High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method
9 januari 2012
Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van kristallisaties trials
Deze video zal een methode demonstreren om high throughput kristallisatieproeven van gezuiverde membraaneiwitten in te stellen met behulp van Lipic B-cellen. Eerst worden B-cellen bereid door een lipide en een detergent te mengen, gezuiverd membraaneiwit wordt in de B-cel mix ingebouwd en kristallisatieproeven worden uitgevoerd met behulp van een nanoliter robot voor visuele inspectie. Het gebruik van een standaard lichtmicroscoop onthult de aanwezigheid van kristallen.
Eenmaal gevormd, kunnen de eiwitkristallen worden geëxtraheerd en ingevroren voor dataverzameling en structurele bepaling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het unieke fasegedrag van B-cellen, standaardapparatuur en robotica die beschikbaar is in het laboratorium kunnen worden gebruikt voor kristallisatie. Het instellen van B-cellen is zo'n eenvoudige techniek en stelt u in staat om uw doelwitmembraaneiwit uit de detergent uit uw cel te halen en in een lipische medium te plaatsen.
Dit geeft u een geheel nieuwe set omstandigheden om te screenen. Het is zo'n eenvoudige methode die met succes is gebruikt op veel membraaneiwitten dat er gewoon geen reden is om het niet te proberen. De eerste stap in B-cel gebaseerde kristallisatie is de bereiding van een B-cel vormende lipide amfimixtuur.
Dit proces vereist aanzienlijke inspanning en is het meest tijdrovend. Merk op dat het enkele uren kan duren om te voltooien. B-cellen kunnen zich vormen in een verscheidenheid van lipide amficombinaties en over een breed scala aan concentraties.
Voor voorgestelde startpunten, zie tabel één in het bijgevoegde geschreven protocol begin met het bereiden van één milliliter van 35%DMPC capso mengsel in een 2,8 tot 1 molair verhouding. Om dit te doen, weeg 0,26 gram DMPC en 0,09 gram Chapo in een buisje. Breng het volume op 1,0 milliliters met gedeïoniseerd water, vortex de mengsel.
Verwarm vervolgens het mengsel tot ongeveer 40 graden Celsius in een waterbad totdat het gel-achtig wordt. Plaats de buis vervolgens op ijs. Het monster zou weer vloeibaar moeten worden.
Vortex vervolgens nog eens enkele minuten, blijf doorgaan met het verwarmen, koelen en vortexen totdat het lipide volledig is opgelost. Merk op dat naarmate meer cycli worden uitgevoerd, het mengsel bij afkoeling troebel kan worden. Het mengsel zal een heldere gel zijn bij of boven kamertemperatuur, en een stroperige vloeistof op ijs bij cellen kunnen worden bewaard op min 20 graden Celsius voor langdurige opslag.
Vervolgens worden gezuiverde eiwitten in het B-cel medium opgenomen. Dit is een eenvoudig proces en moet op dezelfde dag worden uitgevoerd als kristallisatie, wat in de volgende sectie van de video wordt getoond. Ontdooi het DMPC capso B-celmengsel bij kamertemperatuur totdat de fase verandert in een heldere gel.
Plaats het mengsel op ijs om het vloeibaar te maken en vortex het vervolgens kort om een homogene B-cel fase te herstellen. Vanaf dit punt houdt u het B-celmengsel en het gezuiverde eiwit op ijs. Dit zal de B-cel in een vloeibare fase houden, waardoor het geschikt is om te pipetten.
Voeg vervolgens het B-celmengsel toe aan het gezuiverde detergent gesolubiliseerde eiwit in een verhouding van één op vier, volume op volume. Pipet vervolgens voorzichtig op en neer totdat de oplossing helder en homogeen wordt. Als er bellen verschijnen, centrifugeer ze dan kort in een tafelcentrifuge.
Incubeer het mengsel op ijs gedurende ten minste 30 minuten om volledige incorporatie van het eiwit in de B-cellen te bevorderen. Het eiwit B-celmengsel is nu klaar voor kristallisatieproeven. Kristallisatieproeven zullen worden gedemonstreerd met behulp van een mosquito kristallisatierobot.
Koel een 96-well V-bodemplaat af door deze op ijs te plaatsen. Pipet het eiwit B-celmengsel in de plaat om ervoor te zorgen dat de viscositeit van de oplossing minimaal is. Houd het eiwit B-celmengsel op ijs tot de laatste stap.
De hier gebruikte robot heeft vijf platforms. Plaats de microplaat met het reservoir op platform drie en het kristallisatiedeksel waarop de druppels worden uitgedeeld op platform vijf. Plaats vervolgens de eiwit B-celplaat op platform vier het dichtst bij de uitdeelpositie.
Dit zorgt ervoor dat het eiwit B-celmengsel als laatste door de robot wordt opgehaald en onmiddellijk wordt vrijgelaten. Gebruik de software om de run te starten, de robot zal de reservoiroplossing opnemen gevolgd door het eiwit B-celmengsel en deze als druppels op het deksel uitspuiten om verwarming en verhoogde viscositeit tijdens het doseren te voorkomen. Programmeer de mosquito niet om het reservoir met het eiwit B-celmengsel te mengen zodra de run is voltooid.
Verwijder de eiwit B-celplaat uit het instrument en plaats deze op ijs. Verwijder het deksel van het instrument en plaats het op de plaat met de reservoiroplossing zodat de druppels worden omgekeerd. Incubeer de plaat bij 20 graden Celsius.
Merk op dat ook andere temperaturen kunnen worden getest voor kristallisatie en optimalisatie. Hogere temperaturen induceren de lamellaire fase, die het voordeel heeft dat het eiwit in lagen wordt gepreorganiseerd. Temperaturen tussen vier graden Celsius en 20 graden Celsius kunnen worden gescreend.
Temperaturen onder de vier graden Celsius kunnen ervoor zorgen dat de lipiden gedurende langere perioden op de eerste, derde dag en wekelijks daarna, kristallenvorming en groei worden beoordeeld met behulp van een standaard lichtmicroscoop. Hier getoond zijn een brightfield beeld en een UV beeld van naaldachtige kristallen waargenomen in de enige aanvalsomstandigheden. Fluoresceren werd niet gedetecteerd van de kristallen, wat een valse positieve in deze afbeelding aangeeft.
Een staafvormig kristal werd gevormd toen methyl propaan diol werd gebruikt als een precipitant. Het kristal fluoresceerde wekelijks, wat aangeeft dat het mogelijk een eiwitkristal is, maar werd gevonden om niet-protenteus te zijn met behulp van röntgendiffractie. Hier getoond is een kristal dat ongeveer vier weken na het instellen van proeven
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een methode voor het opzetten van high-throughput kristallisatieproeven van gezuiverde membraaneiwitten met behulp van lipidische bicellen. De techniek maakt het mogelijk om membraaneiwitten in een lipid medium te incorporeren, wat het kristallisatieproces faciliteert.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Structurele biologie
- Membraaneiwitkristallisatie
- Biofysica
Achtergrond
- Bicellen zijn mengsels van lipiden/amfifielen die membraaneiwitten stabiliseren binnen een lipide dubbellaag.
- Deze techniek heeft een uniek fasegedrag dat gunstig is voor high-throughput screening.
- Het is succesvol gebruikt voor het produceren van hoge-resolutiestructuren uit diverse bronnen.
- Standaard laboratoriumapparatuur kan worden gebruikt voor kristallisatie-experimenten.
Doel van de studie
- Om de bereiding van bicellen voor de kristallisatie van membraaneiwitten te demonstreren.
- Om te laten zien hoe membraaneiwitten in het bicellenmengsel kunnen worden geïncorporeerd.
- Om het proces van het opzetten van kristallisatie-experimenten te schetsen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van bicellen door het mengen van lipiden en detergent.
- Inbouw van gezuiverde membraaneiwitten in het bicelmengsel.
- Kristallisatieproeven uitgevoerd met behulp van een nanoliterrobot.
- Visuele inspectie van kristallen met een standaard lichtmicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van proteïnekristallen uit het bicellesmengsel.
- Kristallen kunnen worden geëxtraheerd en ingevroren voor datacollectie.
- De techniek maakt een efficiënt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur mogelijk.
- High-throughput-mogelijkheden verbeteren het kristallisatieproces.
Conclusies
- Bicelles bieden een levensvatbaar medium voor de kristallisatie van membraaneiwitten.
- De methode vereenvoudigt de overgang van eiwitten van detergenten naar lipidische omgevingen.
- Deze aanpak kan leiden tot een verbeterde structurele bepaling van membraaneiwitten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Membraaneiwitkristallisatie blijft een knelpunt bij structuurgebaseerde geneesmiddelenontwikkeling vanwege de hydrofobiciteit van eiwitten en hun instabiliteit in detergentmicellen. De lipidische bicellemethode biedt een meer natuurgetrouwe lipideomgeving die de eiwitstabiliteit en kristalkwaliteit verbetert, waardoor betrouwbare structurele gegevens voor doelwitvalidatie mogelijk worden. Deze benadering ondersteunt mechanisch risicobeheer in een vroeg stadium door hoogresolutie-inzichten in drug-bindingspockets en conformationele toestanden te faciliteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt structurele bepaling van membraanproteïnen in een lipidisch milieu mogelijk dat de native conformatie en ligandbindingsplaatsen beter behoudt.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van uitgebreide detergent-screening door een gestandaardiseerde lipidische matrix te bieden voor crystallisatieproeven.
- Predictieve waarde: Hoogwaardige kristallen ondersteunen nauwkeurige modellering van proteïne-ligandinteracties, waardoor het vertrouwen in hypothesen over target engagement toeneemt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert kristallen van diffractiekwaliteit die atomaire resolutie mogelijk maken voor structuurgestuurd geneesmiddelendesign.
- Operationele waarde: Compatibel met standaard nanoliter liquid-handling robotica, waardoor integratie in bestaande high-throughput crystallizatie-pipelines mogelijk is.
- Schaalbaarheid: De lage viscositeit van bicelle-eiwitmengsels vergemakkelijkt het automatische dispenseren en vermindert technische barrières voor automatisering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Structuren verkregen via bicelle-kristallisatie informeren het ontwerp van selectieve remmers met verbeterde farmacokinetische profielen.
- Mechanische Risicoreductie: Maakt visualisatie mogelijk van conformationele toestanden die relevant zijn voor allostere modulatie en gating-mechanismen.
- Relevantie voor Preklinische Modellen: Ondersteunt structuurgebaseerde optimalisatie van leads gericht op ziekte-geassocieerde membraanproteïnen uit diverse organismen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De bicelle-methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie en levert structurele gegevens die een basis vormen voor medicinale chemie en de selectie van preklinische kandidaten.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen door visualisatie van de architectuur van membraaneiwitten en ligandbindingsplaatsen in een bijna-natieve lipide-omgeving mogelijk te maken.
- Screening: Genereert kristallisatiecondities die compatibel zijn met robotische screening, waardoor de doorvoer en de dekking van condities worden vergroot.
- Analytics: Levert röntgendiffractiegegevens die elektronendichtheidskaarten bieden voor nauwkeurige modelbouw en validatie van de ligandpositie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt atomaire structuren met functionele assays, waardoor correlatie van bindingsaffiniteit met structurele verstoringen mogelijk wordt.
- Enterprise hergebruik: Bicelle-formuleringen kunnen worden gestandaardiseerd en opgeslagen voor herhaald gebruik bij meerdere membraaneiwitdoelen, waardoor de variabiliteit van reagentia wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het succespercentage van membraaneiwitkristallisatie door de lipidendubbellaagomgeving na te bootsen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en robotica, waardoor gespecialiseerde hulpmiddelen voor het hanteren van hoge viscositeit niet meer nodig zijn.
- Strategische waarde: Versnelt de identificatie van lead-verbindingen door de tijd tot structuurbepaling voor uitdagende membraaneiwittargets te verkorten.
- Impact op portfolio: Maakt datagedreven go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van betrouwbare structurele inzichten in de druggability van targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met lipiden en membraaneiwitbiochemie om lipide:detergent-ratio's en eiwitincorporatie te optimaliseren.
- Is afhankelijk van toegang tot crystallisatierobotica en incubatiesystemen met temperatuurbeheersing voor de opzet en monitoring van trials.
- Necessiteert standaardisatie van protocollen voor de bereiding van bicellen tussen teams om de reproduceerbaarheid van crystallisatieresultaten te waarborgen.
- Omvat optimalisatie van de lipidesamenstelling (bijv. DMPC:CHAPSO-ratio's) en screening van precipitantia om te voldoen aan eiwitspecifieke crystallisatiebehoeften.
- Wordt beperkt door de noodzaak van koude handling tijdens de bereiding om de vloeibaarheid van de bicellen te behouden en vroegtijdige faseovergangen te voorkomen.
