder de luchtbellen met een 200 µL tip.Bereid een 40 µM oplossing van de TGF beta-remmer SB 4 31 542 door vier µL van de SB 4 31 542-stamoplossing toe te voegen aan één mL D-M-E-M-F 12 dat 1,6% paardenserum bevat. Voeg na diffusie 50 µL van het medium met remmer toe aan elke put. De uiteindelijke concentratie van de remmer zal 10 µM zijn.Maak foto's van het sferoïde onder de microscoop bij een 40x vergroting, en incubeer deze vervolgens in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Neem na een incubatieperiode van twee dagen opnieuw foto's en meet het oppervlak van het invaderende sferoïde door een afbeelding van het sferoïde te openen in Adobe Photoshop. Ga naar bewerken en selecteer het hulpmiddel voor snelle selectie.De muisaanwijzer verandert in een cirkel met een plusteken wanneer de cursor over de sferoïde wordt gesleept. De software herkent de randen van de sferoïde. Als er een gebied buiten de sferoïde wordt geselecteerd, sluit dit gebied dan uit door op de alt-toets te drukken of door het hulpmiddel voor negatieve selectie te gebruiken, dat in de werkbalk wordt weergegeven als een minteken.Sleep de cursor over het onjuist geselecteerde gebied en de software zal dit uit de selectie verwijderen. Als een gebied binnen de sferoïde is gedeselecteerd, kan dit gebied opnieuw worden toegevoegd door te slepen terwijl de shift-toets wordt ingedrukt. Om nauwkeuriger te werken, kunt u de grootte van de muisaanwijzer aanpassen door de diameter van de brush in de werkbalk te wijzigen.Om het oppervlak van alle actieve selecties te berekenen, kiest u voor analysemeting in de menubalk. Er verschijnt een venster voor de registratie van metingen waarin de bestandsnaam en het oppervlak van de selectie in pixels worden weergegeven. Als er meerdere selecties binnen één sferoïde worden gemeten, toont de eerste regel de som van alle oppervlakken en de regels daaronder de individuele waarden.Het zal de waarden van de individuele selecties weergeven. Exporteer de gegevens naar een tekstbestand en open dit in Excel. Een voorbeeld van de S-sferoïde-assay met MCF 10A1, normale borstepitheelcellen, getransformeerde MCF 10A neoT-cellen en M2-afgeleide MCF 10CA1A wordt hier getoond.M1-cellen vertoonden zonder stimulatie slechts een zwakke invasie, maar invadeerden significant beter na stimulatie door TGF beta. In contrast hiermee invadeerden de door RA's getransformeerde M1-afgeleide M two cellen efficiënt zonder toevoeging van stimuli, en dit werd verder met vier tot vijf keer verhoogd. Na TGF beta-behandeling vertoonden M four-cellen de sterkste invasie, zowel zonder als met toevoeging van TGF Beta.Een grafische weergave van de resultaten voor dit experiment is verkregen met Photoshop en wordt hier getoond; SB 4 31 5 42, een ATP-analogon en selectieve remmer van de kinase-activiteit van TGF beta receptor one, evenals actief in type one B receptor en actief in receptor like kinase seven, werd toegevoegd aan de celculturen. SB 4 31 5 42 remde krachtig de door TGF beta geïnduceerde invasie van M1-, M two- en M four-cellen, wat aangeeft dat de door TGF-beta geïnduceerde invasie afhankelijk is van TGF-beta receptor one kinase. Daarnaast werd de basale invasie van de PHE sterk geremd. Een grafische weergave van de resultaten voor dit experiment is opnieuw gemaakt met Photoshop en wordt hier getoond.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-isolatie of proteïne-isolatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke genen of welke proteïnen tot expressie komen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u nieuwe modulatoren van tavita-geïnduceerde invasie kunt vinden.

spheroid-assay-to-measure-tgf-induced-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Guyon, J., et al. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates the generation of a three-dimensional spheroid model of tumor cell invasion. Spheroids are formed from human brain tumor cells and embedded in a collagen matrix. The tumor cells at the spheroid periphery adopt an invasive phenotype, secreting proteases to degrade the collagen and advancing to invade the surrounding matrix.

Generation of a Three-Dimensional Spheroid Model of Tumor Cell Invasion

Ovariale kankercel invasie in de mesotheellaag van het peritoneum is een dynamisch proces in de tijd. Gebruik te maken van een real-time analyzer, kan de invasieve capaciteit van eierstokkanker cellen in een bolvormige-mesothelial cel co-cultuur model gekwantificeerd worden gedurende langere perioden, het verstrekken van inzicht in factoren die de het metastatische proces.

Evaluatie van eierstokkanker Sferoïde Hechting en Invasie van mesotheelcellen in Real Time

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Een HMCA gebaseerde imaging plaat wordt gepresenteerd voor invasie assay prestaties. Deze plaat vergemakkelijkt de vorming van driedimensionale (3D) tumor spheroïden en het meten van kanker cel invasie in de extracellulaire matrix (ECM). De invasie assay kwantificering wordt bereikt door semi-automatische analyse.

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Hier presenteren we een protocol om de interactie van primaire humane monocyt-afgeleide macrofagen met een tumorsferoïde in een driedimensionale (3D) collageen I-matrix te onderzoeken, met de mogelijkheid om de impact van oplosbare en fysische eigenschappen van de micro-omgeving op celinvasie te vergelijken.

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

Leer een sferoïde-assay om TGF-β-geïnduceerde invasie te meten in 3D-collageen met MCF10A-cellijnen. Deze methode kwantificeert invasieve gebieden beter dan traditionele 2D-scratch-assays.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Meer video's verkennen