Het identificeren van doelen van Human microRNA's met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3'UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

Het algemene doel van deze procedure is om reporterconstructen samen te transfecteren met een microRNA-mimic om voorspelde microRNA-doelen in menselijke 3'-UTR's te valideren. Dit wordt bereikt door eerst een experimenteel ontwerp op te stellen, waaronder het kiezen van een cellijn en het selecteren van microRNA-mimics samen met experimentele en controle 3'-UTR GoClone reporterconstructen. De adherente cellen worden vervolgens ongeveer 24 uur vóór transfectie gezaaid. De volgende stap van de procedure is het co-transfecteren van elk experimenteel of controle 3'-UTR GoClone reporterconstruct met een microRNA-mimic of een niet-doelwitcontrole, gevolgd door een incubatie van 24 tot 48 uur. Als laatste stap wordt het LightSwitch luciferase assay-reagens rechtstreeks aan de cellen en het medium toegevoegd en wordt het luminescentiesignaal afgelezen op een plaat-luminometer.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen welke menselijke 3' UTR's doelwitten zijn van een gegeven microRNA, door middel van de meting van de luciferase-signaalreductie met reporterassay-technologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor onderzoekers op het gebied van microRNA, omdat het een functionele assay biedt om voorspelde microRNA-3' UTR-doelwitinteracties in levende cellen te valideren. Het experimentele ontwerp begint met de selectie van een geschikte, goed transfecteerbare adherente cellijn; assays met microRNA-mimics werken het beste in cellijnen met lage endogene expressieniveaus van het betreffende microRNA.

Select vervolgens het paar van de micro RNA mimic en de non-target controle; het opnemen van een non-target controle is cruciaal, aangezien het gelijktijdig transfecteren van een plasmide en een klein RNA-oligo leidt tot een lager signaal dan het enkel transfecteren van het plasmide. Selecteer daarna de pre-clone 3' UTR Go Clone reporter-constructen uit de genome-wide collectie van Switchgear. Ga naar de online catalogus en klik op de knop voor de UTR-zoekfunctie.

Na het invoeren van de lijst met gennamen, gensymbolen of accessienummers, geeft het zoekresultaat vector- en sequentie-informatie samen met de voorraadstatus. Selecteer nu de controle-reporterconstructen. Kies controleconstructen met drie prime ur, die onwaarschijnlijk zijn om als doelwit te dienen voor het gekozen micro RNA, zoals housekeeping-urs of willekeurige fragmenten, om te controleren op aspecifieke effecten van micro RNA-overexpressie op de algemene celgezondheid of het assaysignaal.

Overweeg ook het gebruik van een synthetische microRNA-doelreporter als positieve controle voor de mimic-activiteit. Zaai op dag één adherentiecellen met een laag passagegetal, zodat deze 24 uur later, bij transfectie, 80 tot 100% confluent zijn. Het gebruik van sterk confluente cellen is essentieel voor het behalen van goede resultaten. Zaai de cellen in een witte 96-well weefselkweekplaat in een totaalvolume van 100 µL.

Parallel. Controleer het juiste aantal cellen in een transparante plaat op plotselinge confluentie op dag 2, 24 uur na het uitplaten van de cellen. Bereid de ontdooiing voor de transfectie voor.

Ontdooi de reporterconstructen en micro-RNA's bij kamertemperatuur. Zodra ze zijn ontdooid, goed mengen en de micro-RNA's verdunnen tot een werkconcentratie van 2 µM in RNA-vrij water. Plasmid-DNA wordt geleverd in een concentratie van 30 ng/µL en behoeft geen verdere verdunning. Houd bij het bereiden van het transfectiemengsel rekening met het feit dat elke DNA-RNA-combinatie in triplicaat moet worden getransfecteerd; het volume moet worden geschaald op basis van het aantal uit te voeren assays.

Maak het transfectiereagensmengsel door per transfectie 9,85 µL serumvrij medium en 0,15 µL Dharma effect DUO te combineren. Laat het mengsel vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Maak vervolgens voor elke assay het DNA-RNA-mengsel door 3,33 µL van het go clone reporter-construct te combineren met voldoende micro-RNA-mimic om de gewenste eindconcentratie te bereiken.

Vul het volume aan tot 10 µL met serumvrij medium. Combineer vervolgens 10 µL van het mengsel van transfectiereagens met 10 µL van elk DNA-RNA-mengsel en meng dit goed. Er is een eindvolume van 20 µL per assay.

Dek de wells af en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na incubatie 80 µL voorverwarmd antibioticavrij compleet medium toe voor een totaalvolume van 100 µL per individuele well van de assay, wat resulteert in uiteindelijke mimic-concentraties tussen 10 en 15 nM.

Verwijder als laatste stap voorzichtig het medium uit elk putje met gezaaide cellen en vervang dit door 100 microliters van het juiste definitieve transfectiemengsel. Plaats de plaat terug in de incubator en incubeer gedurende 24 tot 48 uur. De meeste mengsels zullen binnen 24 uur significante resultaten opleveren.

Een incubatieperiode van 48 uur zal leiden tot een hogere variatie in het signaal tussen de wells. Voer op dag 3, 24 uur na transfectie, luciferase-assays uit met behulp van light switch luciferase assay-reagentia; de cellen kunnen direct worden geanalyseerd of worden ingevroren bij -80 °C om later te worden geanalyseerd. Het toevoegen van een vries-dooi-cyclus zal resulteren in een verbeterde cellyse en een hoger reportersignaal. Breng de plaat met getransfecteerde cellen naar kamertemperatuur.

Bereid vervolgens de light switch luciferase assay-oplossing volgens de instructies van de kit en giet deze in een steriel reservoir. Gebruik een meerkanaals pipet om 100 µL light switch assay-oplossing rechtstreeks aan elke sample-well in de witte 96-wells plaat toe te voegen. Dek de plaat af, bescherm deze tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Lees elke well gedurende twee seconden af met een plaat-luminometer. De knockdown van de 3' UTR Luciferase-reporteractiviteit door let-7a werd gemeten in HT 1080-cellen door elk reporterconstruct cotransfecteren met een let-7a-mimic of een non-target-controle om de resultaten te analyseren. Beschouw het signaal van de non-target-controle als 100% voor elk construct.

Bereken het knockdown-percentage door het signaal van de specifieke micro RNA-mimic te delen door het signaal van de non-target controle. Elke gegeven micro RNA-mimic kan aspecifieke effecten hebben op de algemene celviabiliteit of het assaysignaal, waarvoor moet worden gecorrigeerd. Vergelijk de knockdown die is waargenomen bij een experimenteel UTR-doel met de knockdown die is waargenomen bij een housekeeping- of willekeurige controle T, zoals hier wordt getoond.

De 3'-UTR's van PONC en ARID3B bij de mens zijn doelwitten van let-7a microRNA. Signalen van human 3'-UTR reporters voor de PONC- en ARID3B-genen worden significant onderdrukt in aanwezigheid van de let-7a microRNA-mimic, terwijl signalen voor housekeeping- en willekeurige sequentie-UTR's dat niet zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een succesvolle cotransfectie van microRNA-mimics en 3'-UTR reporterconstructen in levende cellen opzet en hoe u het signaal op een luminometer afleest om de signaalonderdrukking te meten.