Name: Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer elektroporatie van craniofaciale mesenchym bij Xenopus laevis embryo's. Deze techniek maakt tijdelijke en ruimtelijke controle van moleculaire tools mogelijk voor onderzoek naar craniofaciale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Nancy Papalopulu en Boyan Bonev voor hulp bij Xenopus elektroporatie. We danken ook Marc Dionne voor kritisch lezen, Jeremy Green en John Wallingford voor nuttige discussies en de leden van de Liu lab voor hun steun. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de BBSRC (BB/E013872/1) en de Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) naar KJL.

Deel 1A. Uitrusting Microscoop: rechtop stereo-ontleden bereik met laag vermogen doel <ul><li> Spanning / Pulse Generator: BTX ECM 830 blokgolf Elektroporatie System </li><li> Pipet trekker: P-87 Micropipet Puller (Sutter Instrument Company, CA) </li><li> Manipulator: grof, of gecombineerde grof en fijn afhankelijk van de voorbereiding. </li><li> Micropipet houder: Fine Science Tools </li><li> Elektrode: zelfgemaakte </li><li> Elektroporatie kamer: zelfgemaakte </li></ul> L-vormige elektroden: <ol><li> Snij 8 cm van hoge zuiverheid 0,4 mm wolfraam draad (Goodfellow) en brengen op middelpunt een 1 ml spuit met behulp van putty (we gebruiken Blu-Tack). Laat 4 cm wolfraam draad bloot van het uiteinde van de spuit en buig tip in L-vorm, 1 cm van het einde (Fig. 1A). </li><li> Trim tip zodat het uiteinde 0,5 mm maatregelen in de lengte. TZijn tip is de elektrode eindpunt. </li><li> Run overtollige wolfraam draad parallel aan de spuit en gebruik deze om de elektrode puls generator aan te sluiten. </li><li> Herhaal het proces maken van een paar elektroden. </li><li> Bevestig de elektroden op blokgolf generator via DC-kabels. </li></ol> Elektroporatie kamer <ol><li> Lijn bodem van 90 mm schotel met ~ 5 mm niet-giftig plasticine. </li><li> Vul de schotel met elektroporatie media. </li><li> Met behulp van nr. 5 horlogemakerij pincet carve een T-vormige goed (afb. 2). De lange goed zou moeten meten ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm en de korte ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. De elektroporatie schotel kan worden gewassen en hergebruikt. </li></ol> Deel 1B. Reagentia DNA of geladen macromoleculen <ul><li> Micropipetten: 1 mm breed 4 &quot;lang borosilicaatglas capillairen (WPI, TW100-F) </li><li> Cultuur media: Normaal Amfibie Media (NAM) </li><li> &gt; 10 X voorraad: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. <ul><li> Autoclaaf en bewaren bij 4 ° C. </li><li> 1 X NAM: verdunnen van 10x voorraad, buffer met 0,1 mM NaHCO 3 en 0,2 mM Na 3 PO 4. </li></ul></li><li> Xenopus laevis kikkervisjes, stage 28 </li></ul> DNA voorbereiding: <ol><li> Bereid expressieplasmiden met behulp van standaard protocollen. </li><li> Resuspendeer DNA tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ul in nuclease gratis H 2 0. </li></ol> * We hebben succes gehad met vectoren die een sterke CMV promoter, zoals pCS2 + [16]. Voor de afstamming analyse, we zijn doorgaans voorzien van DNA dat codeert voor groen fluorescent eiwit (GFP pCS2 +) bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 pg / pl. [DNA-concentraties tussen 0,1-3 ng / ul werden ook getest. We vonden dat de concentraties lager dan 0.8 ng / ul inefficiënt gelabelde cellen, terwijl de DNA-concentraties van meer dan 2 g / &amp; mU; Ik wist niet beter elektroporatie efficiency]. Morfolino oligonucleotide voorbereiding: (Let op:. MO&#39;s dienen te worden fluoresceinated (3&#39;-carboxyfluoresceïne gewijzigd) of anders betalen) <ol><li> Resuspendeer morfolino oligonucleotiden (MO) (Genetools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) bij een concentratie van 2 mM in nuclease gratis H 2 0. </li><li> Warmte hoeveelheid op voorraad oplossing bij 65 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verdun tot uiteindelijke concentratie van 0,5 mM in nuclease vrij water. </li></ol> * 0,1-1mm MO oplossingen werden getest. 0,5 mM MO oplossingen voldoende waren voor elektroporatie van vele mesenchymale cellen. Micropipetten <ol><li> Bereid micropipetten van borosilicaatglas capillairen (1 mm breed, 4 &quot;lang, WPI nee. TW100-F). Gebruik naald trekker te micropipetten te bereiden met een 8-12 mm lange taps en fijne tip. </li><li> Crush tip ~ 2 mmvan de spuitkop en pincet, het creëren van een gekarteld breken. </li></ol> Media <ol><li> Incubatie media: Bereid 3 / 4 Normale Amfibie Media (NAM) van 1x voorraad. Voeg 0,025 mg / ml gentamycine. </li><li> Elektroporatie media: als hierboven, met 0,1% benzocaïne (Sigma, 06950). </li></ol> 2. Elektroporatie Micropipet setup <ol><li> Vul micropipet met ~ 1 ui oplossing voor injectie. </li><li> Secure micropipet in micromanipulator en hechten aan microinjector (Picospritzer II). </li><li> Hoek micropipet op 50 ° ten opzichte van het tafelblad. </li><li> Stel inspuitdruk bij 20 PSI. </li><li> Kalibreren micropipet tot 30 nl per puls injecteren. </li></ol> Tadpole voorbereiding <ol><li> Verdoven stadium 28 Xenopus larven door het incuberen in elektroporatie media voor 5 minuten. </li><li> Overdracht onder narcose kikkervisje in elektroporatie kamer gevuld met elektroporatie media. Positie embryobinnen de lange goed, zodat de hoofdsteunen in de T-splitsing met de dorsale zijde naar beneden en worden blootgesteld buikzijde. Het hoofd enigszins dient te worden verhoogd ten opzichte van de staart. </li><li> Met behulp van een tang voorzichtig veilig kikkervisje goed aan bij omliggende plasticine. (Let op:.. Als het kikkervisje is niet beveiligd, kan trillen en elektrode tijdens elektroporatie contact In dit geval is het kikkervisje als gezichtstissues zal ernstig worden beschadigd weggooien) </li></ol> Elektroporatie <ol><li> Plaats micropipet tip direct plaatsvond na de cement klier en in het gezicht mesenchym. </li><li> Injecteer 30 nl oplossing in mesenchym. </li><li> Schuif micropipet. </li><li> Snel uitlijnen elektrode tips parallel aan het hoofd van het embryo (afb. 3). </li><li> Breng 8 50 ms, 20mV vierkante pulsen. </li><li> Schuif elektroden. </li><li> Met behulp van een tang voorzichtig kikkervisje vrijlating uit de put en transfer naar 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml gentamycine. </li><li> Kikkervisjes kunnen worden geïncubeerd in 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml overnight, of langer. </li><li> Scherm embryo&#39;s voor een efficiënte elektroporatie door fluorescentie microscopie na 24 uur. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Het gebruik van fluorescerende moleculen maakt eenvoudige screening van embryo&#39;s geëlektroporeerd. Figuur 4 toont een typische partij van MO geëlektroporeerd kikkervisjes ~ 12, 48 en 96 uur na elektroporatie, geïncubeerd bij 14,5 ° C. Met behulp van fluorescentie microscopie, kan MO&#39;s zichtbaar worden gemaakt direct na de elektroporatie en aanhouden enkele dagen na elektroporatie. In onze ervaring, fluorescentie is zwak evident in stadium 46 (~ 5 dagen later). In het kraakbeen, fluorescentie daalt dramatisch na het begin van differentiatie (~ 42 st), maar MO fluorescentie blijft sterker in andere celtypen, zoals de faryngeale endoderm. Fluorescentie microscopie laat zien dat oligonucleotiden zijn opgenomen in diverse weefsels waaronder craniofaciale kraakbeen. Oligonucleotide fluorescentie ceen vaak gevisualiseerd worden in het weefsel aan weerszijden van het hoofd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een snelle verspreiding van de injectie-oplossing in de losse craniofaciale mesenchym voorafgaand aan de elektroporatie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg" /> Figuur 1 Homemade elektroden. L-vormige wolfraam draad is bevestigd aan een 1 ml spuit met behulp van niet-giftige klei of stopverf. (A) De elektrode eindpunt maatregelen 5 mm. (B) Bevestig een paar elektroden, zodanig dat de uiteinden parallel lopen. Elektroden zijn bevestigd aan pulsgenerator door DC kabels. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg" /> Figuur 2 Elektroporatie kamer. (A) 90 mm schaal bekleed met plasticine is gevuld met media en een T-vormige kamer gesneden met een pincet nr. 5 horlogemaker&#39;s. (B) De lange zijde hoogte van 2 mm x 2 mm X10 mmterwijl de korte maatregelen 2 mm x 2 mm x 5 mm. Het hoofd van het embryo ligt in de T-splitsing, ventrale zijde naar boven. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg" /> Figuur 3 Schematische illustratie van elektroporatie procedure. St. 28 kikkervisje is geplaatst in elektroporatie kamer, ventrale zijde naar boven. Micropipet wordt ingevoegd in het gezicht mesenchym onderliggende cement klier. Injecteren. Micropipet is verwijderd en L-vormige elektroden zijn opgelijnd parallel aan weerszijden van de kop. Van toepassing acht 50 ms, 20 mV vierkante pulsen. Schuif elektroden. Grow kikkervisjes naar de gewenste fasen. Visualiseer MO of GFP-expressie met behulp van fluorescentie microscopie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg" /> Figuur 4 vertegenwoordiger kikkervisjes 12 (A), 48 (B) en 96 (C) uur na de elektroporatie (fase 30, 34 en 44 respectievelijk). (A &quot;-B&quot;), TL-MO kan worden gevisualiseerd in craniofaciale mesenchym op hertes 30 en 34. Fluorescentie kan worden gedetecteerd in het kraakbeen in fase 44 (pijlpunt, C&#39;-C &quot;). De darm is zeer autofluorescente.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
<li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li>
<li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+BMP4+and+X-delta-1+activity.+Development%22%5BJournal%5D)">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li>
<li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li>
<li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li>
<li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li>
<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflict.

In deze video, hebben we aangetoond dat de haalbaarheid van elektroporatie-gemedieerde gen delivery in het gezicht mesenchym van de Xenopus kikkervisjes. Met deze aanpak kunnen we omzeilen vroeg effecten op de ontwikkeling van het manipuleren van genen de functie waardoor we specifieke weefsels richten op latere tijdstippen. Onze studies tonen aan dat heterogene populaties van craniofaciale mesenchymale cellen kan worden beïnvloed, waardoor we afstamming van geëlektroporeerde cellen en cel-autonome eisen voor eiwitten van belang te bestuderen. In combinatie met live-imaging, kunnen we gebruiken deze aanpak genfunctie studeren, na verloop van tijd, tijdens het craniofaciale ontwikkeling. Deze nieuwe methode benadrukt de traceerbaarheid van Xenopus voor de studie van organogenese. We verwachten dat deze methode kan grofweg worden aangepast aan de morfogenese en differentiatie van andere weefsels studie ook.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

elektroporatie van craniofaciale mesenchym

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporatie is een efficiënte methode van het leveren van DNA en andere geladen macromoleculen in de weefsels op exacte tijdstippen en in de precieze locaties. Bijvoorbeeld, elektroporatie is gebruikt met groot succes tot neurale en het netvlies ontwikkeling studie in Xenopus, kip en muis 1-10. Toch is het belangrijk op te merken dat in al deze studies, onderzoekers niet waren zacht weefsel targeting. Omdat we geïnteresseerd zijn in craniofaciale ontwikkeling, hebben we aangepast een methode om het gezicht mesenchym doel. Wanneer we de literatuur doorzocht, vonden we, tot onze verrassing, zeer weinig meldingen van succesvolle genoverdracht in kraakbeenweefsel. De meerderheid van deze studies zijn gentherapie studies, zoals siRNA of eiwit levering in chondrogene cellijnen, of diermodellen van artritis 11-13. In andere systemen, zoals kip of muis, elektroporatie van gezicht mesenchym is uitdagend (persoonlijke COMMUNICATionen, Dept van craniofaciale ontwikkeling, KCL). Onze hypothese was dat elektroporatie in procartilaginous en kraakbeen weefsels in Xenopus beter zou kunnen werken. In onze studies, laten we zien dat gentransfer in het gezicht kraakbeen gebeurt efficiënt in een vroeg stadium (28), toen het gezicht primordium nog steeds bestaat uit zacht weefsel voorafgaand aan kraakbeen differentiatie. Xenopus is een zeer toegankelijke gewervelde systeem voor de analyse van craniofaciale ontwikkeling. Craniofaciale structuren zijn beter waarneembaar in Xenopus dan in enig andere gewervelde model, vooral omdat Xenopus embryo&#39;s worden extern bevrucht, waardoor analyses van de vroegste stadia, en faciliteren van live-imaging bij enkele cel resolutie, alsmede het hergebruik van de moeders 14. Onder de gewervelde modellen te ontwikkelen extern, Xenopus is meer handig voor craniofaciale analyse dan zebravis, Xenopus als larven zijn groter en makkelijker te dissect, en de zich ontwikkelende gezicht regio is meer toegankelijk voor beeldvorming dan het equivalent regio in vis. Daarnaast, Xenopus is evolutionair dichter bij mensen dan zebravis (~ 100 miljoen jaar dichterbij) 15. Tot slot, in deze stadia, Xenopus kikkervisjes zijn transparant, en de gelijktijdige expressie van fluorescerende eiwitten of moleculen zullen eenvoudige visualisatie van de zich ontwikkelende kraakbeen mogelijk te maken. We verwachten dat deze aanpak zal ons toelaten om snel en efficiënt de kandidaat-moleculen te testen in een in vivo modelsysteem.

Craniofaciale kraakbeen te ontwikkelen in nauw contact met andere weefsels en zijn moeilijk te manipuleren in levende dieren. Wij maken gebruik van elektroporatie van moleculaire tools te leveren tijdens de groei van het craniofaciale skelet, terwijl het omzeilen van de vroege embryonale effecten. Deze aanpak stelt ons in staat om efficiënt te testen kandidaat-moleculen<em&gt; In vivo.</em

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Elektroporatie is een efficiënte methode om DNA en andere geladen macromoleculen op precieze tijdstippen en op precieze locaties in weefsels over te brengen.

Het algemene doel van deze procedure is om geladen macromoleculen via elektroporatie in het craniofaciale mesenchym te brengen. Dit wordt bereikt door eerst een geanestheseerd embryo in stadium 28 in de elektroporatiekamer te plaatsen. De volgende stap is het micro-injecteren van de oplossing die de geladen macromoleculen bevat in het craniofaciale mesenchym.Kort daarna wordt er een elektrische stroom aangelegd, waardoor de geladen nucleotiden in de cellen worden geïntroduceerd. De laatste stap van de procedure is het visualiseren van het ge-electroporeerde weefsel met fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden behaald die veranderingen in craniofaciale weefsels laten zien.Deze resultaten kunnen in vivo of in gefixeerd weefsel worden geanalyseerd met behulp van fluorescentie, microscopie of immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van elektroporatie ten opzichte van bestaande methoden zoals micro-injectie en mutatie is de weefsel- en temporele controle over onze moleculaire instrumenten; Jackie Tabler, een postdoc in mijn laboratorium, zal onze procedure vandaag demonstreren. Het paar L-vormige elektroden dat vereist is voor deze procedure is gemaakt van hoogzuiver wolfraamdraad van 0,4 millimeter; snijd voor elke elektrode eerst acht centimeter van de draad af.Bevestig vervolgens met een kneedbaar bevestigingsmiddel zoals blue tack een spuit van één milliliter op het middelpunt van de wolfraamdraad, waarbij vier centimeter draad vanaf de punt van de spuit vrij blijft. Buig de punt één centimeter vanaf het uiteinde in een L-vorm. Trim de punt zodat het uiteinde een lengte van 0,5 centimeter heeft.Dit uiteinde is de elektrodeaansluiting; laat het overtollige wolfraamdraad parallel aan de spuit lopen. Dit wordt gebruikt om de elektrodepulsgenerator aan te sluiten nadat de tweede elektrode is gemaakt. Bevestig het paar elektroden met tape aan elkaar, zodat de elektrodeaansluitingen parallel lopen met een afstand van één centimeter.Bevestig slutaan de elektroden via DC-kabels aan een blokgolf-pulsgenerator. Om de op maat gemaakte electroporatiekamer voor te bereiden, bekleedt u de bodem van een schaal van 90 millimeter met ongeveer vijf millimeter niet-toxische modelleringsklei (Plaster Scene). Vul de schaal met electroporatiemedium zodat de modelleringsklei volledig is ondergedompeld.Gebruik vervolgens een horlogemakerspincet nummer vijf om een T-vormige put in het gipsen model te kerven om de elektroporatieput te vormen. De lange zijde van de put moet ongeveer 2 mm bij 2 mm bij 10 mm meten, en de korte zijde moet 2 mm bij 2 mm bij 5 mm zijn. De micropipetten voor deze procedure zijn gemaakt van capillairen van silicaatglas.Gebruik een naaldtrekker om micropipetten voor te bereiden met een taps toelopend deel van acht tot 12 millimeter lang en een fijne punt, verbrijzel de punt op ongeveer twee millimeter van het uiteinde met een pincet, waardoor een grillige breuk ontstaat om de micropipet in te stellen. Vul deze vervolgens eerst met ongeveer één microliter injectie-oplossing, die in deze demonstratie fluorescent gelabelde oligonucleotiden bevat. Bevestig daarna de micropipet in een micromanipulator en zet de micropipet onder een hoek van 50 graden ten opzichte van de tafel.Stel de injectiedruk in op 20 PSI en kalibreer de micropipet om 30 liters per puls te injecteren. Voor de voorbereiding op elektroporatie wordt een xeno-larve in stadium 28 geanestheseerd door deze vijf minuten te incuberen. Breng de geanestheseerde kikkervisje over naar de elektroporatiekamer in elektroporatiemedium, wat normaal amfibiemedium is dat 0,1% Benzocaine bevat.Deze is gevuld met elektroporatiemedium. Het lastigste deel van de procedure is het inbrengen van de micropipet in de kikkervisje. Om succes te garanderen, moet u het embryo zeer stevig vastzetten en vervolgens direct na de micro-injectie de stroom toepassen.Positioneer het embryo in de lange put zodanig dat de kop in de T-splitsing rust. Met de dorsale zijde naar beneden en de ventrale zijde blootgesteld, moet de kop iets hoger liggen dan de staart; gebruik een pincet om de kikkervisje voorzichtig in de put te fixeren met het omringende gipsen model. Het is belangrijk om de kikkervisje vast te zetten om te voorkomen dat deze tijdens de elektroporatie trilt, wat kan leiden tot ernstige schade aan het gezichtsweefsel.Om deze procedure te starten, plaatst u de punt van de micropipet direct posterior van de cementklier en in het gelaatmesenchym. Injecteer 30 nanoliters van de oplossing in het mesenchym en trek de micropipet terug. Lijn de elektrodetips snel parallel aan de kop van het embryo uit en dien acht vierkante pulsen van 50 milliseconden en 20 millivolt toe.Trek vervolgens de elektroden terug met een pincet. Haal de kikkervisje voorzichtig uit het putje. Gebruik daarna een pipette om de kikkervisje over te brengen naar driequarter nom met 0,025 mg/mL.Gentamycine-kikkervisjes kunnen in dit medium gedurende de nacht of langer dan 24 uur worden geïncubeerd. Screen de kikkervisjes met fluorescentiemicroscopie op een efficiënte electroporatie. Het gebruik van fluorescerende moleculen maakt een eenvoudige screening van geelectroporeerde embryo's mogelijk.Deze figuur toont een typische batch van met morph-oligonucleotiden ge-electroporeerde kikkervisjes ongeveer 48 en 96 uur na electroporatie, respectievelijk in stadia 30, 34 en 44. Fluorescerende morph-oligonucleotiden kunnen worden gevisualiseerd in het craniofaciale gebied in stadia 30 en 34.In stadium 44 kan fluorescentie worden gedetecteerd in het kraakbeen, aangegeven door de witte pijlpuntjes. Het sterk autofluorescerende gebied is de darm. Met deze procedure kunnen we de afstamming van elektrocellen volgen, evenals de moleculaire vereisten voor eiwitten van belang.Deze benadering kan worden gecombineerd met live-imagingtechnieken om de genfunctie in de loop van de tijd tijdens de craniofaciale ontwikkeling te bestuderen.

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Single-cell elektroporatie (SCE) is een gespecialiseerde techniek waardoor de levering van DNA of andere macromoleculen in individuele cellen in intact weefsel, ook in vivo preparaten. Hier hebben we detail de procedure voor SCE van een fluorescente kleurstof of plasmide DNA in neuronen in de intacte hersenen van de Xenopus laevis kikkervisje.

Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen...

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.

Neonatale Pial Surface Elektroporatie

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Hier presenteren we een protocol dat in vivo elektroporatie en denervatie van de craniale levator auris longus (LAL) spier combineert. Deze procedure maakt het mogelijk om de mogelijke rol van spiereiwitten bij de regeneratie van de neuromusculaire synaps te bestuderen.

Gecombineerde in vivo elektroporatie en kortdurende reïnnervatie van de skeletspier van de craniale levator Auris longus

Hier presenteren we de acute genetische manipulatie van gesneden menselijke corticale organoïden door elektroporatie. Deze corticale organoïdemodellen zijn bijzonder vatbaar voor injectie, aangezien ventrikelachtige structuren gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd na het snijden, waardoor functioneel onderzoek naar de ontwikkeling van de menselijke corticale ontwikkeling, neurologische ontwikkelingsstoornissen en corticale evolutie mogelijk is.

Elektroporatie van gesneden menselijke corticale organoïden voor onderzoek naar de genfunctie

Leer elektroporatie van craniofaciale mesenchym bij Xenopus laevis embryo's. Deze techniek maakt tijdelijke en ruimtelijke controle van moleculaire tools mogelijk voor onderzoek naar craniofaciale ontwikkeling.

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Meer video's verkennen