High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method
January 9th, 2012
Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van kristallisaties trials
Deze video zal een methode demonstreren om high throughput kristallisatieproeven van gezuiverde membraaneiwitten in te stellen met behulp van Lipic B-cellen. Eerst worden B-cellen bereid door een lipide en een detergent te mengen, gezuiverd membraaneiwit wordt in de B-cel mix ingebouwd en kristallisatieproeven worden uitgevoerd met behulp van een nanoliter robot voor visuele inspectie. Het gebruik van een standaard lichtmicroscoop onthult de aanwezigheid van kristallen.
Eenmaal gevormd, kunnen de eiwitkristallen worden geëxtraheerd en ingevroren voor dataverzameling en structurele bepaling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het unieke fasegedrag van B-cellen, standaardapparatuur en robotica die beschikbaar is in het laboratorium kunnen worden gebruikt voor kristallisatie. Het instellen van B-cellen is zo'n eenvoudige techniek en stelt u in staat om uw doelwitmembraaneiwit uit de detergent uit uw cel te halen en in een lipische medium te plaatsen.
Dit geeft u een geheel nieuwe set omstandigheden om te screenen. Het is zo'n eenvoudige methode die met succes is gebruikt op veel membraaneiwitten dat er gewoon geen reden is om het niet te proberen. De eerste stap in B-cel gebaseerde kristallisatie is de bereiding van een B-cel vormende lipide amfimixtuur.
Dit proces vereist aanzienlijke inspanning en is het meest tijdrovend. Merk op dat het enkele uren kan duren om te voltooien. B-cellen kunnen zich vormen in een verscheidenheid van lipide amficombinaties en over een breed scala aan concentraties.
Voor voorgestelde startpunten, zie tabel één in het bijgevoegde geschreven protocol begin met het bereiden van één milliliter van 35%DMPC capso mengsel in een 2,8 tot 1 molair verhouding. Om dit te doen, weeg 0,26 gram DMPC en 0,09 gram Chapo in een buisje. Breng het volume op 1,0 milliliters met gedeïoniseerd water, vortex de mengsel.
Verwarm vervolgens het mengsel tot ongeveer 40 graden Celsius in een waterbad totdat het gel-achtig wordt. Plaats de buis vervolgens op ijs. Het monster zou weer vloeibaar moeten worden.
Vortex vervolgens nog eens enkele minuten, blijf doorgaan met het verwarmen, koelen en vortexen totdat het lipide volledig is opgelost. Merk op dat naarmate meer cycli worden uitgevoerd, het mengsel bij afkoeling troebel kan worden. Het mengsel zal een heldere gel zijn bij of boven kamertemperatuur, en een stroperige vloeistof op ijs bij cellen kunnen worden bewaard op min 20 graden Celsius voor langdurige opslag.
Vervolgens worden gezuiverde eiwitten in het B-cel medium opgenomen. Dit is een eenvoudig proces en moet op dezelfde dag worden uitgevoerd als kristallisatie, wat in de volgende sectie van de video wordt getoond. Ontdooi het DMPC capso B-celmengsel bij kamertemperatuur totdat de fase verandert in een heldere gel.
Plaats het mengsel op ijs om het vloeibaar te maken en vortex het vervolgens kort om een homogene B-cel fase te herstellen. Vanaf dit punt houdt u het B-celmengsel en het gezuiverde eiwit op ijs. Dit zal de B-cel in een vloeibare fase houden, waardoor het geschikt is om te pipetten.
Voeg vervolgens het B-celmengsel toe aan het gezuiverde detergent gesolubiliseerde eiwit in een verhouding van één op vier, volume op volume. Pipet vervolgens voorzichtig op en neer totdat de oplossing helder en homogeen wordt. Als er bellen verschijnen, centrifugeer ze dan kort in een tafelcentrifuge.
Incubeer het mengsel op ijs gedurende ten minste 30 minuten om volledige incorporatie van het eiwit in de B-cellen te bevorderen. Het eiwit B-celmengsel is nu klaar voor kristallisatieproeven. Kristallisatieproeven zullen worden gedemonstreerd met behulp van een mosquito kristallisatierobot.
Koel een 96-well V-bodemplaat af door deze op ijs te plaatsen. Pipet het eiwit B-celmengsel in de plaat om ervoor te zorgen dat de viscositeit van de oplossing minimaal is. Houd het eiwit B-celmengsel op ijs tot de laatste stap.
De hier gebruikte robot heeft vijf platforms. Plaats de microplaat met het reservoir op platform drie en het kristallisatiedeksel waarop de druppels worden uitgedeeld op platform vijf. Plaats vervolgens de eiwit B-celplaat op platform vier het dichtst bij de uitdeelpositie.
Dit zorgt ervoor dat het eiwit B-celmengsel als laatste door de robot wordt opgehaald en onmiddellijk wordt vrijgelaten. Gebruik de software om de run te starten, de robot zal de reservoiroplossing opnemen gevolgd door het eiwit B-celmengsel en deze als druppels op het deksel uitspuiten om verwarming en verhoogde viscositeit tijdens het doseren te voorkomen. Programmeer de mosquito niet om het reservoir met het eiwit B-celmengsel te mengen zodra de run is voltooid.
Verwijder de eiwit B-celplaat uit het instrument en plaats deze op ijs. Verwijder het deksel van het instrument en plaats het op de plaat met de reservoiroplossing zodat de druppels worden omgekeerd. Incubeer de plaat bij 20 graden Celsius.
Merk op dat ook andere temperaturen kunnen worden getest voor kristallisatie en optimalisatie. Hogere temperaturen induceren de lamellaire fase, die het voordeel heeft dat het eiwit in lagen wordt gepreorganiseerd. Temperaturen tussen vier graden Celsius en 20 graden Celsius kunnen worden gescreend.
Temperaturen onder de vier graden Celsius kunnen ervoor zorgen dat de lipiden gedurende langere perioden op de eerste, derde dag en wekelijks daarna, kristallenvorming en groei worden beoordeeld met behulp van een standaard lichtmicroscoop. Hier getoond zijn een brightfield beeld en een UV beeld van naaldachtige kristallen waargenomen in de enige aanvalsomstandigheden. Fluoresceren werd niet gedetecteerd van de kristallen, wat een valse positieve in deze afbeelding aangeeft.
Een staafvormig kristal werd gevormd toen methyl propaan diol werd gebruikt als een precipitant. Het kristal fluoresceerde wekelijks, wat aangeeft dat het mogelijk een eiwitkristal is, maar werd gevonden om niet-protenteus te zijn met behulp van röntgendiffractie. Hier getoond is een kristal dat ongeveer vier weken na het instellen van proeven
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video toont een methode voor het opzetten van high-throughput kristallisatieproeven van gezuiverde membraaneiwitten met behulp van lipide bicelles. De techniek maakt het mogelijk om membraaneiwitten in een lipidemedium op te nemen, waardoor het kristallisatieproces wordt vergemakkelijkt.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Structurele Biologie
- Kristallisatie van Membraaneiwitten
- Biofysica
Achtergrond
- Bicelles zijn lipide/amfifiele mengsels die membraaneiwitten binnen een lipide dubbellaag stabiliseren.
- Deze techniek heeft uniek fasegedrag dat gunstig is voor high-throughput screening.
- Het heeft met succes hoge resolutiestructuren uit verschillende bronnen geproduceerd.
- Standaard laboratoriumapparatuur kan worden gebruikt voor kristallisatieproeven.
Doel van het onderzoek
- Om de bereiding van bicelles voor kristallisatie van membraaneiwitten te demonstreren.
- Om te laten zien hoe membraaneiwitten in het bicellemengsel kunnen worden opgenomen.
- Om het proces van het opzetten van kristallisatieproeven te schetsen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van bicelles door lipide en detergent te mengen.
- Opname van gezuiverde membraaneiwitten in het bicellemengsel.
- Kristallisatieproeven uitgevoerd met behulp van een nanoliter robot.
- Visuele inspectie van kristallen met behulp van een standaard lichtmicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van eiwitkristallen uit het bicellemengsel.
- Kristallen kunnen worden geëxtraheerd en bevroren voor dataverzameling.
- De techniek maakt efficiënt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur mogelijk.
- High-throughput mogelijkheden verbeteren het kristallisatieproces.
Conclusies
- Bicelles bieden een haalbaar medium voor kristallisatie van membraaneiwitten.
- De methode vereenvoudigt de overgang van eiwitten van detergent naar lipide omgevingen.
- Deze benadering kan leiden tot verbeterde structurele determinatie van membraaneiwitten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Membrane protein crystallization remains a bottleneck in structure-based drug discovery due to protein hydrophobicity and instability in detergent micelles. The lipidic bicelle method provides a more native-like lipid environment that improves protein stability and crystal quality, enabling reliable structural data for target validation. This approach supports early-stage mechanistic de-risking by facilitating high-resolution insights into drug-binding pockets and conformational states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural determination of membrane proteins in a lipidic milieu that better preserves native conformation and ligand-binding sites.
- Operational Value: Reduces reliance on extensive detergent screening by providing a standardized lipidic matrix for crystallization trials.
- Predictive Value: High-quality crystals support accurate modeling of protein-ligand interactions, improving confidence in target engagement hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals that enable atomic-level resolution for structure-guided drug design.
- Operational Value: Compatible with standard nanoliter liquid-handling robotics, allowing integration into existing high-throughput crystallization pipelines.
- Scalability: Low viscosity of bicelle-protein mixtures facilitates automated dispensing and reduces technical barriers to automation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Structures obtained via bicelle crystallization inform the design of selective inhibitors with improved pharmacokinetic profiles.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of conformational states relevant to allosteric modulation and gating mechanisms.
- Preclinical Model Relevance: Supports structure-based optimization of leads targeting disease-associated membrane proteins from diverse organisms.
Pipeline & Workflow Integration
The bicelle method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing structural data that informs medicinal chemistry and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of membrane protein architecture and ligand-binding sites in a near-native lipid environment.
- Screening: Generates crystallization conditions compatible with robotic screening, increasing throughput and condition coverage.
- Analytics: Yields X-ray diffraction data that provides electron density maps for accurate model building and ligand pose validation.
- Translational Research: Connects atomic structures to functional assays, enabling correlation of binding affinity with structural perturbations.
- Enterprise Reuse: Bicelle formulations can be standardized and stored for repeated use across multiple membrane protein targets, reducing reagent variability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves success rate of membrane protein crystallization by mimicking the lipid bilayer environment.
- Operational Value: Uses standard laboratory equipment and robotics, eliminating need for specialized high-viscosity handling tools.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by reducing time-to-structure for challenging membrane protein targets.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on high-confidence structural insights into target druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling and membrane protein biochemistry to optimize lipid:detergent ratios and protein incorporation.
- Depends on access to crystallization robotics and controlled-temperature incubation systems for trial setup and monitoring.
- Necessitates standardization of bicelle preparation protocols across teams to ensure reproducibility of crystallization outcomes.
- Involves optimization of lipid composition (e.g., DMPC:CHAPSO ratios) and precipitant screening to match protein-specific crystallization needs.
- Limited by the need for cold handling during preparation to maintain bicelle fluidity and prevent premature phase transitions.
