Name: Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer de productie en titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren voor effectieve transgeen-afgifte in genetische therapie en neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Zie figuur 1 voor een illustratie waarin de volgende protocol. Veiligheid Opmerking: Alle materiaal dat in contact is geweest met de gemonteerde virale deeltjes moet worden gedesinfecteerd met Virkon oplossing of een ander geschikt desinfectans. 1. De voorbereiding van plasmide DNA voorraden (~ 2 dagen) <ol><li> De volgende plasmiden zijn vereist een: <ul><li> pRV1 - bevattende de AAV2 Rep en Cap sequenties </li><li> pH21 - bevattende de AAV1 Rep en Cap sequenties </li><li> pFdelta6 - Adenovirus-helper plasmide </li><li> AAV plasmide dat het recombinante expressiecassette geflankeerd door AAV2 verpakking signalen (inverted terminal repeats, ITRs) </li></ul></li><li> Terwijl pFdelta6 moeten worden gekweekt in Stbl2 competente cellen op gedeeltelijke verwijdering te voorkomen, kan pRV1 en pH21 worden gekweekt in DH5alpha competente cellen. AAV plasmiden kunnen worden geteeld in Stbl2 cellen als partiële deleties optreden in DH5alpha cellen. </li><li>Plasmide DNA moet van hoge kwaliteit en vrij van verontreinigingen RNA. Plasmiden kunnen worden gescreend op integriteit met de volgende verteert: <ul><li> pRV1 - verteren met Xbal aan banden van 7,5 kb en 3,8 kb te geven </li><li> pH21 - verteren met EcoRI om banden van 4,5 kb, 2,8 kb en 0,2 kb te geven </li><li> pFdelta6 - verteren met HindIII om banden van 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb en 1,5 kb te geven </li></ul></li></ol> 2. Voorbereiding van de Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) cellen voor transfectie (2 - 3 dagen) <ol><li> Plaat twee 80% confluent 150 cm 2 flessen van HEK293 cellen in vijf 15 cm diameter Nunc weefselkweek gerechten. De cellen moeten worden 70 - 80% samenvloeiende voor transfectie (ongeveer 48 uur na plating). Cultuur cellen in standaard Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met een lage glucose met 10% foetaal kalf serum en 100 U / ml penicilline / 100 ug / ml streptomycine. </li><li> 3 uur voor transfectie te verwijderen DMEM en te vervangen door Iscove'S gewijzigde Dulbecco's medium (IMDM) met 5% foetaal kalf serum. </li></ol> 3. Transfectie van virale plasmiden (~ 1 uur voor transfectie, drie dagen voor de incubatie) <ol><li> Bereid het volgende voor een enkele partij (5 x 15 cm weefselkweek platen) van het virus: <ul><li> 62,5 microgram AAV plasmide </li><li> 125 ug pFdelta6 </li><li> 31.25 microgram pRV1 </li><li> 31.25 microgram pH21 </li><li> 1650 pl 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> In een klasse 2 weefselkweek kap steriel filter van de transfectie mengsel in een 50 ml buis. </li><li> Terwijl vortexen de oplossing, snel toevoegen van 13 ml 2 x HEPES-gebufferde zoutoplossing (pH 7,05). Vervang de deksel van 50 ml buis en blijven vortex gedurende 15 seconden. Laten staan ​​gedurende 1 minuut 45 seconden, moet een fijne witte neerslag te vormen. </li><li> Zachtjes voeg 5 ml van de transfectie oplossing voor elke 15 cm weefselkweek schotel. Swirl platen te mengen en terug te keren naar incubator. </li><li> 16 uur na transfectie verwijderen IMDM medium en te vervangen door DMEM. </li></ol> 4. Lyseren van cellen en het oogsten van rAAVs (2 uur) <ol><li> 72 uur na transfectie, verwijder media uit celkweek platen en gooi deze weg. Al het afval dient te worden behandeld met Virkon oplossing of een ander geschikt desinfectans. </li><li> Voorzichtig de cellen wassen in warm 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). </li><li> Voeg 25 ml warm PBS aan elk bord en verwijder voorzichtig cellen met een cel schraper. Verzamel suspensie in 50 ml buizen. </li><li> Pellet cellen op 800 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, gebruik van 10 ml per weefselkweek plaat. Opgesplitst in twee 50 ml buizen. </li><li> Bereid een verse oplossing van 10% natriumdeoxycholaat in dH 2 O. Voeg 1,25 ml van deze aan elke buis voor een uiteindelijke concentratie van 0,5%. Voeg benzonase nuclease tot een uiteindelijke concentratie van 50 eenheden per ml. Meng grondig buis. </li><li incubeer bij c gedurende uur.><li> Verwijder de cellulaire puin door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 15 minuten. Transfer naar verse 50 ml tube, ervoor zorgen dat alle celafval is verwijderd om te voorkomen dat het blokkeren van heparine kolommen (zie stap 5). In dit stadium kunnen de monsters worden bewaard bij -20 ° C voordat u verder gaat. Wij hebben opgeslagen monsters gedurende enkele weken bij -20 ° C zonder een vermindering van de besmettelijkheid. </li></ol> 5. Heparine kolom zuivering van rAAVs (2 - 3 uur) <ol><li> Setup HiTrap heparine kolommen met behulp van een peristaltische pomp, zodat oplossingen stroming door de kolom van 1 ml per minuut voor de stappen die 5,2 tot 5,4. Het is belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen worden ingebracht in de heparine kolom. </li><li> Evenwicht van de kolom met 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Van toepassing zijn 50 ml virus oplossing naar kolom en laat doorstromen. </li><li> Was kolom met 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Met behulp van een 5 ml spuit blijft de kolom w wassenet 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, gevolgd door 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Gooi de flow-through. </li><li> Met behulp van 5 ml spuiten en lichte druk elueren van het virus uit de kolom door het toepassen van: <ul><li> 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> Verzamel deze in een 15 ml centrifugebuis. </li></ul></li></ol> 6. Concentratie en steriele filtratie van rAAVs (1 uur) <ol><li> Concentreer je vector met behulp van Amicon ultra-4 centrifugaal filter units met een moleculair gewicht 100.000 cutoff. Laad 4 ml eluaat van de kolom in de concentrator en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 2 minuten (op kamertemperatuur). Gooi doorstroomsysteem en reload concentrator met de resterende virus oplossing en herhaal centrifugeren. De geconcentreerde volume moet ongeveer 250 ul worden. Als geconcentreerde volume is aanzienlijk meer dan dit, gooi de stroom through en blijven centrifuge in een minuut stappen tot het volume is ongeveer 250 ul. </li><li> Voeg 250 ui PBS om virus voor een eindvolume van 500 pi en verwijderen van de concentrator. </li><li> Filter vector door middel van een 13 mm doorsnede 0,2 micrometer spuitfilter. Vector moet gealiquoteerd en bewaard bij -80 ° C tot de gewenste. </li></ol> 7. Titering van virale voorraden (3 dagen) Dit vereist een promotor die actief is in HEK293 cellen besturen van een reportergen of een immunocytochemically detecteerbaar genproduct. Bij het produceren van een vector die niet compatibel is met HEK293 cellen andere cellijnen of primaire celculturen worden gebruikt. <ol><li> Bereid 18 poly-L-lysine gecoat glas dekglaasjes of 18 putten van Nunc kamer dia's door zaaien HEK293 cellen, zodat deze zijn 40 - 50% confluent. Voor de titratie van Cre-afhankelijke rAAVs gebruiken HEK293 cellen die stabiel uitdrukken Cre recombinase 2. </li><li> Infecteren elk putje met een seriële dilutions van de AAV-vector (afb. 2A). Gebruik 3 putten per verdunning. We routinematig direct toe te voegen virus aan elke well. </li><li> Na 72 uur vast HEK293 cellen door het toevoegen van een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA) tot middelgrote (het geven van een uiteindelijke concentratie van 2% PFA) gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen drie keer in PBS, spoelen in dH 2 O en dekglaasje aan. </li><li> Tel het aantal getransduceerde cellen van de drie putten die de hoogste verdunning factor hebben, maar bevatten nog steeds geïnfecteerde cellen, vind het gemiddelde van deze en vermenigvuldigen met de verdunningsfactor om het aantal infectieuze eenheden per microliter (Fig 2B) te geven. </li></ol> 8. Verwachte resultaten HEK293 cellen getransduceerd met een virus dat codeert voor versterkt groen fluorescent eiwit (eGFP) zijn weergegeven in figuur 2B. Wij over het algemeen een consistente titers van ongeveer 6 x 10 6 infectieuze deeltjes per micro liter. We routinematig gebruik van deze vectoren voor stereotaxische injectie in de volwassen knaagdieren hersenen. Dit zorgt voor een krachtige techniek voor de regio-specifieke genexpressie 2. Naar deze regio specificiteit te combineren met cell-type selectieve genexpressie we Cre recombinase-afhankelijke rAAVs injecteren in doel gebieden van Cre-transgene muizen 2. Figuur 2C-E toont voorbeelden van stereotaxische injecties van Cre-afhankelijke rAAVs codering eGFP in verschillende gebieden van de hersenen van volwassen parvalbumin-Cre transgene muizen 3. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van het protocol voor rAAV productie. 1.) HEK293 cellen worden uitgeplaat en gekweekt tot 70 - 80% samenvloeiing. 2.) AAV en helper plasmiden worden voorbereid en getransfecteerd in HEK293 cellen. 3.) Medium is terug veranderd naar DMEM 16 uur na transfectie en HEK293 cellen worden gekweekt voor een ander 56 uur. 4.) HEK293 cellen geoogst en gelyseerd. rAAV vectoren zijn gescheiden van celresten door centrifugation. 5.) Virale deeltjes worden gezuiverd door middel van heparine kolommen voordat de concentratie en sterilisatie. 6.) HEK293 cellen worden gekweekt op 24 goed platen en met seriële verdunningen van de AAV-vector om het aantal infectieuze eenheden te bepalen infecteren. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Titering en in vivo toepassing van rAAV1 / 2. (A) Instellen van HEK293 cellen voor het meten van virale titer. HEK293 cellen zijn getransduceerd met seriële verdunningen van rAAVs. C, niet-geïnfecteerde controle; N, 1 ui van onverdunde virale voorraad. (B) HEK293 cellen geïnfecteerd met rAAVs uiten eGFP. (CE) Virale eGFP expressie is beperkt tot Cre expressie neuronen in verschillende doelgroepen regio's van parvalbumin-Cre transgene muizen na stereotaxische injectie van Cre-geactiveerde rAAVs. Voorbeelden beelden tonen GFP immunoreactiviteit in (C) van de thalamus en reticulaire globus pallidus, (D) de dentate gyrus en (E) de CA1 regio van de hippocampus. DG, dentate gyrus, RT, reticulaire thalamus kern; GP, globus pallidus. Schaal bars: B, 500 micrometer, C, 100 micrometer, D, 100 micrometer, E, 500 pm.

<ol><li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li>
<li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li>
<li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li>
<li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+type+6+%28AAV6%29+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li>
<li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li>
<li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+serotype+1%2C+2%2C+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li>
<li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%3A+methods+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li>
<li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li>
<li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector%3A+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li>
<li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li>
<li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li>
<li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li>
<li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li>
<li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+%28Tet%29+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

rAAV vectoren zijn steeds waardevol zijn voor in vivo studies bij dieren. Hier hebben we beschreven een eenvoudige en goedkope protocol voor de productie van rAAVs, die de brede toepassing van deze nuttige vector te vergemakkelijken door het vermijden van de dure uitbesteding van het virus de productie aan bedrijven. Het protocol (op basis van referentie 1) beschrijft de productie van chimère rAAV1 / 2 vectoren die capside-eiwitten van beide ouders serotypes bij gelijke verhoudingen 4. De zuivering van het rAAV vectoren door te binden aan heparine kolommen is afhankelijk van de expressie van AAV2 capside-eiwitten, maar kan worden gecombineerd met andere serotypes dan AAV1 hier geschetst. Daarnaast is AAV6 gemeld dat bindt aan heparine, zij het ​​met een verminderde affiniteit, en zou kunnen worden gezuiverd met heparine kolommen met deze procedure 5,6. Het dient echter te worden opgemerkt, dat de andere serotypes zullen verschillende concentraties van NaCl voor heparine kolom-elutie 5,7 vereisen. Verpakking rAAV genomen bleek optimaal te zijn tussen de 4,1 en 4,9 kb met een scherpe daling van de verpakking rendement tot 5,2 kb 8. Deze verpakking limiet kan worden beschouwd als de grootste nadeel van het rAAV systeem, aangezien celtype-specifieke regulering van transgene expressie wordt meestal bereikt door grote cis werkende elementen die niet kunnen worden ondergebracht binnen de kleine AAV deeltjes. Te overwinnen lage titer partijen, zoals die welke voortvloeien uit proberen te pakket genen die dicht bij de AAV verpakking te beperken, hebben wij de combinatie van verschillende virale partijen geconcentreerd tot 250 ul in een 500 pi partij, in plaats van het toevoegen van PBS, zoals beschreven in stap 6.3. Betrouwbare cel-type specifieke transductie kan worden bereikt door het combineren van Cre-driver muizen en voorwaardelijke rAAV cassettes (zie hieronder) om te voorkomen dat het rekken van de verpakking te beperken. Van de nota, terwijl dit protocol pogingen om gemakkelijk te volgen instructies te geven over de productie van hoge titer rAAV, vereist de aanwezigheid van AAV2 capside-eiwit eenheden voor de zuivering van heparine affiniteitschromatografie. Serotypes dan AAV2 moet worden gezuiverd met behulp van alternatieve procedures 9. Een voordeel van heparine kolom zuivering is het wordt verondersteld om AAV vectoren die een grotere snelheid dan infectiviteit geproduceerd die gebruik maken van een cesium chloride gradiënt 10 zijn te produceren. Er zijn echter ook enkele nadelen aan deze methode. Bijvoorbeeld, kunnen andere eiwitten die heparine binden ook aanwezig zijn in het gezuiverde virale voorraad. Terwijl het tropisme van heparine-gezuiverde vectoren kan worden beïnvloed door de vector titer 10, onze benadering van specifiek te richten ofwel prikkelende 20 of remmende neuronen (fig. 2) maakt gebruik van Cre-geïnduceerde activatie van AAV-gemedieerde transgen expressie en is titer-onafhankelijk. Een alternatief voor heparine kolom zuivering is het gebruik van een iodixanol dichtheidsgradiënt, die een hogere virale titer en zuiverder dan de voorbereiding van het gebruik van produceerteen cesium chloride gradiënt 10. Deze methode kan ook worden gecombineerd met heparine kolom zuivering om een vector die groter is dan 99% zuiver 11 te produceren. Daarom is een zorgvuldige afweging moet worden genomen door individuele groepen welke virale zuiveringsmethode het beste is voor hun specifieke downstream toepassing. Het meest voorkomende probleem in verband met dit protocol is een lage virale titer. In onze ervaring kan dit meestal worden teruggevoerd op een lage transfectie-efficiëntie of de elutie van het virus uit de heparine kolommen. Alle transfectie materialen moeten op kamertemperatuur voor transfectie, en test transfecties dient te worden uitgevoerd om de optimale omstandigheden in elk laboratorium te vinden. Andere methoden van transfectie, zoals lipofectamine, zijn zeer efficiënt, maar kan worden onbetaalbaar. Daarnaast is de concentratie en pH van de heparine kolom-elutie-oplossingen is van cruciaal belang voor een volledige elutie van virionen van heparine kolommen Handsfree Console verschaft bestuurdut schade. Een ander belangrijk punt is dat de verpakking cellen goed moet zich houden aan het oppervlak van de weefselkweek gerechten. Als de cellen op een bepaald moment los te maken tijdens de procedure wordt geadviseerd om het experiment en het ontdooien van een nieuwe flacon van cellen te beëindigen. Spatio-temporele controle van transgen-expressie bij knaagdieren wordt gemakkelijk bereikt door nauwkeurige anatomische richten en het ontwikkelingsstadium van het dier. Efficiënte AAV-gemedieerde genoverdracht is aangetoond in de baarmoeder 12,13. In het volwassen brein, kan het gebied besmet zijn met rAAV deeltjes na stereotaxische injectie worden aangepast van zeer kleine specifieke regio&#39;s, veel grotere gebieden, niet alleen door veranderingen in het virale titer, maar ook door het veranderen van de injectie parameters. Deze omvatten het volume en de snelheid van injecties en het opnemen van de polyol mannitol met het virus vering 14. Mannitol kan ook worden gebruikt om infectie van een verscheidenheid van weefsels na de systemische rAAV injectie 15 te vergroten &lt;/ Sup&gt;. De verpakking capaciteit van rAAV (ongeveer 4,7 kb) is waarschijnlijk de meest beperkende factor in termen van de genen die uitgedrukt kan worden uit deze virale vectoren. Echter, recente studies aangetoond dat dit kan deels worden ondervangen door het splitsen van grote genen of expressiecassettes in afzonderlijke rAAV vectoren en de invoering van een overbrugging volgorde, het initiëren van genexpressie als virionen dezelfde cel 16 infecteren. Expressie van genen die door rAAV vectoren kan ook sterk worden verbeterd door gebruik te maken zelf een gratis rAAV vectoren 17. Stereotaxische injectie van rAAV vectoren zorgt voor een snelle, goedkope en krachtige methode voor het induceren van genexpressie in een regio-specifieke wijze. In combinatie met twee van de tweede generatie RNA-interferentie strategieën 18 rAAVs kan ook gebruikt worden voor regio-specifiek gen-knock down. rAAVs kan worden gecombineerd met Cre-transgene muizen of cel-type-specifieke promotors voor circuit-en cel-type te bereiken-Specifieke genexpressie, waardoor genetische manipulaties met een hoge ruimtelijke resolutie 2,19-21, terwijl de montage rAAVs met bv het tet systeem voegt tijdelijk de controle over virus-gemedieerde genexpressie 22,23. Deze voorbeelden illustreren de enorme combinatorische potentieel van deze vectoren en voorspellen een snelle stijging van de rAAV op basis van studies door de jaren heen te komen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Amicon Ultra centrifugale filters </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100.000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Aan te vullen met 10% FCS en 10 eenheden / ml penicillin/100 ug / ml streptomycine </td></tr><tr><td> HEK293 cellen </td><td> American Type Culture Collection </td><td> CRL-1573 </td><td> Gebruik op doorgang minder dan 30 </td></tr><tr><td> HEPES gebufferde zoutoplossing </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap Heparine cartridge </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s medium </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Aan te vullen met 5% FCS </td></tr><tr><td> Natriumdeoxycholaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Het maken van verse oplossing voor elke partij </td></tr><tr><td> 15 cm weefselkweek gerechten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 competente cellen </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon oplossing </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Laat &#39;s nachts desinfecteren voordat teruggooien om uit te lekken </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Specifieke reagentia die nodig zijn voor het protocol

productie en titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In de afgelopen jaren recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV) zijn steeds waardevol zijn voor in vivo studies bij dieren, en zijn momenteel ook getest in klinische proeven op mensen. Wild-type AAV is een niet-pathogene lid van de parvoviridae familie en inherent replicatie-deficiënt. De brede transductie profiel, lage immuunrespons, alsmede de sterke en aanhoudende transgenexpressie bereikt met deze vectoren heeft hen een populair en veelzijdig hulpmiddel voor in vitro en in vivo gen delivery. rAAVs kunnen gemakkelijk en goedkoop geproduceerd in het laboratorium en, op basis van hun gunstige veiligheidsprofiel, zijn over het algemeen krijgen een lage veiligheids-classificatie. Hier beschrijven we een methode voor de productie en titering van chimère rAAVs met de capside-eiwitten van zowel AAV1 en AAV2. Het gebruik van deze zogenaamde chimere vectoren combineert de voordelen van beide ouders serotypes zoals hoge titers voorraden (AAV1) en zuiveringdoor affiniteitschromatografie (AAV2). Deze AAV serotypen zijn de best bestudeerde van alle AAV serotypes, en afzonderlijk hebben een brede infectiviteit patroon. De chimère vectoren hier beschreven moet de besmettelijke eigenschappen van AAV1 en AAV2 en kan dus worden verwacht dat een groot aantal weefsels, waaronder neuronen, skeletspieren, pancreas, nieren onder anderen besmetten. De hier beschreven methode maakt gebruik van heparine kolom zuivering, een methode vermoedelijk een hogere virale titer en schoner virale voorbereiding dan de andere zuiveringsmethoden, zoals centrifugatie door middel van een cesium chloride gradiënt te geven. Daarnaast beschrijven we hoe deze vectoren kunnen snel en eenvoudig worden getitreerd om nauwkeurige lezing van het aantal geproduceerde infectieuze deeltjes te geven.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectoren worden steeds waardevol voor<em&gt; In vivo</em&gt; Studies bij dieren. Beschrijven we hoe rAAVs kan worden geproduceerd in het laboratorium en hoe deze vectoren kan worden getitreerd om een ​​nauwkeurige lezing van het aantal geproduceerde infectieuze deeltjes te geven.

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

In recente jaren zijn recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV) steeds waardevoller geworden voor in vivo studies in dieren, en worden ze momenteel ook ...

Het doel van deze procedure is het produceren van recombinante adeno-geassocieerde virussen of rAAV's voor effectieve in vitro of in vivo transgeen-aflevering. Dit wordt bereikt door eerst HEC 293-cellen te transfecteren met DNA-plasmiden die coderen voor het transgeen en virale genen. De getransfecteerde cellen worden vervolgens losgeschraapt en gelyseerd om de geassembleerde rAAV-partikels te oogsten.Vervolgens worden de rAAV's uit het cellysaat gezuiverd via heparinestroomzuivering. De laatste stap is het concentreren van de virusvoorraden. Uiteindelijk tonen de resultaten een sterke en aanhoudende virus-gemedieerde transgen-expressie via immunofluorescentiemicroscopie.Op dit punt zijn de RA AAV's klaar voor in vitro- of in vivo-toepassingen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van onze techniek ten opzichte van andere zuiveringsmethoden, zoals zuivering via een cesiumchloride-gradiënt, is dat we geen ultracentrifuge of toxische materialen nodig hebben. We verkrijgen bovendien een hogere opbrengst aan zuivere virale vectoren.Bereid vóór aanvang van dit protocol hoogwaardig plasmide-DNA-voorraden voor en controleer deze op integriteit zoals beschreven in het geschreven protocol. Begin met het uitplaten van twee 80% confluente 150 cm² flasks met HEK 293-cellen in vijf weefselkweekschalen van 15 cm diameter; kweek de cellen in standaard DMEM met een laag glucosegehalte en 10% foetaal kalfsserum. Ongeveer 48 uur na het uitplaten, op de dag van transfectie, moeten de cellen drie uur vóór de transfectie een confluentie van 70 tot 80% hebben bereikt.Verwijder het DMEM en vervang dit door met ijs gekoeld, gemodificeerd CHO'S-medium of IMDM met 5% foetaal kalfsserum. Bereid het transfectiemengsel voor een enkele batch virus voor zoals beschreven in het geschreven protocol. Filtreer het transfectiemengsel in een klasse 2 weefselkweekkast steriel in een buis van 50 milliliter; voeg terwijl de oplossing wordt gevortexd snel 13 milliliter twee keer HEPES-gebufferde zoutoplossing toe.Plaats de dop terug op de buis van 50 milliliter en vortex nogmaals 15 seconden. Laat dit een minuut en 45 seconden staan. Er zou een wit neerslag moeten ontstaan. Voeg voorzichtig vijf milliliter van de transfectie-oplossing toe aan elke weefkweekschaal van 15 centimeter.Schud de platen na 16 uur incubatie om te mengen. Verwijder het IMDM, vervang dit door DMEM en incubeer de cellen verder. Om de rAAV's te oogsten.Verwijder het medium uit de celkweekplaten. 72 uur na transfectie en weggooien moet altijd worden behandeld met vercon-oplossing of een ander geschikt desinfectiemiddel. Was de cellen voorzichtig één keer met warme fosfaatgebufferde zoutoplossing.Voeg 25 milliliter warme PBS toe aan elke plaat en verwijder de cellen voorzichtig met een celscraper. Nadat de suspensie is verzameld in buizen van 50 milliliter, worden de cellen gepelletteerd bij 800 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet.Verdeel de suspensie, in 10 milliliter 150 millimolaire natriumchloridebuffer per weefselkweekplaat, over twee buizen van 50 milliliter. Lyseer de cellen vervolgens met een vers bereide oplossing van 10% sodiumdeoxycholaat. Voeg daarna benzoatenuclease toe voor de verwijdering van nucleïnezuren.Incubeer de buisjes na grondig mengen gedurende één uur bij 37 °C. Verwijder na incubatie het celresidu door centrifugatie bij 3000 ×g gedurende 15 minuten. Overbreng de supernatant naar een nieuw buisje van 50 mL en zorg ervoor dat al het celresidu is verwijderd om verstopping van de heparine te voorkomen.Kolommen voor zuivering van r AAVs. Voeg 10 milliliters natriumchloridebuffer toe aan een spuit en stel de high trap heparinekolommen in met een peristaltische pomp, zodat oplossingen met een snelheid van één milliliter per minuut door de kolom stromen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de heparinekolom terechtkomen.Equilibreer de kolom met 10 milliliters van 150 millimolar natriumchloridebuffer. Breng 50 milliliters virusoplossing aan op de kolom en laat de oplossing doorstromen. Was daarna de kolom met 20 milliliters van 100 millimolar natriumchloridebuffer.Gebruik hiervoor een spuit van vijf milliliter. Was de kolom verder met één milliliter 20 millimolaire natriumchloridebuffer, gevolgd door één milliliter 300 millimolaire buffer. Gooi de doorstroomvloeistof weg.Gebruik spuiten van vijf milliliter en lichte druk om het virus uit de kolom te elueren door oplossingen van elution buffers met een toenemende concentratie toe te voegen. Verzamel het eluaat in een centrifugebuis van 15 milliliter. Concentreer de vector met AmCon Ultra vier centrifugefiltereenheden met een molecular weight cutoff van 100.000.Breng vier milliliters van het kolomeluaat over in de concentrator en centrifugeer gedurende twee minuten bij 2000 ×g. Na het herhalen van de centrifugatie moet het geconcentreerde volume ongeveer 250 µL zijn. Verwijder het doorstroomvolume en plaats de concentrator opnieuw met de resterende virusoplossing.Voeg 250 µL PBS toe aan het virus voor een eindvolume van 500 µL en haal dit uit de concentrator. Als laatste stap wordt de vector gefilterd door een spuitfilter van 0,2 µm met een diameter van 13 mm om de virusvoorraad te zuiveren. Bereid 18 met polyol-lysine gecoate glazen dekglasjes voor door HEC 2 9 3-cellen uit te zaaien, zodanig dat ze 40 tot 50% confluent zijn voor de titratie van Cre-afhankelijke rAAV's.Gebruik HEC 2 9 3-cellen die stabiel Cree-recombinase tot expressie brengen. Infecteer elke put met een seriële verdunning van de RAAV-vector zoals beschreven in het geschreven protocol, waarbij drie putten per verdunning worden gebruikt. Fixeer na 72 uur incubatie de HEC 2 9 3-cellen door een gelijk volume 4% formaldehyde aan het medium toe te voegen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, spoel de cellen drie keer af met PBS en één keer met gedestilleerd water. Plaats vervolgens de dekglasjes met behulp van monteermiddel op de objectglazen.Plaats de cellen met de onderzijde naar beneden. Tel het aantal getrenchte cellen in de drie putjes met de hoogste verdunningsfactor die nog steeds geïnfecteerde cellen bevatten. Bereken het gemiddelde hiervan en vermenigvuldig dit met de verdunningsfactor om het aantal infectieuze eenheden per microliter te bepalen; HEC 2 9 3 cellen getransduceerd met een virus dat codeert voor enhanced green fluorescent protein worden getoond.Over het algemeen worden consistente titers van rond de zes keer 10⁶ infectieuze deeltjes per µL behaald. Hier worden voorbeelden getoond van stereotaxische injecties van Cre-afhankelijke rAAV's die coderen voor groen fluorescent eiwit in verschillende hersenregio's van volwassen paralbumine-Cre transgene muizen. De virale expressie van het groen fluorescent eiwit is beperkt tot Cre-expresserende neuronen in de verschillende doelregio's.In dit voorbeeld wordt de immunoreactiviteit van het groen fluorescent eiwit getoond in de reticulaire thalamus en globus pallidus, de gyrus dentatus en de ca1-regio van de hippocampus. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in zeven tot acht dagen voor virusproductie en drie dagen voor titrering worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd.

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare strategie om te produceren, titer en kwaliteitscontrole batches van adeno-associated virus vectoren. Het stelt de gebruiker om de voorbereiding van een vector met hoge-titer (≥1 x 1013 vector genomen/mL) en een hoge zuiverheid, in vitro of in vivo gebruiksklaar.

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor grootschalige productie van onderzoekskwaliteit AAV-vectoren met behulp van adherente HEK 293-cellen gekweekt in celstapels en affiniteitschromatografiezuivering. Dit protocol levert consequent &gt;1 x 1013 vectorgenomen /ml op, wat vectorhoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor grote dierstudies.

Productie van Adeno-geassocieerde virusvectoren in celstapels voor preklinische studies in grote diermodellen

In dit protocol wordt de AAV2-vector geproduceerd door het co-kweken van Spodoptera frugiperda (Sf9) insectencellen met baculovirus (BV)-AAV2-groen fluorescerend eiwit (GFP) of therapeutisch gen en BV-AAV2-rep-cap geïnfecteerde Sf9-cellen in suspensiecultuur. AAV-deeltjes komen vrij uit de cellen met behulp van detergent, worden geklaard, gezuiverd door affiniteitskolomchromatografie en geconcentreerd door tangentiële stromingsfiltratie.

Procesontwikkeling voor de productie en zuivering van Adeno-geassocieerd virus (AAV)2 Vector met behulp van Baculovirus-Insect Cell Culture System

Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) wordt veel gebruikt voor klinische en preklinische genafgifte. Een ondergewaardeerd gebruik van rAAV's is de robuuste transductie van gekweekte cellen zonder dat zuivering nodig is. Voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van rAAV, bieden we een protocol voor het klonen van transgencassettes, de productie van ruwe vectoren en de transductie van celculturen.

Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.

Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Naarmate het gebied van gentherapie zich blijft ontwikkelen, is er een groeiende behoefte aan innovatieve methoden die deze uitdagingen kunnen aangaan. Hier wordt een unieke methode gepresenteerd, die het proces van het genereren van AAV-vectoren met een hoge opbrengst en hoge zuiverheid stroomlijnt met behulp van een celfabrieksplatform, dat voldoet aan de kwaliteitsnormen voor in vivo studies.

Een gestroomlijnde en gestandaardiseerde procedure voor het genereren van adeno-geassocieerde virusvectoren met een hoge titer en hoge kwaliteit met behulp van een Cell Factory-platform

Nauwkeurige kwantificering van kopieën van het vectorgenoom van adeno-geassocieerd virus (AAV) is van cruciaal belang, maar er moet nog een gestandaardiseerd protocol worden opgesteld. Dit protocol beschrijft een gevalideerde methode voor het bereiden van gezuiverde AAV-monsters en het uitvoeren van een digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd_PCR) om de virale genoomtiter betrouwbaar te kwantificeren.

Kwantificering van adeno-geassocieerde virale genomen in gezuiverde vectormonsters door digitale druppelpolymerasekettingreactie

Leer de productie en titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren voor effectieve transgeen-afgifte in genetische therapie en neurowetenschappelijk onderzoek.

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

Meer video's verkennen