Vaste-fase-Submonomer Synthese van peptoïde polymeren en hun zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige en efficiënte methode te beschrijven voor vaste-fase peptidesynthese en de waterige zelfassemblage van peptiden tot sterk geordende nanovellen. Peptiden die structureel lijken op polypeptiden zijn gesubstitueerde glycinepolymeren waarbij de zijketens aan de stikstof zijn gebonden in plaats van aan de alfakoolstof. Het proces begint met het synthetiseren van een specifieke peptidevolgorde via de submonomeermethode.

De sub-monomeermethode bestaat uit twee eenvoudige chemische stappen waarbij elke monomeer opeenvolgend in de keten wordt ingevoegd. Ten eerste wordt een amine dat aan een vaste fase-drager is gebonden, bromoacetylering ondergaan. Ten tweede wordt het bromide vervangen door een primair amine.

Deze stappen worden herhaald tot de gewenste ketenlengte is bereikt. Na de ketenverlenging wordt het peptide van de vaste drager gesplitst en wordt de resulterende ruwe peptide-olie gezuiverd via HPLC en gekarakteriseerd om de zelfassemblage van peptiden tot nanovellen te initiëren. Een verdunde waterige buffersolution van het peptide wordt in een glazen vial bereid en voorzichtig gemengd. Als laatste stap.

De nanovellen worden onder de microscoop onderzocht. De resultaten tonen aan dat een iteratieve cyclus van twee eenvoudige chemische stappen kan leiden tot een sequentie-specifiek polymeer dat spontaan self-assembleert tot nanovellen. Peptiden vormen een nieuwe klasse bio-geïnspireerde polymeren met eigenschappen die tussen die van eiwitten en traditionele polymeren liggen.

Ze zijn robuust en synthetisch veelzijdig zoals traditionele polymeren, maar ook zeer instelbaar en sequentiespecifiek zoals eiwitten en DNA. Peptiden komen op als een geavanceerd materiaal om cruciale problemen in de biomedische wereld en materiaalkunde aan te pakken, zoals de identificatie van bioactieve geneesmiddelen of het ontwerp van kunstmatige eiwitten. De belangrijkste voordelen van peptiden omvatten nauwkeurige sequentiecontrole, de beschikbaarheid van ongelooflijk diverse bouwstenen, efficiënte synthese en protease-stabiliteit. De algemene methode voor manuele peptidesynthese, gebruikmakend van basisapparatuur en commercieel beschikbare reagentia, wordt beschreven, waardoor peptiden in de meeste laboratoria eenvoudig kunnen worden gesynthetiseerd.

Een visuele demonstratie van de synthestappen is cruciaal en dient als een waardevol referentiekader voor personen die in het vakgebied van vaste-fase-synthese stappen. Voor het eerst worden hier de zuivering en karakterisering van een amfifiel peptide van 36 meren beschreven, evenals de zelfassemblage hiervan tot hooggeordende nanovellen. Begin dit protocol met het opstellen van de experimentele apparatuur zoals beschreven in het geschreven protocol.

De volgende stappen worden voor de duidelijkheid uitgevoerd in een glazen reactievat in plaats van in een wegwerpcartridge van gepoedercoat polypropyleen. Nadat 100 milligram R-amidehars in een gefiltreerd reactievat is geplaatst, wordt de hars gezwollen door twee milliliter dimethylformamide of DMF toe te voegen; agiteer door middel van bellenbeluchting gedurende 10 minuten. Drainer vervolgens de oplossing via vacuüm om de gezwollen hars te isoleren.

Voeg vervolgens één milliliter 20%full methyl pyridine in DMF toe om de FM O-groep te ontdoeen. Agiteer gedurende twee minuten en laat het mengsel weglopen. Herhaal dit proces gedurende 12 minuten en spoel daarna de hars door twee milliliter DMF toe te voegen, 15 seconden te agiteren en het mengsel te laten weglopen.

Begin met het groeien van de peptideketen met de eerste submonomeercyclus, die een bromoacetylering en een substitutiestap omvat. Voeg voor de bromoacetylering één milliliter 0,6 M broomazijnzuur in DMF en 86 µL diisopropylcarbodiimide toe. Laat dit 30 minuten agiteren, laat het vervolgens aflopen en spoel na met twee milliliter DMF.

Voer vervolgens de verdringing uit door één milliliter van één tot twee molair amine in end methyl pyro genone toe te voegen en incuberen gedurende 30 tot 120 minuten; draineer na de incubatie en spoel af met twee milliliter DMF. Zet vervolgens verder met de groei van de peptideketen door de sub-monomeercyclus te herhalen. Nadat de laatste verdringing is voltooid, spoelt u af met twee milliliter DMF.

Sluit dit af met een diora methaanwasdop en bewaar het reactievat tot aan de klieving. Om de klieving te starten, brengt u alle gedroogde hars over naar een scintillationglasflesje van 20 milliliter; werk hierbij in een zuurkast en gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Voeg vier milliliter trifluorazijnzuur, of TFA-klievingscocktail, toe aan het scintillationglasflesje en sluit dit af. Roer krachtig gedurende 10 minuten tot twee uur bij kamertemperatuur.

Gebruik alternatief een rotatie-shaker om de oplossing te mengen. Verzamel de TFA-splitsingsoplossing door de hars via een wegwerpbaar polypropyleen gefiltreerd cartridge te filteren in een nieuw, vooraf gewogen scintillation-glasbuisje van 20 milliliter. Voeg vervolgens één milliliter verse splitsingscocktail toe om de hars te spoelen en eventuele resterende peptiden te verzamelen.

Herhaal dit en spoel tweemaal. Verdampt de TFA door een zachte stroom stikstof te blazen of door een biot charge V 10 verdamper te gebruiken; los de ruwe olie op in zes milliliter van een één-op-één mengsel van acetonitril en water.

Bevries vervolgens het monster en lyophiliseer dit. Dit proces moet nogmaals worden herhaald na de tweede lyophilisatie. Registreer het gewicht van het ruwe product, dat als droog poeder bij -20 °C wordt bewaard, middels een combinatie van analytische HPLC en/of electrospray LCMS.

De zuiverheid van het ruwe product en de aanwezigheid van het gewenste molecuulgewicht kunnen worden bepaald door de in de tekst beschreven procedures te volgen. Het ruwe peptide-mengsel kan vervolgens worden gezuiverd met reverse phase prep HPLC volgens de beschreven procedure. Deze sectie beschrijft het protocol voor het vormen van vellen uit een enkelstrengse sequentie-specifieke amfifiele 36 me peptide.

Nadat het peptidekoord is gesynthetiseerd, gezuiverd en gelyofiliseerd, wordt het resulterende witte poeder opgelost in DMSO om een stockoplossing van twee millimolar te maken. Gebruik vervolgens een Dr.Glass-bestand om een peptideoplossing van 20 micromolar te bereiden. Voeg eerst 445 microliter milli Q-water en 50 microliter 10 x sheet-vormingsbuffer toe.

Vortex het flacon om te mengen. Voeg vervolgens 5 µL van een 2 mM peptide-staminaaloplossing toe en laat dit voorzichtig zwellen. De resulterende oplossingsvellen ontstaan door de zachte agitatie van de verdunde waterige peptide-oplossing.

Kantel het afgesloten glazen flacon langzaam van de horizontale naar de rechtopstaande positie. Dit resulteert in het zacht schudden van de vellen, wat ook vellen oplevert. De vellen hebben echter de neiging kleiner te zijn en minder rechte randen voor veel hoogwaardige vellen.

Draai de glazen vials gedurende één dag langzaam om de horizontale as met behulp van een buizenrotator of een aangepaste rocker voor fluorescente kleuring van nanovellen; voeg 1 µL 100 µM Nile red toe aan 100 µL van de nanovellopplossing om een uiteindelijke concentratie van 1 µM Nile red te verkrijgen. Nile red is een omgevingsgevoelige kleurstof waarvan de fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer deze gelokaliseerd is in hydrofobe omgevingen. Maak vervolgens een 1% aros-oplossing in heet water en giet deze in een plastic Petrischaal.

Zorg ervoor dat de aros-oplossing ongeveer een achtste inch dik is en laat de oplossing ongestoord afkoelen op een vlak oppervlak. Nadat de aros is gestold, gebruikt u een spatel om vierkantjes van één centimeter bij één centimeter uit te snijden. Plaats de uitgesneden vierkantjes vervolgens op een glazen objectglas om de vellen op hetzelfde vlak te verzamelen; breng één microliter van de vloeistof voor de vellen aan op het stukje aros.

Na twee minuten moeten de aros de buffer hebben geabsorbeerd, waardoor de vellen aan het oppervlak achterblijven. Maak binnen 15 minuten een afbeelding van het vel. Om vellen en de oplossing te visualiseren, kan er alternatief 15 µL worden geladen in een gasket van 0,12 mm met een diameter van 20 mm op een glazen objectglas.

DekHet monster af met een dekglas en maak binnen enkele dagen beelden om SEM uit te voeren op de nanovellen. Ets eerst siliciumchips met plasma om de absorptie van de nanovellen te bevorderen. Breng vervolgens 20 µL peptidevel-oplossing aan op een plasmabehandeld siliciumsubstraat en laat de oplossing drie minuten inwerken; verwijder het teveil aan oplossing met de punt van een Kimwipe. Pipetteer 20 µL water op het oppervlak en zuig het overtollige vocht opnieuw weg om buffer en zouten te verwijderen.

Als alternatief worden de peptid-sheet-oplossingen gedialyseerd tegen water om buffer en zout te verwijderen. In dit geval kunnen 20 µL van de gedialyseerde sheet-oplossing op de plasmabehandelde siliciumsubstraten worden gedruppeld en aan de lucht worden gedroogd. Nadat de sheet-oplossing op de plasmabehandelde siliciumsubstraten is gedroogd, kan de sheet worden afgebeeld met SEM met behulp van een in-lens-detector bij bundelenergieën tussen 1 kV en 5 kV.

De synthese, karakterisering en zuivering van een sequentie-specifiek 36 me blok-geladen peptide, dat vouwt tot een zeer geordend tweedimensionaal nanovlak, is uitgevoerd. De amines die zijn gebruikt bij de synthese van het 36 me blok-geladen peptide zijn ethyleendiamine, fenethylamine en t-butyl-beta-alanine. Na de synthese werd het ruwe peptide met 95% waterige TFA van de hars afgesplitst.

Nadat de TFA-oplossing was verzameld en ingedampd, werd het ruwe 36 me block charge peptide gezuiverd met reverse phase HPLC. De massa van het gezuiverde block charge peptide werd vervolgens bevestigd via MALDI.

De waargenomen massa van 4981,2 komt nauw overeen met de berekende massa van 4981,74. Het gelyofiliseerde poeder werd opgelost in DMSO om een stockoplossing van twee millimolair te maken en bewaard bij vier graden Celsius. Platen werden geprepareerd volgens het voornoemde protocol en afgebeeld met fluorescentie-optische microscopie.

Er worden diverse vormen waargenomen met kenmerkmaten tot 300 micron, waarbij met name rechte randen opvallen. SEM werd ook gebruikt om de vellen te beeldvormen, wat op soortgelijke wijze prominente rechte randen onthulde. Deze video beschrijft een eenvoudig en efficiënt protocol voor de solid-face synthese van peptiden en de waterige zelfassemblage van peptiden tot nanovellen.

Aangezien er letterlijk honderden amine building blocks gemakkelijk beschikbaar zijn en in dit protocol kunnen worden gebruikt, is de ontwerpruimte die met polypeptiden toegankelijk is praktisch onbeperkt. Peptiden zijn veelbelovende materialen voor biomedisch onderzoek en nanowetenschappen vanwege hun synthetische flexibiliteit, robuustheid en ordening. Op atomair niveau in het bijzonder dienen de nanolagen als een potentieel platform voor tweedimensionale display-steigers, membraanmimetica, biologische sensoren, eiwitmimetica en de fabricage van apparaten.

Het werken met corrosieve reagentia zoals trior, azijnzuur en bromoazijnzuur is uiterst gevaarlijk; om letsel te voorkomen, moeten alle reacties in een zuurkast worden uitgevoerd en dient geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen te worden gedragen.