Protocollen voor Vaginale Inenting en Sample Collection in het experimenteel muismodel van Candida Vaginitis
December 8th, 2011
Belangrijke technieken om te worden gebruikt bij de evaluatie van Candida Vaginitis in een experimenteel diermodel beschreven. De methoden zal een snelle inzameling van vaginale specimens en lymfocyten uit drainerende lumbale lymfeklieren. Deze technieken zou kunnen leiden tot muismodellen van andere ziekten in de vrouwelijke lagere genitale tractus.
Het algemene doel van deze procedure is om specifieke procedurele kwesties te demonstreren die geassocieerd zijn met het gebruik van het experimentele diermodel van vaginale candidiasis als middel om vaginale schimmellast te kwantificeren, en ook om vaginale of lymfoïde cellen te gebruiken in specifieke assays zoals immunologische en histologische assays. Dit zal worden bereikt door eerst de vaginale inoculatietechniek te demonstreren op oestrogeenbehandelde muizen. Vervolgens, na het euthanaseren van de muis, zal een vaginale lavage worden uitgevoerd om candida te herstellen.
Vervolgens worden het vaginale weefsel en/of de vaginale drainerende lymfeklieren geëxtraheerd. Lavagevloeistof kan microscopisch worden bekeken om candida te tonen die geassocieerd is met vaginale epitheelcellen of geplateerd op agar om vaginale schimmellast te kwantificeren. Een uitstrijkje van de cellulaire fractie kan ook worden gebruikt om te kleuren voor epitheelcellen en lymfoïde cellen.
Dus het belangrijkste voordeel van het demonstreren van deze techniek is dat de gebruikers van het diermodel van vaginitis deze het meest efficiënt en effectief kunnen uitvoeren. En de belangrijkste vragen die via de techniek worden beantwoord, liggen op het gebied van vaginitis en ecologie en beantwoorden sleutelvraagstukken zoals gastheer-immuunreacties, cellulaire distributie, werkzaamheid van geneesmiddelen, immunotherapeutische werkzaamheid en ook effecten van immunisatie en het demonstreren van de techniek. Vandaag zal een afgestudeerde student in mijn laboratorium, Junco Yano, een muis infecteren met C albicans drie dagen na het toedienen van een injectie met bèta-oestradiol.
Begin door de muis te stabiliseren op een vlakke gRED-oppervlakte zodat hij grip kan krijgen. Houd vervolgens de basis van de staart met twee vingers en til de heup omhoog zodat de vaginale opening naar u toe gericht is. Voer de pipettentip ongeveer vijf millimeter diep in het vaginale lumen in en pipet tot 20 microliters van de inoculum suspensie.
Voltooi deze stap zo snel en voorzichtig mogelijk om stress bij de muis te minimaliseren. Na de gewenste incubatieperiode, euthanaseert u het dier volgens het protocol voor uw faciliteit. Houd vervolgens de muis met twee vingers naar beneden bij de basis van de staart, zodat de vaginale opening met een pipette wordt blootgesteld.
Breng 100 microliter steriele PBS in het vaginale lumen in en voer met herhaald afzuiging en agitatie lavage uit. Als de pipettentip verstopt raakt met cellen, verwijder de obstructieve cellen en blijf lavage uitvoeren met de resterende PBS. Verzamel de lavagevloeistof in een microcentrifugebuisje.
Na de vaginale lavageprocedure, legt u de muis op zijn rug en verzadig de liesstreek met 70%ethanol. Gebruik een paar pincetten om de urineopening omhoog te brengen zodat de vaginale opening wordt blootgesteld. Breng een paar gebogen pincetten in het vaginale lumen in en lokaliseer de baarmoederhals terwijl u een stevige grip op de pincetten handhaaft.
Trek de baarmoederhals door de vaginale holte, verwijder de vagina aan de basis van de vaginale opening en verwijder vervolgens de baarmoederhals uit de vagina met chirurgische schaar. Omdat het vaginale weefsel is ingevoleerd, keert u het om om de oorspronkelijke oriëntatie te behouden of opent u het in een blad door een laterale incisie te maken voor excisie van de lumbale knoop met het dier op zijn rug. Verzadig de buik met 70%ethanol.
Maak een laterale incisie vanaf de onderbuik tot de borstkas en leg de inwendige organen bloot met een paar pincetten in beide handen. Verplaats de darmen omhoog zodat de centrale bloedvaten zichtbaar worden. Lokaliseer de inferior vena cva en de abdominale aorta.
Een paar lumbale lymfeklieren kunnen worden geïdentificeerd naast de abdominale aorta, ongeveer halverwege tussen de oorsprong van de renale en gemeenschappelijke iliacale arteriën. Deze lymfeklieren kunnen visueel worden onderscheiden van vetweefsel door hun elastische textuur en zijn lichter en meer ondoorzichtig van kleur in vergelijking met vetweefsel. Ze zijn ook merkbaar groter bij geïnfecteerde dieren in vergelijking met niet-geïnfecteerde.
Dieren verwijderen de lymfeklieren door micropincetten onder de knoop te plaatsen en vervolgens voorzichtig omhoog te trekken om ze te scheiden van het omliggende weefsel. Na het verwijderen van het weefsel, brengt u de lymfeklieren over naar een steriele draadgaasscherm geplaatst in een steriele glazen petrischaal bevattende ongeveer 10 milliliter Hank's gebalanceerde zoutoplossing. Raadpleeg het geschreven protocol om lymfoïde cellen te isoleren.
De cellulaire fracties van vaginale lavagevloeistof van muizen die minstens vier dagen eerder zijn geïnoculeerd, bestaan typisch uit candida-epitheelcellen en cellulaire infiltraten, zoals hier door nat-monter microscopie wordt getoond. Candida kan worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van PHA evenals gist. Hier worden uitstrijkjespreparaten van vaginale lavagevloeistof gekleurd.
Gebruik de pap-smeartechniek om epitheelcellen en infiltrerende leukocyten te onderzoeken, waarvan de belangrijkste cellen neutrofielen zijn, zoals kan worden geïdentificeerd door de tracleare lobben. Zeer weinig neutrofielen, indien aanwezig, worden gedetecteerd bij niet-geïnfecteerde muizen. Deze figuur toont een voorbeeld van vaginale schimmellast.
Vaginale lavagevloeistof wordt verzameld op specifieke tijdstippen en gekweekt voor CFU-enumeratie. In dit voorbeeld werd de vloeistof op dag vijf na inoculatie, serieel, verdund, geplateerd en gedurende 48 uur geïncubeerd. Kolonies worden vervolgens geteld en vaginale schimmellast wordt berekend. Vaginale kolonisatie of infectie met candida blijft wekenlang bestaan bij oestrogeenbehandelde geïnfecteerde muizen.
Terwijl candida geen vaginale kolonisatie tot stand brengt bij niet-oestrogeenbehandelde geïnfecteerde muizen, blijven oestrogeenbehandelde niet-geïnfecteerde muizen gedurende de gehele tijd negatief voor candida. Bovendien kunnen vaginale lavages eenmalig worden uitgevoerd op afzonderlijke muizen bij elk tijdstip of longitudinaal in dezelfde muizen onder anesthesie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft belangrijke technieken voor het evalueren van Candida vaginitis met behulp van een experimenteel diermodel. De methoden vergemakkelijken de snelle verzameling van vaginale monsters en lymfocyten uit drainerende lumbale lymfeklieren, wat mogelijk leidt tot muismodellen voor andere ziekten in het vrouwelijke onderste genitale kanaal.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Microbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Candida vaginitis is een veelvoorkomende aandoening die het vrouwelijke genitale kanaal aantast.
- Het begrijpen van de immuunrespons is cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen.
- Experimentele modellen helpen bij het bestuderen van ziektemechanismen.
- Vaginale candidiasis kan worden gekwantificeerd met behulp van specifieke tests.
Doel van het onderzoek
- Om procedurele technieken voor het bestuderen van vaginale candidiasis te demonstreren.
- Om de vaginale schimmellast in een experimenteel model te kwantificeren.
- Om vaginale en lymfoïde cellen te gebruiken in immunologische assays.
Gebruikte methoden
- Vaginale inoculatietechniek op oestrogeen-behandelde muizen.
- Vaginale lavage om Candida te herstellen na het euthanaseren van de muis.
- Extractie van vaginaal weefsel en drainerende lymfeklieren.
- Microscopisch onderzoek en beplating van lavagevloeistof op agar.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle herstel van Candida uit vaginale lavage.
- Kwantificering van schimmellast met behulp van agar-plating.
- Identificatie van epitheel- en lymfoïde cellen door middel van kleuring.
- Demonstratie van de haalbaarheid van het model voor toekomstige studies.
Conclusies
- De beschreven technieken bieden een robuuste methode voor het bestuderen van vaginale candidiasis.
- Dit model kan worden aangepast voor andere ziekten in het vrouwelijke onderste genitale kanaal.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om immunologische reacties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The experimental mouse model of Candida vaginitis provides a robust platform for quantifying vaginal fungal burden and evaluating host immune responses in a controlled, disease-relevant system. This model enables reproducible assessment of infection dynamics and immunological endpoints, supporting early discovery and mechanistic de-risking for antifungal and immunotherapeutic candidates. Its translational alignment with human infection properties enhances predictive confidence for preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response mechanisms in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by quantifying infection and immune cell infiltration without immunosuppression confounders.
- Facilitates mechanistic de-risking for antifungal and immunomodulatory strategies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for inoculation, sample collection, and fungal burden quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as CFU enumeration and immune cell profiling.
- Enables longitudinal sampling from the same animal, supporting robust assay development and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human infection immunology, enhancing translational relevance for candidate evaluation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling immunological and histological endpoint analysis.
- Permits risk-adjusted advancement of antifungal and immunotherapeutic leads based on quantitative infection and immune readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative assessment of infection and immune responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of host-pathogen interactions and immune mechanisms.
- Screening: Provides validated, reproducible assays for fungal burden and immune cell quantification.
- Analytics: Generates quantitative outputs (CFU counts, cell profiles) for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Offers continuity for immunological and infection endpoints relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse infectious and immunological hypotheses in the lower female genital tract.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antifungal and immunological research.
- Operational Value: Standardizes infection and sampling protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting mucosal infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, infection models, and immunological assays.
- Needs access to instrumentation for sample collection, microscopy, and quantitative plating.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility across studies.
- Adaptable to other infectious disease models of the lower female genital tract with protocol modifications.
- Careful handling and sample processing are critical to maintain cell viability and data integrity.
