Name: Het identificeren van doelen van Human microRNAs met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer microRNA-doelwitvalidatie in menselijke cellen met het LightSwitch luciferase-assay-systeem en 3'UTR-reporterconstructen. Deze methode meet luciferasesignaal om genregulatie-interacties experimenteel te bevestigen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Introductie MicroRNA naar voren zijn gekomen als belangrijke regulatoren van genexpressie die de activiteit van vele belangrijke biologische processen moduleren. Met meer dan 700 menselijke miRNAs geïdentificeerd tot nu toe 1, is het niet verwonderlijk dat de mutaties en onjuiste regelgeving van miRNAs zijn gekoppeld aan een verscheidenheid van fysiologische aandoeningen zoals kanker en hart-en vaatziekten 2,3. Recente studies hebben aangetoond dat de meerderheid van de miRNA regelgeving bindingsplaatsen zijn te vinden in 3&#39;UTRs 4,5, en sommige onderzoekers hebben geschat dat er honderden van doelen per miRNA in de cel 6. Gezien het biologische belang van miRNAs, het grote aantal miRNAs die bestaan ​​en het grote aantal doelstellingen voor elk van hen, is het essentieel dat onderzoekers in staat zijn om betrouwbaar te identificeren endogene doelstellingen van miRNAs, bij voorkeur op platforms vatbaar is voor high-throughput studies. Terwijl met behulp van computationele gereedschappen, zoals miRBase, TargetScan en PicTar 1,6,7 is een krachtige manier om lijsten van vermeende mRNA doelstellingen voor elke miRNA genereren, de voorspellingen zijn nog niet nauwkeurig genoeg om een beroep worden gedaan alleen 8. Daarom onderzoekers leverage ook een aantal experimentele benaderingen om targets te identificeren of de novo te voorspelde targets te valideren. Veel teams hebben vertrouwd op high-throughput metingen van steady-state-mRNA of eiwit niveaus genen voor die tot uitdrukking verandert als miRNA activiteit wordt verstoord 4,9,10 identificeren. Dergelijke veranderingen zijn ongetwijfeld biologisch zinvol en vormen een belangrijke eerste stap, maar het meten van veranderingen in de totale expressie niet tussen de directe effecten van een miRNA te onderscheiden op een transcript en indirecte of stroomafwaarts signalering effecten. Andere krachtige tools die bewijs te leveren voor de directe miRNA-mRNA interacties chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) strategieën die cross-link Argonaute eiwitten (en dus de RISC complex) om miRNAs en mRNA&#39;s, hoewel het identificeren van de interagerende partners niet direct de functionele effecten geven van een dergelijk evenement een bindende 5,11. Zo zijn 3&#39;UTR-reporter assays die functioneel bewijs voor effect een miRNA&#39;s op een bepaalde UTR bieden uitgegroeid tot een belangrijk onderdeel van een grondige miRNA onderzoek. Een dergelijke cel-gebaseerde test gegevens, samen met computationele doel voorspellingen of expressie en proteomics data genomen levert sterke aanwijzingen dat een bepaalde 3&#39;UTR direct wordt geregeld door de miRNA van belang. In een 3&#39;UTR-reporter assay, is de 3&#39;UTR van een gen van belang gefuseerd aan het einde van een luciferase reporter-gen. Als de 3&#39;UTR is een doelwit van een miRNA, zal de verslaggever transcript stabiliteit en / of de vertaling ervan efficiëntie te veranderen met variatie in functionele miRNA concentratie. Dus in tegenstelling tot transcript-only gebaseerde testen, reporter assays helpen bij het identificeren effecten op zowel steady-state mRNA en eiwit niveaus. Reporter systemen kunnen ook worden gebruikt om de functionele effecten van mutagenizing een vermoedelijke miRNA bindingsplaats in een 3&#39;UTR om te bevestigen dat het inderdaad noodzakelijk is voor de interaction8 studie. En terwijl grootschalige studies met behulp van expressie arrays, proteomics technieken en Argonaute ChIP waardevolle genoom-brede gegevens voor een klein aantal experimentele condities, cel-gebaseerde reporter assays zijn het meest vatbaar voor het opschalen van voor de studie van miRNA-3 &#39; UTR interacties in honderden of duizenden van voorwaarden die noodzakelijk zijn voor high-throughput screening van kleine moleculen of andere bibliotheek op basis van effectoren. Veel wetenschappers hebben toegepast reporter test technologie om de studie van miRNA-3&#39;UTR interacties. Echter, met het idee dat veel miRNAs elke doelgroep honderden verschillende transcripten, het is moeilijk geweest voor onderzoekers om deze krachtige aanpak te gebruiken op een high-throughput schaal, omdat het klonen, validatie en optimalisatie van de stappen voor het creëren van duizenden verschillende 3&#39;UTR- reporter vectoren zijn vaak onbetaalbaar. In een poging om kleine-en grootschalige 3&#39;UTR-reporter studies toegankelijk is voor elke onderzoeker te maken, hebben we een genoom-brede verzameling van menselijke 3&#39;UTRs pre-gekloneerd in de zeer geoptimaliseerde LightSwitch Luciferase Assay System. De verslaggever systeem omvat ook de gevalideerde controlemethoden vectoren, een reeks van meer dan 700 synthetische miRNA doelwit reporter constructen voor gebruik als positieve controles, en een reeks van gestandaardiseerde experimentele protocollen. Met behulp van de volgende protocol, kunt u vragen of een bepaalde menselijke 3&#39;UTR is een doel van je miRNA van belang. De kritische stappen in deze workflow zijn experimentele opzet, transfectie van reporter constructen en miRNA nabootst, luciferase reporter assays, en data-analyse. Voor de experimentele opzet, is het belangrijk zorgvuldig selecteert u een transfectable cellijn, experimentele en controle reporter constructen, en miRNA mimiek en non-targeting controles. Vaak zeer transfectable ADHErent cellijnen zoals HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, en anderen vaak goed te werken met dit protocol. Belangrijke opmerkingen over proefopzet De LightSwitch Luciferase Assay System is een volledig geoptimaliseerd verslaggever systeem dat GoClone construeert met behulp van de RenSP luciferase gen en LightSwitch Luciferase Assay reagentia omvat. Gebruik alle componenten van het systeem LightSwitch zoals aanbevolen om een ​​optimale reporter test resultaten te verkrijgen. Co-transfectie van een oligo / plasmiden met Schakelapparatuur GoClone reporter constructen vermindert de totale luciferase signalen in een niet-specifieke manier. Daarom is het belangrijk om de volgende transfectie combinaties: alleen reporter, verslaggever + niet-gerichte controle miRNA, en verslaggever + specifieke miRNA. Onze empty_3UTR vector (een sterke promotor, geen UTR) biedt een zeer hoog niveau van luciferase-signaal en dient als een positieve controle voor transfectie-efficiëntie, en een synthetische miRNA doelwit verslaggever vector kan dienen als een positieve controle voor na te bootsen activiteit. Daarnaast adviseren wij het gebruik van de GoClone 3&#39;UTR huishouden controles en willekeurige controles voor het nauwkeurig scheiden van sequentie-specifieke versus niet-specifieke effecten. Onderzoek uw protocol en waar mogelijk te maken mastermengsels af te nemen de variabiliteit in de gegevens als gevolg van pipetteren fout of verdamping. Dit protocol maakt gebruik van DharmaFect Duo transfectiereagens (Dharmacon). Dag 1 BELANGRIJK TIP: wijs Kies uw cellijn. Voor het beste resultaat, gebruik dan een cellijn waarvan bekend is dat zijn transfectable. We hebben ook geconstateerd dat de meetbare reactie van een 3 &#39;UTR reporter naar een miRNA na te bootsen is verzwakt in cellijnen met een hoge endogene niveau van die bepaalde miRNA. Als je niet weet hoeveel miRNA uw mobiele lijn tot uitdrukking brengt, probeer dan synthetische microRNA SGG-doelstelling die indirect meet de overvloed van een bepaalde miRNA in een cel als u te informeren met betrekking tot het dynamische bereik van uw test. 1. Zaad cellen ≥ 80% confluentie opbrengst op het moment van transfectie. <ol><li> Zaad cellen in een 96-well plaat in wit TC 100μl totale volume. </li><li> Parallel, zaad het juiste aantal cellen in een duidelijke 96-wells plaat voor het beoordelen van samenvloeiing. </li></ol> BELANGRIJK TIP 1: Confluence is de sleutel tot het bereiken van goede resultaten in een na te bootsen experiment. Voor een optimale knockdown, moet cellen 100% confluent op het moment van transfectie. BELANGRIJK TIP 2: Gebruik lage passage cellen voor de beste resultaten. Cellen die zijn gepasseerd te vaak de neiging om luidruchtige transfectie gegevens opleveren. Dag 2 Bereid GoClonereporter bouwt en miRNAs, dan transfecteren in de samenvloeiing cellen. 2. Voor te bereiden constructen <ol><li> Dooi GoClone constructen (plasmide DNA) bij kamertemperatuur. Meng goed. </li><li> Centrifuge om condensatie te verwijderen van de dop. </li></ol> 3. Voor te bereiden Micro RNAs <ol><li> Dooi microRNAs (specifieke imiteert en niet-gericht controles) bij kamertemperatuur en centrifugeer om condensatie te verwijderen uit de doppen. </li><li> Verdunnen tot een werkende concentratie van 2 uM in RNase-vrij water. </li></ol> In aanvulling op een experimentele miRNA na te bootsen ALTIJD een niet-gericht miRNA controle. Co-transfectie een plasmide en een kleine RNA-oligo leidt tot lagere signaal dan transfectie het plasmide alleen. Een of meer positieve controles. Overweeg het gebruik van een van de honderden synthetische miRNA doel reporter vectoren in de catalogus SGG&#39;s. Een of meer negatieve of niet-specifieke controles. SGG heeft een bereik van controles, waaronder 3 &#39;UTR&#39;s van housekeeping genen, willekeurige fragmenten en / of de lege (geen UTR insert) controle. Het gebruik van een of meer van deze controles naast een experimentele constructie zal u toelaten om te normaliseren voor een niet-specifieke effecten toe te schrijven aan de overexpressie van uw specifieke miRNA of het niet-gericht te controleren. 4. Voor te bereiden Transfecties <ol><li> Voor elke transfectie combineren de volgende reagentia voor een test: </li></ol> Mengsel een <table border="1"><tbody><tr><td> Individuele GoClone verslaggever: </td><td> 3,33 pi </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> Varieert * </td></tr><tr><td> Serum-vrije media: </td><td> tot 10 pi </td></tr></tbody></table> * Effectieve concentratie van miRNA kan variëren van 10 nm-100 nM. Neem contact op miRNA fabrikant voor de juiste concentratie. BELANGRIJK TIP: Voeg geen al te veel na te bootsen. Een redelijk bereik voor nabootsen concentraties is 10-50 nm in de finale 100uL reactie. Voer ten minste drie replicate transfecties voor elke behandeling / UTR combinatie en ook extra volume toe te staan ​​voor het pipetteren fout. Bijvoorbeeld, vermenigvuldig de enkele reactie volumes met 3,5 genoeg transfectie mix voor 3 repliceren transfectie putten inclusief extra voor het pipetteren fouten of verdamping te krijgen. Voor elke journalist, opgericht repliceert voor de volgende: reporter alleen, reporter + niet-targeting controle miRNA en verslaggever + specifieke miRNA. Stel transfecties voor het richten microRNA op hetzelfde tijdstip als die voor een niet-gericht te controleren. <ol start="2"><li> Make-up de DharmaFECT DUO (Dharmacon) mengsel als volgt over de transfectie: </li></ol> Mengsel 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 pi </td></tr><tr><td> Serum vrije media: </td><td> 9,85 pi </td></tr></tbody></table> De hoeveelheid DharmaFECT Duo te worden toegevoegd, kunnen cellijn afhankelijk zijn. De bedragen die hierboven aangegeven zijn geschikt voor HT1080 cellen. Raadpleeg de documentatie van de fabrikant om de juiste hoeveelheid te bepalen voor uw cellijn. Tip: Maak een grote transfectie mengsel door vermenigvuldiging van de volumes boven door het aantal verslaggevers, het aantal herhalingen en het aantal miRNAs te testen. Bij de berekening van de transfectie mix voor te bereiden, moet u een klein bedrag extra om rekening te houden pipetteren fouten en verdamping te nemen. <ol start="3"><li> Laat het DharmaFECT Duo mengsel bij kamertemperatuur incuberen gedurende 5 minuten. </li><li> Na 5 minuten, voeg 10μL van de DharmaFECT Duo mengsel (mengsel 2) met elk bereid tube van 10uL plasmide en / of miRNA (mengsel 1). Elke buis moet dan bevatten een volume van 20μL per repliceren transfectie. </li><li> Incubeer elk mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na 20 minuten, voeg 80 ul van voorverwarmde (37 ° C), antibiotica-vrij, complete media per repliceren aan elke buis voor een totaal van 100μL per repliceren transfectie. Een diep-goed blok kan worden gebruikt voor de bereiding van de vele herhalingen en monsters tegelijk. Meng de oplossing door en neer te pipetteren. </li><li> Verwijder de zaadjes plaat uit de incubator. Controleer of de cellen ten minste 80% confluent. </li><li> Voorzichtig pipet uit de media uit elk putje. </li><li> Voeg 100μL van de transfectie mengsel (20uL DNA / reagens mix + 80uL media) aan elk putje. </li><li> Laat de plaat in de broedstoof &#39;s nachts. </li></ol> Niet te broeden. De meeste bootst zal produceren significante resultaten op bona fide targets binnen 24 uur. Het niveau van de repressie meetbaar na 48 uur kan groter zijn, maar zo zal het goed om goed te variabiliteit. Mimic experimenten zijn gemakkelijker dan remmer experimenten. Terwijl de meeste bootst zal aanzienlijk onderdrukken echte doelen binnen 24 uur, belangrijke de-repressie toe te schrijven aan de remmer kan 48 uur meetbaar en zal bijna altijd minder uitgesproken dan het effect van de na te bootsen. Dag 3 Let op: Luciferase assays kan onmiddellijk worden uitgevoerd of de platen kunnen ingevroren worden bij -80 ° C (bevriezen stijgt over het algemeen cel lysis en luciferase signaal). Bevriezen en ontdooien uw cellen voordat het testen voor de beste resultaten. VERGEET NIET op bevroren cellen te ontdooien verhuurd aan kamertemperatuur voordat je LightSwitch Assay Reagens. 5. Meet luciferase activiteit met LightSwitch AssayReagents <ol><li> Verwijder de plaat uit incubator en breng aan de kamertemperatuur. </li><li> Bereid LightSwitch Assay Reagentia (voor de LS010 kit, protocollen van andere kit maten kunnen online te vinden): <ol><li> Reconstitueer 100X ondergrond door het toevoegen van 100μL van de ondergrond Solvent om buis van gevriesdroogde Assay substraat. Beschermen tegen licht en het minimaliseren van de tijd bij kamertemperatuur. 100X substraat kan worden bewaard bij-20C voor 2-3 weken. Voor de beste resultaten, gebruik van vers bereide substraat. </li><li> Bereid Assay Oplossing door ontdooien 10 ml fles of Assay Buffer in water op kamertemperatuur bad en voorafgaande toe te voegen 100μL van gereconstitueerde 100X ondergrond te gebruiken. Meng goed. </li></ol></li><li> Gebruik een multi-channel pipet om 100μL LightSwitch Assay Solution (buffer + substraat) rechtstreeks toevoegen aan elk monster goed (met 100uL cellen + media) in een witte 96-well plaat. Als cellen werden gekweekt in een ander bord of fles formaat, overdracht monsters een witte 96-wells plaat in 100μL totale volume (media of PBS). </li><li> Afdekplaat, beschermen tegen licht, en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Als het testen van meer dan een plaat, toevoeging van de analyse-oplossing, zodat iedere plaat broedt gedurende 30 minuten vóór het lezen wankelen. </li><li> Lees elke goed voor 2 seconden in een plaat armaturennometer (SpectraMax L of gelijkwaardig). </li><li> Bereken de knockdown door het berekenen van luciferase signaal ratio voor elke bouwen voor specifieke miRNA over de niet-gerichte controle (luminescentie = specifiek miRNA / niet-targeting controle). Gebruik de gegevens van huishouden, random, en lege bouwt om te controleren voor niet-UTR specifieke behandeling effecten. </li></ol> Representatieve resultaten 3&#39;UTR doelen in de aanwezigheid van een targeting miRNA zien luciferase knockdown. De knockdown van 3&#39;UTR-luciferase reporter-activiteit door de let-7a werd gemeten in HT1080 cellen door co-transfecteren 100ng van elk reporter bouwen met 20nm let-7a na te bootsen of niet-gerichte controle, incuberen voor 24 uur, dan is het lezen van het luminescerende verslaggever signaal met behulp van LightSwitch Luciferase Assay Reagentia. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. PUNC en ARID3B menselijke 3&#39;UTRs doelwit zijn van de laat-7a microRNA. Signalen van menselijke 3&#39;UTR verslaggevers voor de PUNC en ARID3B genen zijn aanzienlijk neergehaald in de aanwezigheid van de laat-7a microRNA na te bootsen, terwijl signalen voor het huishouden en willekeurige volgorde UTR&#39;s niet.

<ol><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+cancer+connection%3A+the+beginning+of+a+new+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li>
<li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li>
<li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li>
<li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li>
<li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li>
<li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li>
<li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li>
<li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem.+Epub%22%5BJournal%5D)">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

De auteurs zijn werknemers van de schakelapparaten Genomics die er gereedschappen en reagentia die in dit artikel. De productie van dit artikel was gesponsord door Schakelapparatuur Genomics.

We hebben een genoom-brede collectie van pre-gekloonde menselijke 3&#39;UTR-reporter constructen naar studies van miRNA-3&#39;UTR interacties mogelijk in levende cellen. Hier hebben we laten zien een reproduceerbare en high-throughput-methode voor co-transfectie miRNA bootst met 3&#39;UTR-reporters met behulp van een luciferase reporter-systeem. Deze methode is gebaseerd op onderzoekers met behulp van een zeer transfectable cellijn en verstoren miRNA activiteit met een overexpressie techniek. Onderzoekers met behulp van slecht transfectable cellijnen kunnen overwegen het gebruik van onze metgezel lentivirale 3&#39;UTR-reporter collectie gemaakt in samenwerking met Sigma (Mission 3&#39;UTR Lenti GoClones). Behandeling van de cellen met miRNA bootst resulteert in een overexpressie-type experiment, en met een dergelijke studie, onderzoekers moeten rekening mee houden dat dit kan of niet kunnen de werkelijke fysiologische omstandigheden vertegenwoordigen. Om tegemoet te komen overexpressie betreft, kunnen onderzoekers gebruik van miRNA-remmers in aanvulling op nabootst om de interactie met twee verschillende types van verstoring 12-14 studie. Zodra waarschijnlijk miRNA targets geïdentificeerd zijn, kunnen onderzoekers willen de vermoedelijke miRNA bindingsplaatsen mutagenize om te bepalen of de sites zijn noodzakelijk voor de functionele interactie. Zij kunnen ook wensen op te schalen naar het testen van honderden verschillende potentieel doelwit UTR&#39;s (Boutz). Bovendien, als onderzoekers zijn geïnteresseerd of de miRNA transcript is stabiliteit of de vertaling efficiëntie beïnvloeden, kan luciferase reporter gegevens worden vergeleken met de maatregelen van de steady-state transcriptie niveaus. Elke verandering in luciferase signaal dat niet is geassocieerd met een proportionele verandering in de transcript niveaus zal wijzen op een effect op de vertaling efficiency. Tenslotte kunnen onderzoekers gebruiken reporter vectoren maken een dosis-respons curve van de relatieve gevoeligheid van verschillende UTR&#39;s te vergelijken met veranderingen in de miRNA concentratie 14.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Verkoper </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Witte Tissue Culture Platen (96-well solide bodem) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Duidelijke Tissue Culture Platen (96-well) met deksel </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch Luciferase Assay Reagens </td><td> Schakelapparatuur </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo transfectiereagens (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Folie Plate Sealing Tape </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Ademende Plate Sealing Tape </td><td> E &amp; K Scientific </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Plaat Luminometer </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

het identificeren van doelen van human microrna&#39;s met de lightswitch luciferase assay system met behulp van 3&#39;utr-reporter constructen en een microrna mimic in hechtende cellen

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNA (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van de genexpressie en spelen een rol in vele biologische processen. Meer dan 700 menselijke miRNAs Tot nu toe zijn geïdentificeerd met elk tot honderden unieke doelwit mRNA&#39;s. Computationele gereedschappen, expressie en proteomica testen, en de chromatine-immunoprecipitatie-gebaseerde technieken geven belangrijke aanwijzingen voor het identificeren van mRNA&#39;s die direct doelwit van een bepaalde miRNA. Daarnaast hebben 3&#39;UTR-reporter assays uitgegroeid tot een belangrijk onderdeel van een grondige miRNA doelgroep studies omdat ze functioneel bewijs voor en kwantificeren van de effecten van specifieke miRNA-3&#39;UTR interacties in een cel-gebaseerd systeem. In staat te stellen meer onderzoekers om gebruik te maken 3&#39;UTR-reporter assays en de schaal-up van die proeven naar high-throughput niveau te ondersteunen, hebben wij een genoom-brede verzameling van menselijke 3&#39;UTR luciferase reporters in de zeer geoptimaliseerde LightSwitch Luciferase Assay System. Het systeem omvat ook synthetische miRNA doelwit reporter constructen voor gebruik als positieve controle, diverse endogene 3&#39;UTR reporter constructen, en een reeks van gestandaardiseerde experimentele protocollen. Hier beschrijven we een methode voor co-transfectie van de individuele 3&#39;UTR-reporter-constructen, samen met een miRNA na te bootsen, dat is efficiënt, reproduceerbaar, en vatbaar voor high-throughput analyse.

MicroRNA (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie en is aangetoond dat een rol spelen bij talrijke biologische processen. Om beter te begrijpen miRNA-UTR interacties, hebben we een genoom-brede collectie van drie UTR luciferase reporters gepaard met een nieuw luciferase gen en assay reagens, het LightSwitch systeem.

Het identificeren van doelen van Human microRNA&#39;s met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3&#39;UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

Micro-RNA's (miRNA's) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie en spelen een rol in veel biologische processen. Meer dan 700 menselijke miRNA's zijn ...

Het algemene doel van deze procedure is om reporterconstructen samen te transfecteren met een microRNA-mimic om voorspelde microRNA-doelen in menselijke 3'-UTR's te valideren. Dit wordt bereikt door eerst een experimenteel ontwerp op te stellen, waaronder het kiezen van een cellijn en het selecteren van microRNA-mimics samen met experimentele en controle 3'-UTR GoClone reporterconstructen. De adherente cellen worden vervolgens ongeveer 24 uur vóór transfectie gezaaid. De volgende stap van de procedure is het co-transfecteren van elk experimenteel of controle 3'-UTR GoClone reporterconstruct met een microRNA-mimic of een niet-doelwitcontrole, gevolgd door een incubatie van 24 tot 48 uur. Als laatste stap wordt het LightSwitch luciferase assay-reagens rechtstreeks aan de cellen en het medium toegevoegd en wordt het luminescentiesignaal afgelezen op een plaat-luminometer.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen welke menselijke 3' UTR's doelwitten zijn van een gegeven microRNA, door middel van de meting van de luciferase-signaalreductie met reporterassay-technologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor onderzoekers op het gebied van microRNA, omdat het een functionele assay biedt om voorspelde microRNA-3' UTR-doelwitinteracties in levende cellen te valideren. Het experimentele ontwerp begint met de selectie van een geschikte, goed transfecteerbare adherente cellijn; assays met microRNA-mimics werken het beste in cellijnen met lage endogene expressieniveaus van het betreffende microRNA.Select vervolgens het paar van de micro RNA mimic en de non-target controle; het opnemen van een non-target controle is cruciaal, aangezien het gelijktijdig transfecteren van een plasmide en een klein RNA-oligo leidt tot een lager signaal dan het enkel transfecteren van het plasmide. Selecteer daarna de pre-clone 3' UTR Go Clone reporter-constructen uit de genome-wide collectie van Switchgear. Ga naar de online catalogus en klik op de knop voor de UTR-zoekfunctie.Na het invoeren van de lijst met gennamen, gensymbolen of accessienummers, geeft het zoekresultaat vector- en sequentie-informatie samen met de voorraadstatus. Selecteer nu de controle-reporterconstructen. Kies controleconstructen met drie prime ur, die onwaarschijnlijk zijn om als doelwit te dienen voor het gekozen micro RNA, zoals housekeeping-urs of willekeurige fragmenten, om te controleren op aspecifieke effecten van micro RNA-overexpressie op de algemene celgezondheid of het assaysignaal.Overweeg ook het gebruik van een synthetische microRNA-doelreporter als positieve controle voor de mimic-activiteit. Zaai op dag één adherentiecellen met een laag passagegetal, zodat deze 24 uur later, bij transfectie, 80 tot 100% confluent zijn. Het gebruik van sterk confluente cellen is essentieel voor het behalen van goede resultaten. Zaai de cellen in een witte 96-well weefselkweekplaat in een totaalvolume van 100 µL.Parallel. Controleer het juiste aantal cellen in een transparante plaat op plotselinge confluentie op dag 2, 24 uur na het uitplaten van de cellen. Bereid de ontdooiing voor de transfectie voor.Ontdooi de reporterconstructen en micro-RNA's bij kamertemperatuur. Zodra ze zijn ontdooid, goed mengen en de micro-RNA's verdunnen tot een werkconcentratie van 2 µM in RNA-vrij water. Plasmid-DNA wordt geleverd in een concentratie van 30 ng/µL en behoeft geen verdere verdunning. Houd bij het bereiden van het transfectiemengsel rekening met het feit dat elke DNA-RNA-combinatie in triplicaat moet worden getransfecteerd; het volume moet worden geschaald op basis van het aantal uit te voeren assays.Maak het transfectiereagensmengsel door per transfectie 9,85 µL serumvrij medium en 0,15 µL Dharma effect DUO te combineren. Laat het mengsel vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Maak vervolgens voor elke assay het DNA-RNA-mengsel door 3,33 µL van het go clone reporter-construct te combineren met voldoende micro-RNA-mimic om de gewenste eindconcentratie te bereiken.Vul het volume aan tot 10 µL met serumvrij medium. Combineer vervolgens 10 µL van het mengsel van transfectiereagens met 10 µL van elk DNA-RNA-mengsel en meng dit goed. Er is een eindvolume van 20 µL per assay.Dek de wells af en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na incubatie 80 µL voorverwarmd antibioticavrij compleet medium toe voor een totaalvolume van 100 µL per individuele well van de assay, wat resulteert in uiteindelijke mimic-concentraties tussen 10 en 15 nM.Verwijder als laatste stap voorzichtig het medium uit elk putje met gezaaide cellen en vervang dit door 100 microliters van het juiste definitieve transfectiemengsel. Plaats de plaat terug in de incubator en incubeer gedurende 24 tot 48 uur. De meeste mengsels zullen binnen 24 uur significante resultaten opleveren.Een incubatieperiode van 48 uur zal leiden tot een hogere variatie in het signaal tussen de wells. Voer op dag 3, 24 uur na transfectie, luciferase-assays uit met behulp van light switch luciferase assay-reagentia; de cellen kunnen direct worden geanalyseerd of worden ingevroren bij -80 °C om later te worden geanalyseerd. Het toevoegen van een vries-dooi-cyclus zal resulteren in een verbeterde cellyse en een hoger reportersignaal. Breng de plaat met getransfecteerde cellen naar kamertemperatuur.Bereid vervolgens de light switch luciferase assay-oplossing volgens de instructies van de kit en giet deze in een steriel reservoir. Gebruik een meerkanaals pipet om 100 µL light switch assay-oplossing rechtstreeks aan elke sample-well in de witte 96-wells plaat toe te voegen. Dek de plaat af, bescherm deze tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Lees elke well gedurende twee seconden af met een plaat-luminometer. De knockdown van de 3' UTR Luciferase-reporteractiviteit door let-7a werd gemeten in HT 1080-cellen door elk reporterconstruct cotransfecteren met een let-7a-mimic of een non-target-controle om de resultaten te analyseren. Beschouw het signaal van de non-target-controle als 100% voor elk construct.Bereken het knockdown-percentage door het signaal van de specifieke micro RNA-mimic te delen door het signaal van de non-target controle. Elke gegeven micro RNA-mimic kan aspecifieke effecten hebben op de algemene celviabiliteit of het assaysignaal, waarvoor moet worden gecorrigeerd. Vergelijk de knockdown die is waargenomen bij een experimenteel UTR-doel met de knockdown die is waargenomen bij een housekeeping- of willekeurige controle T, zoals hier wordt getoond.De 3'-UTR's van PONC en ARID3B bij de mens zijn doelwitten van let-7a microRNA. Signalen van human 3'-UTR reporters voor de PONC- en ARID3B-genen worden significant onderdrukt in aanwezigheid van de let-7a microRNA-mimic, terwijl signalen voor housekeeping- en willekeurige sequentie-UTR's dat niet zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een succesvolle cotransfectie van microRNA-mimics en 3'-UTR reporterconstructen in levende cellen opzet en hoe u het signaal op een luminometer afleest om de signaalonderdrukking te meten.

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

Circadiane klokken functioneren binnen de individuele cellen, dat wil zeggen, ze zijn cel-autonoom. We beschrijven werkwijzen voor het genereren van cel-autonome klok modellen niet-invasieve, luciferase-gebaseerde real-time bioluminescentie technologie. Reporter cellen handelbaar, functionele modelsystemen voor het bestuderen van circadiane biologie.

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Hier beschrijven we een methode om een ​​gerichte siRNA "ubiquitome" scherm om nieuwe ubiquitine en ubiquitine-achtige regulatoren van de-HIF1a gemedieerde cellulaire respons op hypoxie identificeren voeren. Dit kan worden aangepast aan elke biologische weg wanneer een robuuste uitlezing van reporter-activiteit beschikbaar.

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Luminofore identificatie van functionele elementen in 3’ niet-getransleerde gebieden (3’UTR's) (3’LIFE) is een techniek om functionele regulatie in 3’UTR's door miRNA's of andere regulerende factoren te identificeren. Dit protocol maakt gebruik van high-throughput methodologie zoals 96-well transfectie en luciferase assays om honderden vermeende interacties voor functionele repressie te screenen.

Detectie van miRNA Doelen in High-throughput Met de 3&#39;LIFE Assay

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Dit protocol maakt gebruik van een sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), een sulforhodamine B (SRB) Assay, 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) klonen, en een plaats assay om de doel genen van een Mirna van belang te controleren en om de functies van miRNAs te begrijpen.

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Leer microRNA-doelwitvalidatie in menselijke cellen met het LightSwitch luciferase-assay-systeem en 3'UTR-reporterconstructen. Deze methode meet luciferasesignaal om genregulatie-interacties experimenteel te bevestigen.

Het identificeren van doelen van Human microRNAs met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen (Video) | JoVE Journal

Het identificeren van doelen van Human microRNA's met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3'UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

Meer video's verkennen