Name: Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer een tweestaps affiniteitschromatografie-methode voor het zuiveren van recombinante eiwitten met een klein bispecifiek tag. Dit protocol gebruikt E. coli-expressie en levert zeer zuivere eiwitten voor veeleisende toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gefinancierd door de Knut en Alice Wallenberg Foundation en de Zweedse Research Council.

1. Klonen van het doel gene/ABDz1-tagged fusieconstruct <ol><li> Bereid PCR-fragmenten van de ABDz1 gen geflankeerd door geschikte restrictie-plaatsen voor N-terminale ligatie van het doelwitgen in de expressie plasmide (een plasmide dat ABDz1 is vrij beschikbaar via een Material Transfer Agreement). </li><li> Cleave gezuiverde expressievector en PCR fragmenten met gekozen restrictie-enzymen in een geschikte reactie buffer. Zuiver de producten vóór ligatie. </li><li> Afbinden van de beperkte ABDz1 fragment in de expressievector die het gen van interesse en transformeren de ligatie product tot en met E. coli (in de originele methode van de RR1ΔM15 stam werd gebruikt 8). Verspreid getransformeerde cellen op agar platen aangevuld met geschikte antibiotica voor selectie. </li><li> PCR-scherm een ​​paar kolonies en volgorde controleer de resulterende expressiecassette door DNA-sequencing. </li><li> Bereid plasmide van een 's nachts de cultuur van een reeks verifIED kolonie en om te zetten in de gewenste expressie stam (in de oorspronkelijke methode E. coli Rosetta (DE3), hosting een pRARE plasmide om de productie van eiwitten gecodeerd worden door menselijke genen te verbeteren, werden gebruikt). </li></ol> 2. Eiwitexpressie <ol><li> Inoculeren een enkele bacteriële kolonie in 10 ml van tryptische soja bouillon aangevuld met 5 g / l gistextract en de juiste antibiotica. Incubeer bij 150 tpm bij 37 ° C gedurende de nacht. </li><li> Inoculeren 1 ml overnacht cultuur in 100 ml vers medium en induceren proteïne-expressie (oorspronkelijk 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside bij een lac operon werd gebruikt), wanneer de cellen bereiken de logaritmische groeifase. </li><li> Incubeer bij 150 tpm bij 25 ° C gedurende de nacht en de oogst cellen door centrifugeren. </li></ol> 3. Orthogonale affiniteitszuivering <ol><li> Resuspendeer de pellet in 25 ml lopen buffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) en verstoren ee cellen door sonicatie op 60% amplitude en 1.0/1.0 pulsen gedurende 3 minuten. Centrifugeer het monster en filter het doelwit eiwit bevattende supernatant (0,45 pm) voor verdere zuivering. </li><li> Equilibreren ofwel een 1 ml HSA Sepharose kolom of een NHS-geactiveerde column, die eerder samen met HSA volgens de leverancier de aanbevelingen, met 10 kolomvolumes (CV) van het runnen van buffer bij 1 ml / min op een geschikte eiwitzuivering systeem. Laad de bacteriële lysaat bij 0,5 ml / min en vervolgens het debiet weer op 1 ml / min. </li><li> Was de kolom met 5 CV van lopende buffer, gevolgd door 5 CV van wassen buffer (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5). </li><li> Elueer het monster met elutiebuffer (0,5 M HAc, pH 2,5) op 1 ml / min en het verzamelen van fracties, monitor absorptie bij 280 nm tot fracties van de geëlueerde piek voor verdere zuivering te selecteren. </li><li> Zwembad de fracties met de hoogste eiwitconcentratie, verdunnen twee keer in SuRe lopen buffer (20 mM fosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,2) enZorg ervoor dat de pH-waarde is ongeveer neutraal. Voeg 1 M Tris-HCl pH 8 tot pH, indien nodig te verhogen. </li><li> Laad de steekproef op 0,5 ml / min op een 1 ml HiTrap MabSelect SuRe kolom die is geëquilibreerd met 10 CV van Sure draait buffer is op 1 ml / min. Reset het debiet tot 1 ml / min na het laden. </li><li> Was de kolom met 5 CV van Sure lopen buffer (stap 5) en elueer de eiwitten met 0,2 M HAc, pH 2,7. Voor gevoelige doeleiwitten het eluaat kan direct worden geneutraliseerd bij de inzameling door toevoeging van Tris-HCl. </li></ol> Als de chromatografische stappen omgekeerd het eluaat uit de MabSelect SuRe kolom kan worden verdund in rijklare buffer (stap 3.1) en de pH verhoogd tot ongeveer 8 door toevoeging van 1 M Tris-HCl. In het algemeen worden smaller pieken waargenomen wanneer de Sure matrix is ​​werkzaam in de tweede stap. 4. Evaluatie van de zuiverheid natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) <ol><li> Laad de gezuiverde fracties op eenreducerende SDS-PAGE en, indien gewenst, het molecuulgewicht van het gezuiverde product te analyseren met behulp van massaspectrometrie. Het is belangrijk om volledig te verminderen, omdat het monster een gratis cysteine ​​in ABDz1 kan dimerisatie van het product veroorzaken onder niet-reducerende omstandigheden. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Als een proof of principle, was orthogonale affiniteitszuivering vergemakkelijkt door het ABDz1 tag beoordeeld op drie menselijke doeleiwitten vertegenwoordigers van verschillende oplosbaarheid klassen, molecuulgewichten en iso-elektrische punten (tabel 1). De ABDz1 gen werd genetisch gefuseerd met het doel genen en de constructen werden uitgedrukt in E. coli, Figuur 2 toont een stroomschema voor alle stappen in de methode achtereenvolgens. Na zuivering door de orthogonale protocol, werden monsters verzameld op verschillende punten geanalyseerd door SDS-PAGE (figuur 3). De resultaten tonen duidelijk het nut van een dual-tag en twee zeer specifieke zuiveringsstappen. Ook al redelijk zuiver is achieved na de eerste zuiveringsstap gezien vanaf de gels, de opeenvolgende stap resulteert in een zeer zuiver product geschikt voor veeleisende toepassingen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Ontwerp van de combinatorische bibliotheek wordt gebruikt voor de selectie van het bispecifieke ABDz1 tag. De 46 aminozuur albumine-bindend domein vouwen tot een stabiele drie helix bundel en het bevat een bindingsplaats voor menselijk serum albumine voornamelijk gelegen aan de tweede helix. Door genetisch randomizing elf oppervlak blootgesteld aminozuren zich in de eerste en de derde helix, was een nieuw bindend oppervlak ontworpen. De elf posities zijn aangegeven in de figuur en genummerd volgens Kraulis et al.. 9. Naar aanleiding van biopanning tegen een dimeer van het Z-domein van Staphylococcus proteïne A met de combinatorische bibliotheek tot expressie gebracht op faag, het bispecifieke ABDz1 molecule werd geïdentificeerd. <img alt='"Figuur' src='"/' files> Figuur 2. Een vereenvoudigd stroomschema voor de orthogonale affiniteitszuivering protocol. Een PCR-fragment dat het ABDz1 volgorde wordt geligeerd (N-terminaal) met een gen van interesse in een geschikte expressievector. De ligatie product wordt getransformeerd tot E. coli voor sequentie verificatie en plasmide voorbereiding. Na transformatie naar een uitdrukking host, is een grootschalig cultuur voor recombinant eiwit expressie opgezet vanuit een eerste overnachting cultuur. Bacteriën worden geoogst door centrifugeren en gelyseerd door sonicatie om bacteriële lysaat die het doelwit eiwit te produceren. Na een filtratie stap om resterende vaste deeltjes te verwijderen, is het lysaat onderworpen aan orthogonale affiniteit zuivering op een liquid handling systeem door het ondergaan van twee zuiveringsstappen achter elkaar. Geëlueerd pieken van beide zuivering stappen zijn bemonsterd en beoordeeld door SDS-PAGE om zuiverheid te beoordelen en ten opzichte van thij lysaat vóór de zuivering. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. SDS-PAGE-analyse van target eiwitten tot expressie gebracht en gezuiverd in de fusie met ABDz1. Monsters genomen van de bacteriële lysaat van drie eiwitten, uitgedrukt in fusie te ABDz1, die verschillende eigenschappen, en de ABDz1 tag zelf zijn verzameld, samen met monsters van de overeenkomstige pieken van de reiniging op een HSA-kolom gevolgd door een MabSelect Sure-kolom (A) . Rijstroken 1-4 vertegenwoordigen monsters van lysaten vóór de zuivering, lanen 5-8 van de HSA-zuivering (eerste stap) en steegjes 9-12 van de MabSelect SuRe zuivering (tweede stap). Monsters zijn geladen in de volgende volgorde: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 en ABDz1. Daarnaast werden monsters verkregen uit dezelfde lysaten gezuiverd in de omgekeerde volgorde op dezelfde kolommen geanalyseerd (B). Lanen 1-3 vertegenwoordigen monsters van lysaten vóór de zuivering, lanen 4-6 from MabSelect Sure-zuivering (eerste stap) en lanen 7-9 van de HSA-zuivering (tweede stap). Monsters werden geladen in dezelfde volgorde als in (A), maar de tag zelf is niet inbegrepen. Uit deze resultaten is het duidelijk dat deze twee-staps methode sterk gezuiverde eiwitten levert, ongeacht de volgorde waarin de stappen worden toegepast. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam b </td><td> Doelwiteiwit Uniprot c </td><td> Moleculair gewicht (kDa) </td><td> Oplosbaarheid Klasse D </td><td> Moleculair gewicht van fusie-product (kDa) </td><td> Iso-elektrische punt van fusie-product </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Moleculair gewicht van ABDz1 tag alleen al is 6,3 kDa, iso-elektrisch punt 6.7. </li><li> Doelwit eiwit vertegenwoordigt een deel van de Uniprot eiwit. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> Oplosbaarheid klasse van eiwitfragment met N-terminale Zijn 6 ABP 10. </li></ol> Tabel 1. Target eiwitten en fusion producten met ABDz1 tag een geëvalueerd in een proof of principle studie. Drie unieke humane eiwitten met verschillende moleculair gewicht, oplosbaarheid en iso-elektrisch punt werden gekozen voor expressie en zuivering door de orthogonale affiniteit aanpak.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De orthogonale affiniteitszuivering protocol hier gepresenteerde maakt een efficiënte zuivering van een breed scala van target eiwitten. Door het combineren van de inherente bindingsplaats van de albumine-bindende domein met een nieuwe binding oppervlak, was een klein bispecifiek eiwit-tag ontwikkeld. Het is heel eenvoudig om de tag te gebruiken, omdat het kan eenvoudig worden gekloond en uitgedrukt in fusie met een eiwit van interesse in elke gewenste expressievector. Standaard uitrusting beschikbaar in de meeste laboratoria kan worden toegepast voor de twee-staps eiwitzuivering. Omdat de functie van de ABDz1 tag is afhankelijk van de juiste vouwing van het domein op efficiënte wijze bloot te leggen zijn twee bindende oppervlakken, is de methode beperkt tot de eiwitten die in oplosbare vorm en niet geschikt voor zuiveringen onder denaturerende omstandigheden. Reductiemiddelen moet ook worden vermeden omdat ze interfereren met de binding van ABDz1 aan de Z-domein op de MabSelect SuRe matrix. Orthogonale affiniteit zuiveringTIE biedt een bruikbaar alternatief voor de traditionele methoden om aan de eisen van zeer gezuiverde eiwitten in tal van veeleisende toepassingen voldoen. Tegelijkertijd is deze methode elimineert de noodzaak voor combinatorische tagging wanneer verschillende zuivering strategieën worden gebruikt in successie. Voor toepassingen die een eigen target proteïne, kan een protease-splitsingplaats worden geïntroduceerd om enzymatische verwijdering van de ABDz1 tag mogelijk 11 te maken. Bovendien is de ABDz1 tag is de eerste bispecifieke kleine en gevouwen eiwitdomein beschreven. Het is uniek omdat het een zuivering strategie die hangt af van twee richten zich op specifieke affiniteit interacties. In de toekomst zou het interessant zijn om dit concept uit te breiden door het ontwikkelen van nieuwe bispecifieke tags die nieuwe, bindende oppervlakken die compatibel zijn met direct beschikbaar en goedkope chromatografische harsen dragen. Bijvoorbeeld door het vervangen van de aminozuren die betrokken zijn bij de binding aan albumine met basische residuen, een tag compatibel is met iover de uitwisseling chromatografie kan worden bereikt. Een soortgelijk concept is bewezen effectief door de lading engineering van de Z-domein naar tags bekend als Z-zuur 12 en Z basic 13 compatibel met anion-en kation-uitwisseling te genereren, respectievelijk.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> American Type Culture Collection </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli Rosetta (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> Tryptische soja bouillon </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> Gistextract </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Vibra cel ultrasoonapparaat </td><td> Sonics en materialen </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Voormalig product </td></tr><tr><td> HiTrap MabSelect SuRe </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS-geactiveerde HP column </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonale protein purification gesteund door een small bispecifieke affiniteit tag

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Vanwege de hoge kosten in verband met de zuivering van recombinante eiwitten de protocollen moeten worden gerationaliseerd. Voor high-throughput inspanningen is er een vraag naar algemene methoden die niet nodig doeleiwit specifieke optimalisatie 1. Om dit te bereiken zijn zuivering tags die genetisch kan worden gefuseerd met het gen van belang veelgebruikte 2. De meest gebruikte affiniteit handvat is de hexa-histidine-tag, die geschikt is voor de zuivering is onder zowel autochtone als denaturerende omstandigheden 3. De metabole belasting voor het produceren van de tag is laag, maar het geeft geen zo hoog specificiteit als concurrerende affiniteitschromatografie gebaseerde strategieën 1,2. Hier, een bispecifiek zuivering tag met twee verschillende bindingsplaatsen op een 46 aminozuur, heeft kleine eiwitdomein ontwikkeld. De albumine-bindende domein is afgeleid van streptokokken proteïne G en heeft een sterke eigen affiniteit met humaan serumalbumine(HSA). Elf oppervlak blootgestelde aminozuren, niet betrokken bij albumine-bindende 4, werden genetisch gerandomiseerd naar een combinatorische bibliotheek te produceren. Het eiwit bibliotheek met de nieuwe willekeurig gerangschikt bindend oppervlak (Figuur 1) werd tot expressie gebracht op faag deeltjes om de selectie van bindmiddelen te vergemakkelijken door faag display technologie. Door verschillende rondes van biopanning tegen een dimeer Z-domein afgeleid van Staphylococcus eiwit A 5, een klein, bispecifieke molecuul met affiniteit voor zowel HSA en de roman doel was geïdentificeerd 6. Het nieuwe eiwit domein, aangeduid als ABDz1, werd beoordeeld als een zuivering tag voor een selectie van target eiwitten met verschillende moleculaire gewicht, oplosbaarheid en iso-elektrisch punt. Drie doelgroepen eiwitten werden tot expressie gebracht in Escherishia coli met de nieuwe tag gefuseerd met hun N-uiteinden en daarna affiniteit gezuiverd. Eerste zuivering op ofwel een kolom met geïmmobiliseerd HSA-of Z-domein resulteerde in relatiVely pure producten. In twee stappen affiniteit zuiveren met behulp van de bispecifieke tag geleid tot aanzienlijke verbetering van de proteïne zuiverheid. Chromatografische media met de Z-domein geïmmobiliseerd, bijvoorbeeld MabSelect Zeker, zijn direct beschikbaar voor het zuiveren van antistoffen en HSA kan eenvoudig chemisch worden gekoppeld aan media om de tweede matrix te bieden. Deze methode is vooral voordelig als er een grote vraag op de zuiverheid van de herstelde doelwit eiwit. De bifunctionality van de tag kan twee verschillende chromatografische stappen die moeten worden gebruikt terwijl de metabole belasting van de uitdrukking gastheer is beperkt vanwege de geringe omvang van de tag. Het biedt een concurrerend alternatief voor de zogenaamde combinatorische tagging waar meerdere tags worden gebruikt in combinatie 1,7.

Een roman en zeer efficiënte twee-staps affiniteitschromatografie protocol is ontwikkeld en wordt in detail beschreven. De methode is gebaseerd op een kleine zuivering tag met twee inherente affiniteit en is van toepassing op een breed scala van target eiwitten met verschillende eigenschappen.

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Vanwege de hoge kosten die verbonden zijn aan de zuivering van recombinante eiwitten moeten de protocollen worden gerationaliseerd. Voor high-throughput-inspanningen is er een ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het produceren van zeer zuivere recombinante eiwitten via een tweestaps affiniteitszuiveringsprocedure. Om dit te bereiken, wordt een bispecifieke zuiveringstag op basis van een albumine-bindend domein gekloond in een expressievector die het gen van belang bevat, gevolgd door expressie van het fusie-eiwit in e coli. In een tweede stap wordt het bacteriële lysaat dat het doeleiwit bevat, gezuiverd op een chromatografische kolom met geïmmobiliseerd humaan serumalbumine of HSA.Hierop volgt een aanvullende zuivering op een MAB select superior resistance- of sure-kolom die geïmmobiliseerd Z-domein bevat, afgeleid van staphylococcal proteïne A. Dit resulteert in een zeer zuiver product dat geschikt is voor veeleisende toepassingen. Vervolgens wordt de zuiverheid geëvalueerd via SDS-PAGE en, indien nodig, massaspectrometrie om te bevestigen dat het eiwit van belang succesvol tot homogeniteit is gezuiverd; de resultaten tonen een efficiënte zuivering na twee opeenvolgende stappen in vergelijking met een enkele stap met de in dit protocol gebruikte nieuwe bispecifieke zuiverings tag. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals eenstaps affiniteitszuivering, is dat zuiver eiwit kan worden verkregen via een eenvoudig protocol waarbij slechts één affiniteitshendel wordt gebruikt, ongeacht de eigenschappen van het doeleiwit.Deze methode kan worden gebruikt voor eiwitten met zeer uiteenlopende kenmerken. Bovendien wordt het label, omdat het zeer klein is, gemakkelijk geproduceerd door de bacteriële gastheer. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze zuiveringsprocedure deze zeer eenvoudig en direct vinden.Een cruciale stap is het aanpassen van de pH van uw monster voordat u het op de tweede kolom laadt. Een kleine zuiveringstag met twee inherente affiniteiten werd ontwikkeld door een extra bindingsplaats in een bestaand albumine-bindend domein, afgeleid van streptokokken-proteïne G, te incorporeren. Het albumine-bindende domein van 46 aminozuren vouwt zich tot een stabiel bundel van drie helices en bevat een bindingsplaats voor humaan serumalbumine, die zich hoofdzakelijk op de tweede helix bevindt. Door 11 oppervlakte-blootgestelde aminozuren in de eerste en derde helix genetisch te randomiseren, werden nieuwe bindingsvlakken ontwikkeld. Verschillende rondes biopanning tegen een Z-domein afgeleid van stafylokokken-proteïne A, waarbij de combinatorische bibliotheek op fagen werd tot expressie gebracht, resulteerden in een bispecifiek molecuul genaamd A BDZ one met affiniteit voor zowel HSA als het Z-domein. Om het expressieplasmid voor de bispecifieke fusietag voor te bereiden, worden de PCR-fragmenten van het A BDZ one-gen geproduceerd, geflankeerd door geschikte restrictieplaatsen voor ligatie aan de uiteinden van het doelgen in het expressieplasmid. Splits de A BDZ one PCR-fragmenten en de gezuiverde expressievector die het gen van belang bevat met de gekozen restrictie-enzymen in een geschikte reactiebuffer en zuiver de producten vóór ligatie.Ligeer vervolgens het restrictiefragment A BDZ one in de expressievector die het gen van belang bevat en transformeer het ligatieproduct in e coli. Zaai de getransformeerde cellen uit op agarplaten, aangevuld met geschikte antibiotica voor selectie. Screen enkele kolonies via PCR en verifieer de resulterende expressiecassette door middel van DNA-sequencing.Bereid tot slot het plasmide voor vanuit een overnight-kweek van een sequentie-geverifieerde kolonie en transformeer deze naar de gewenste expressiestam om het doeleiwit tot expressie te brengen. Met de nieuwe tag gefuseerd aan de uiteinden: inoculeer eerst een enkele bacteriële kolonie in 10 milliliters trypticaas-sojabouillon, aangevuld met vijf gram per liter gistextract en de juiste antibiotica; incubeer dit gedurende de nacht bij 150 RPM en 37 °C. Inoculeer de volgende dag één milliliter van de overnight-kweek in 100 milliliters vers medium en induceer de eiwitexpressie.Wanneer de cellen de logaritmische groeifase bereiken. Na proteïne-inductie worden de cellen overnacht geïncubeerd bij 150 RPM en 25 °C; oogst de cellen de volgende dag door middel van centrifugatie. Orthogonale affiniteitszuivering van het A BDZ one-fusieproteïne wordt bereikt via een initiële zuivering op een kolom met geïmmobiliseerd HSA of zoma. Vervolgens wordt een opeenvolgende zuiveringsstap uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van de tweede affiniteit van de bispecifieke tag.Chromatografische media met het geïmmobiliseerde Z-domein, zoals MA select sure, zijn gemakkelijk verkrijgbaar voor de zuivering van antilichamen. Terwijl HSA chemisch aan media gekoppeld kan worden om de tweede matrix te leveren voor een orthogonale affiniteitszuivering, wordt het pellet geresuspendeerd in 25 milliliters loopbuffer. Disrupt vervolgens de cellen door sonificatie bij 60% amplitude en pulsen van één seconde, gevolgd door een pauze van één seconde, voor een totale duur van drie minuten.Filter na het centrifugeren van het monster het supernatant dat het doeleiwit bevat door een filter van 0,45 micron voordat u overgaat tot verdere zuivering. Equilibreer vervolgens een HSA spheros-kolom van één milliliter of een NHS-geactiveerde kolom gekoppeld aan HSA met 10 kolomvolumes loopbuffer met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut op een geschikt eiwitzuiveringssysteem. Laad na equilibratie het bacteriële lysaat met een snelheid van 0,5 milliliter per minuut, zet de stroomsnelheid terug naar één milliliter per minuut en was de kolom met vijf kolomvolumes loopbuffer, gevolgd door vijf kolomvolumes wasbuffer.Elueer het monster met elutiebuffer met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut en verzamel de fracties. Monitor de absorptie bij 280 nm om fracties uit de elutiepiek te selecteren. Combineer voor verdere zuivering de fracties met de hoogste proteïneconcentratie en verdun deze vervolgens twee keer.Zorg voor loopbuffer en controleer of de pH ongeveer neutraal is. Deze stap is cruciaal voor de binding van eiwitten aan het Z-domein. Voeg indien nodig één molair tris HCL pH acht toe om de pH te verhogen.Laad vervolgens het monster met een snelheid van 0,5 milliliters per minuut op een one milliliter high trap MA, select sure-kolom die is geëquilibreerd met sure running buffer. Nadat de stroomsnelheid is teruggezet naar one milliliter per minuut, wordt de kolom gewassen met vijf kolomvolumes sure running buffer. Elueer daarna de eiwitten met 0,2 molar azijnzuur pH 2,7 voor gevoelige doeleiwitten.De EIT kan direct na opvang worden geneutraliseerd door toevoeging van T tris. H-C-L-S-D-S page kan worden gebruikt om de proteinzuiverheid te evalueren. Het is belangrijk om het monster volledig te reduceren, aangezien een vrije cyte in A BDZ one kan leiden tot dimerisatie van het product onder niet-reducerende omstandigheden.Als laatste stap kan het molecuulgewicht van het gezuiverde product worden geanalyseerd met massaspectrometrie na zuivering via het orthogonale protocol op een HSA-kolom, gevolgd door een MA select sure-kolom. Verschillende monsters die op diverse zuiveringspunten zijn verzameld, werden geanalyseerd via SDS-PAGE. De monsters bevatten de A BDZ one-tag zelf, evenals drie verschillende menselijke doelwitproteïnen gefuseerd aan AB DZ one, die verschillende oplosbaarheidsklassen, molecuulgewichten en isoelektrische punten vertegenwoordigen.Baan één tot en met vier tonen eiwitlysaten vóór zuivering voor de drie verschillende AB DZ one fusie-eiwitten en het AB DZ one tag zelf. Baan vijf tot en met acht tonen de resultaten van de HSA-zuiveringsstap van de eiwitten. Tot slot zijn baan negen tot en met 12 het resultaat van de uiteindelijke mAbs select Sure zuiveringsstap.Daarnaast werden hier monsters geanalyseerd die zijn verkregen uit dezelfde lysaten, gezuiverd in omgekeerde volgorde op dezelfde kolommen. Banen één tot en met drie tonen de lysaten vóór zuivering, terwijl banen vier tot en met zes zijn afgenomen na de eerste zuiveringsstap op de MAB Select Sure-kolom. De hoogzuivere producten in baan zeven tot en met negen zijn het resultaat van de uiteindelijke HSA-zuivering.De resultaten tonen duidelijk het nut aan van een dubbele tag en twee zeer specifieke zuiveringsstappen. Hoewel er, zoals te zien is op de gels, na de eerste zuiveringsstap een redelijke zuiverheid wordt bereikt, levert de daaropvolgende stap een zeer zuiver product op dat uitermate geschikt is voor veeleisende toepassingen. Zodra de zuiveringsstap die centraal staat in deze methode onder de knie is, kan deze door één persoon in enkele uren worden uitgevoerd om een zeer zuiver recombinant eiwit te verkrijgen dat geschikt is voor vele verschillende toepassingen.Wanneer deze procedure wordt gevolgd, kunnen de gezuiverde biomoleculen bijvoorbeeld worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals interactiestudies om vragen te beantwoorden over bijvoorbeeld de bindingssterkte van een complex. Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed inzicht moeten hebben in hoe u een echt zuiver eiwitproduct kunt verkrijgen door gebruik te maken van deze dubbele affiniteitstag.

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

Source: Becker, B., et al. A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the purification of a polyhistidine-tagged recombinant protein using nickel-based affinity chromatography. It outlines key steps, including bacterial lysis by sonication, clarification and filtration of the lysate, and selective binding and elution of the target protein using imidazole.

 An Affinity Chromatography Technique for the Purification of a Recombinant Bacterial Protein

In this video, we demonstrate the nickel affinity chromatography technique to purify histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes from Clostridium difficile bacteria.

Nickel Affinity Chromatography-Based Protein Purification: A Technique to Purify Polyhistidine-Tagged Recombinant Proteins from Bacterial Cell Lysate

In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.

GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is veel gebruikt om native complexen te isoleren uit cellulaire extracten, voornamelijk eukaryotisch, voor proteomics. Hier presenteren we een TAP-methodeprotocol dat is geoptimaliseerd voor de zuivering van native complexen voor structurele studies.

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

In deze procedure, een dsred gebaseerde epitoop ligand is geïmmobiliseerd om een zeer selectieve affiniteit hars voor de inname van monoklonale antilichamen van ruwe plantenextracten of celkweek supernatants produceren, als een alternatief voor eiwit a.

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Leer een tweestaps affiniteitschromatografie-methode voor het zuiveren van recombinante eiwitten met een klein bispecifiek tag. Dit protocol gebruikt E. coli-expressie en levert zeer zuivere eiwitten voor veeleisende toepassingen.

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Meer video's verkennen