Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Het algemene doel van het volgende experiment is het produceren van zeer zuivere recombinante eiwitten via een tweestaps affiniteitszuiveringsprocedure. Om dit te bereiken, wordt een bispecifieke zuiveringstag op basis van een albumine-bindend domein gekloond in een expressievector die het gen van belang bevat, gevolgd door expressie van het fusie-eiwit in e coli. In een tweede stap wordt het bacteriële lysaat dat het doeleiwit bevat, gezuiverd op een chromatografische kolom met geïmmobiliseerd humaan serumalbumine of HSA.

Hierop volgt een aanvullende zuivering op een MAB select superior resistance- of sure-kolom die geïmmobiliseerd Z-domein bevat, afgeleid van staphylococcal proteïne A. Dit resulteert in een zeer zuiver product dat geschikt is voor veeleisende toepassingen. Vervolgens wordt de zuiverheid geëvalueerd via SDS-PAGE en, indien nodig, massaspectrometrie om te bevestigen dat het eiwit van belang succesvol tot homogeniteit is gezuiverd; de resultaten tonen een efficiënte zuivering na twee opeenvolgende stappen in vergelijking met een enkele stap met de in dit protocol gebruikte nieuwe bispecifieke zuiverings tag. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals eenstaps affiniteitszuivering, is dat zuiver eiwit kan worden verkregen via een eenvoudig protocol waarbij slechts één affiniteitshendel wordt gebruikt, ongeacht de eigenschappen van het doeleiwit.

Deze methode kan worden gebruikt voor eiwitten met zeer uiteenlopende kenmerken. Bovendien wordt het label, omdat het zeer klein is, gemakkelijk geproduceerd door de bacteriële gastheer. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze zuiveringsprocedure deze zeer eenvoudig en direct vinden.

Een cruciale stap is het aanpassen van de pH van uw monster voordat u het op de tweede kolom laadt. Een kleine zuiveringstag met twee inherente affiniteiten werd ontwikkeld door een extra bindingsplaats in een bestaand albumine-bindend domein, afgeleid van streptokokken-proteïne G, te incorporeren. Het albumine-bindende domein van 46 aminozuren vouwt zich tot een stabiel bundel van drie helices en bevat een bindingsplaats voor humaan serumalbumine, die zich hoofdzakelijk op de tweede helix bevindt. Door 11 oppervlakte-blootgestelde aminozuren in de eerste en derde helix genetisch te randomiseren, werden nieuwe bindingsvlakken ontwikkeld. Verschillende rondes biopanning tegen een Z-domein afgeleid van stafylokokken-proteïne A, waarbij de combinatorische bibliotheek op fagen werd tot expressie gebracht, resulteerden in een bispecifiek molecuul genaamd A BDZ one met affiniteit voor zowel HSA als het Z-domein. Om het expressieplasmid voor de bispecifieke fusietag voor te bereiden, worden de PCR-fragmenten van het A BDZ one-gen geproduceerd, geflankeerd door geschikte restrictieplaatsen voor ligatie aan de uiteinden van het doelgen in het expressieplasmid. Splits de A BDZ one PCR-fragmenten en de gezuiverde expressievector die het gen van belang bevat met de gekozen restrictie-enzymen in een geschikte reactiebuffer en zuiver de producten vóór ligatie.

Ligeer vervolgens het restrictiefragment A BDZ one in de expressievector die het gen van belang bevat en transformeer het ligatieproduct in e coli. Zaai de getransformeerde cellen uit op agarplaten, aangevuld met geschikte antibiotica voor selectie. Screen enkele kolonies via PCR en verifieer de resulterende expressiecassette door middel van DNA-sequencing.

Bereid tot slot het plasmide voor vanuit een overnight-kweek van een sequentie-geverifieerde kolonie en transformeer deze naar de gewenste expressiestam om het doeleiwit tot expressie te brengen. Met de nieuwe tag gefuseerd aan de uiteinden: inoculeer eerst een enkele bacteriële kolonie in 10 milliliters trypticaas-sojabouillon, aangevuld met vijf gram per liter gistextract en de juiste antibiotica; incubeer dit gedurende de nacht bij 150 RPM en 37 °C. Inoculeer de volgende dag één milliliter van de overnight-kweek in 100 milliliters vers medium en induceer de eiwitexpressie.

Wanneer de cellen de logaritmische groeifase bereiken. Na proteïne-inductie worden de cellen overnacht geïncubeerd bij 150 RPM en 25 °C; oogst de cellen de volgende dag door middel van centrifugatie. Orthogonale affiniteitszuivering van het A BDZ one-fusieproteïne wordt bereikt via een initiële zuivering op een kolom met geïmmobiliseerd HSA of zoma. Vervolgens wordt een opeenvolgende zuiveringsstap uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van de tweede affiniteit van de bispecifieke tag.

Chromatografische media met het geïmmobiliseerde Z-domein, zoals MA select sure, zijn gemakkelijk verkrijgbaar voor de zuivering van antilichamen. Terwijl HSA chemisch aan media gekoppeld kan worden om de tweede matrix te leveren voor een orthogonale affiniteitszuivering, wordt het pellet geresuspendeerd in 25 milliliters loopbuffer. Disrupt vervolgens de cellen door sonificatie bij 60% amplitude en pulsen van één seconde, gevolgd door een pauze van één seconde, voor een totale duur van drie minuten.

Filter na het centrifugeren van het monster het supernatant dat het doeleiwit bevat door een filter van 0,45 micron voordat u overgaat tot verdere zuivering. Equilibreer vervolgens een HSA spheros-kolom van één milliliter of een NHS-geactiveerde kolom gekoppeld aan HSA met 10 kolomvolumes loopbuffer met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut op een geschikt eiwitzuiveringssysteem. Laad na equilibratie het bacteriële lysaat met een snelheid van 0,5 milliliter per minuut, zet de stroomsnelheid terug naar één milliliter per minuut en was de kolom met vijf kolomvolumes loopbuffer, gevolgd door vijf kolomvolumes wasbuffer.

Elueer het monster met elutiebuffer met een stroomsnelheid van 1 ml per minuut en verzamel de fracties. Monitor de absorptie bij 280 nm om fracties uit de elutiepiek te selecteren. Combineer voor verdere zuivering de fracties met de hoogste proteïneconcentratie en verdun deze vervolgens twee keer.

Zorg voor loopbuffer en controleer of de pH ongeveer neutraal is. Deze stap is cruciaal voor de binding van eiwitten aan het Z-domein. Voeg indien nodig één molair tris HCL pH acht toe om de pH te verhogen.

Laad vervolgens het monster met een snelheid van 0,5 milliliters per minuut op een one milliliter high trap MA, select sure-kolom die is geëquilibreerd met sure running buffer. Nadat de stroomsnelheid is teruggezet naar one milliliter per minuut, wordt de kolom gewassen met vijf kolomvolumes sure running buffer. Elueer daarna de eiwitten met 0,2 molar azijnzuur pH 2,7 voor gevoelige doeleiwitten.

De EIT kan direct na opvang worden geneutraliseerd door toevoeging van T tris. H-C-L-S-D-S page kan worden gebruikt om de proteinzuiverheid te evalueren. Het is belangrijk om het monster volledig te reduceren, aangezien een vrije cyte in A BDZ one kan leiden tot dimerisatie van het product onder niet-reducerende omstandigheden.

Als laatste stap kan het molecuulgewicht van het gezuiverde product worden geanalyseerd met massaspectrometrie na zuivering via het orthogonale protocol op een HSA-kolom, gevolgd door een MA select sure-kolom. Verschillende monsters die op diverse zuiveringspunten zijn verzameld, werden geanalyseerd via SDS-PAGE. De monsters bevatten de A BDZ one-tag zelf, evenals drie verschillende menselijke doelwitproteïnen gefuseerd aan AB DZ one, die verschillende oplosbaarheidsklassen, molecuulgewichten en isoelektrische punten vertegenwoordigen.

Baan één tot en met vier tonen eiwitlysaten vóór zuivering voor de drie verschillende AB DZ one fusie-eiwitten en het AB DZ one tag zelf. Baan vijf tot en met acht tonen de resultaten van de HSA-zuiveringsstap van de eiwitten. Tot slot zijn baan negen tot en met 12 het resultaat van de uiteindelijke mAbs select Sure zuiveringsstap.

Daarnaast werden hier monsters geanalyseerd die zijn verkregen uit dezelfde lysaten, gezuiverd in omgekeerde volgorde op dezelfde kolommen. Banen één tot en met drie tonen de lysaten vóór zuivering, terwijl banen vier tot en met zes zijn afgenomen na de eerste zuiveringsstap op de MAB Select Sure-kolom. De hoogzuivere producten in baan zeven tot en met negen zijn het resultaat van de uiteindelijke HSA-zuivering.

De resultaten tonen duidelijk het nut aan van een dubbele tag en twee zeer specifieke zuiveringsstappen. Hoewel er, zoals te zien is op de gels, na de eerste zuiveringsstap een redelijke zuiverheid wordt bereikt, levert de daaropvolgende stap een zeer zuiver product op dat uitermate geschikt is voor veeleisende toepassingen. Zodra de zuiveringsstap die centraal staat in deze methode onder de knie is, kan deze door één persoon in enkele uren worden uitgevoerd om een zeer zuiver recombinant eiwit te verkrijgen dat geschikt is voor vele verschillende toepassingen.

Wanneer deze procedure wordt gevolgd, kunnen de gezuiverde biomoleculen bijvoorbeeld worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals interactiestudies om vragen te beantwoorden over bijvoorbeeld de bindingssterkte van een complex. Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed inzicht moeten hebben in hoe u een echt zuiver eiwitproduct kunt verkrijgen door gebruik te maken van deze dubbele affiniteitstag.