Protocollen voor Vaginale Inenting en Sample Collection in het experimenteel muismodel van Candida Vaginitis

Het algemene doel van deze procedure is om specifieke procedurele kwesties aan te tonen die verbonden zijn aan het gebruik van het experimentele diermodel voor vaginale candidiasis als middel om de vaginale schimmellast te kwantificeren, en om vaginale of lymfoïde cellen te gebruiken in specifieke analyses, zoals immunologische en histologische analyses. Dit zal worden bereikt door eerst de techniek voor vaginale inoculatie te demonstreren bij met oestrogen behandelde muizen. Vervolgens, na het euthanaseren van de muis, zal een vaginale lavage worden uitgevoerd om candida te herstellen.

Vervolgens worden het vaginale weefsel en/of de vaginale drainerende lymfeklieren uitgenomen. Het spoelvloeistof kan microscopisch worden onderzocht om candida geassocieerd met vaginale epitheelcellen aan te tonen, of op agar worden geplaatst om de vaginale schimmellast te kwantificeren. Een uitstrijkje van de cellulaire fractie kan ook worden gebruikt voor het kleuren van epitheelcellen en lymfoïde cellen.

Het belangrijkste voordeel van het demonstreren van deze techniek is dat gebruikers van het diermodel voor vaginitis dit zo efficiënt en effectief mogelijk kunnen uitvoeren. De kernvragen die met deze techniek worden beantwoord, liggen op het gebied van vaginitis en ecologie en betreffen essentiële vraagstukken zoals immuunresponsen van de gastheer, cellulaire distributie, de effectiviteit van geneesmiddelen, immunotherapeutische werkzaamheid, en tevens de effecten van immunisatie en het aantonen van de techniek. Vandaag zal een promovendus uit mijn laboratorium, Junco Yano, een muis infecteren met C. albicans drie dagen na het toedienen van een injectie met bèta-estradiol.

Begin met het stabiliseren van de muis op een vlak gRED-oppervlak zodat deze grip heeft. Houd vervolgens de basis van de staart met twee vingers vast en til de heup omhoog zodat de vaginale opening naar u toe is gericht. Voer de pipetpunt ongeveer vijf millimeter diep in het vaginale lumen in en pipetteer tot 20 µL van de inoculum suspensie op.

Voer deze stap zo snel en voorzichtig mogelijk uit om stress bij de muis te minimaliseren. Na de gewenste incubatieperiode wordt het dier geëuthanaseerd volgens het protocol van uw faciliteit. Houd de muis vervolgens met twee vingers bij de basis van de staart naar beneden, zodat de vaginale opening met een pipet toegankelijk wordt.

Breng 100 µL steriele PBS aan in het vaginale lumen en voer een spoeling uit door herhaaldelijk te aspireren en te agiteren. Als de pipetpunt verstopt raakt met cellen, verwijder dan de blokkerende cellen en ga verder met spoelen met de resterende PBS. Verzamel het spoelvloeistof in een microcentrifugebuis.

Leg de muis na de vaginale spoelprocedure op de rug en verzadig het liesgebied met 70% ethanol. Til met een pincet de urineopening omhoog zodat de vaginale opening zichtbaar wordt. Voer een gebogen pincet in het vaginale lumen in en lokaliseer de cervix terwijl u een stevige grip met het pincet behoudt.

Extraheer de cervix via de vaginale holte, exciseer de vagina aan de basis van de vaginale opening en verwijder vervolgens de cervix uit de vagina met een chirurgische schaar. Omdat het vaginale weefsel geïnvolutioneerd is, kan dit worden omgekeerd om de oorspronkelijke oriëntatie te behouden, of opengeklapt worden tot een vel door een laterale incisie te maken voor de excisie van de lumbale lymfeklieren terwijl het dier op de rug ligt. Verzadig de abdomen met 70% ethanol.

Maak een laterale incisie vanaf de onderbuik tot aan de borstkas en leg de interne organen vrij met een pincet in beide handen. Verschuif de darmen naar boven zodat de centrale bloedvaten zichtbaar worden. Lokaliseer de vena cava inferior en de abdominale aorta.

Een paar lumbale lymfeklieren kan worden geïdentificeerd naast de abdominale aorta, gelegen ongeveer halverwege de oorsprong van de nieraartieren en de gemeenschappelijke arteria iliaca. Deze lymfeklieren kunnen visueel van vetweefsel worden onderscheiden door hun elastische textuur en hebben een lichtere en meer ondoorzichtige kleur in vergelijking met vetweefsel. Ze zijn bovendien merkbaar groter bij geïnfecteerde dieren vergeleken met niet-geïnoculeerde dieren.

De lymfeklieren werden uit de dieren verwijderd door micro-pincetten onder de klier te plaatsen en deze vervolgens voorzichtig omhoog te trekken om ze van het omliggende weefsel te scheiden. Na het excideren van het weefsel werden de lymfeklieren overgebracht naar een steriel draadgaasscherm in een steriele glazen Petrischaal met ongeveer 10 milliliters Hank's balanced salt solution. Raadpleeg het geschreven protocol voor het isoleren van lymfoïde cellen.

De cellulaire fracties van vaginaal spoelvocht van muizen die ten minste vier dagen daarvoor zijn geïnoculeerd, bestaan doorgaans uit candida-epitheelcellen en cellulaire infiltraten, zoals hier wordt getoond via nat-preparaatmicroscopie. Candida kan worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van PHA alsmede gisten. Hier worden uitstrijkpreparaten van vaginaal spoelvocht gekleurd.

Gebruik de pap-smeartechniek om epitheelcellen en infiltrerende leukocyten te onderzoeken, waarbij de belangrijkste cellen neutrofielen zijn, die kunnen worden geïdentificeerd aan de triloculaire lobben. In niet-geïnoculeerde muizen worden zeer weinig tot geen neutrofielen gedetecteerd. Deze figuur toont een voorbeeld van de vaginale schimmelbelasting.

Vaginaal spoelvocht wordt op specifieke tijdstippen verzameld en gekweekt voor CFU-enumeratie. In dit voorbeeld werd het vocht vijf dagen na inoculatie verzameld, in serie verdund, uitgeplaat en 48 uur geïncubeerd. De kolonies worden vervolgens geteld en de vaginale schimmelbelasting berekend; vaginale kolonisatie of infectie met candida houdt wekenlang aan bij geïnoculeerde muizen die zijn behandeld met oestrogeen.

Terwijl candida er niet in slaagt om vaginale kolonisatie te vestigen bij geïnoculeerde muizen die niet met oestrogen zijn behandeld, blijven niet-geïnoculeerde muizen die wel met oestrogen zijn behandeld gedurende de gehele periode negatief voor candida. Daarnaast kunnen vaginale spoelingen ofwel eenmalig worden uitgevoerd op afzonderlijke muizen per tijdstip, of longitudinaal bij dezelfde muizen onder anesthesie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de dieren stevig vast te zetten om trauma aan de vagina te voorkomen, en neem de nodige tijd om grondig te spoelen om een nauwkeurige vaginale schimmelbelasting te verkrijgen bij het extraheren van het vaginale weefsel.

Gebruik PBS zonder bellen om uitdroging te voorkomen. Wees voorzichtig om geen belangrijke aderen en slagaders te beschadigen bij het verwijderen van de lymfeklieren. Houd de lymfekliercellen tijdens de verwerking op ijs of op vier graden om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u het experimentele muismodel voor candida-vaginitis kunt toepassen om de vaginale schimmellast reproduceerbaar te kwantificeren en vaginale of lymfoïde weefsels te excideren voor specifieke immunologische of histologische analyses.