Name: High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer hoe je hoge-doorvoer kristallisatie van membraaneiwitten uitvoert met behulp van de lipidische bicelle-methode. Deze techniek maakt efficiënt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en robotica voor structurele biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Drs bedanken. James Bowie en Salem Faham voor het leveren van technische expertise en adviezen over de bicelle methode en Dr Aviv Paz voor nuttige discussies. Wij erkennen Le Du voor experimentele ondersteuning. Rachna Ujwal heeft financieel belang bij MemX Biosciences LLC, die echter niet ondersteunen dit werk. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH (RO1 GM078844).

Bicelle op basis van kristallisatie bestaat uit vier basisstappen (figuur 2): i) de voorbereiding van een bicelle vorming van lipiden: amfifiele mengsel; ii) de bijmenging van gezuiverde eiwit in de bicelle medium; iii) kristallisatie onderzoeken (handmatig of robot), en iv) visualisatie, kristal extractie en bevriezing. Deze stappen worden hieronder in detail beschreven 1. Voorbereiding van de Bicelles Bicelles kunnen vormen in een verscheidenheid van lipide: amfifiele combinaties en over een breed scala aan concentraties. Daarom is voorwaarden-een eerste compositie-op basis van eerdere succesvolle aanbevolen (tabel 1). De meest succesvolle mengsel is de DMPC: CHAPSO bicelle formulering, die zowel commercieel kan worden gekocht als een voorgemengde kant-en-klare formulering (zie tabel van reagentia hieronder) of bereid in het laboratorium zoals beschreven. Voor deze oefening zullen we voor te bereiden 1 ml 35% DMPC: CHAPSO mengsel bij een 2.8:1 molaire verhouding. <ol><li weeg g dmpc heer mol chapso en gede water tot een eindvolume van ml toe te voegen. type="disc"><li> De bicelle percentage kan variëren tussen 10% -40% met een DMPC: CHAPSO molaire verhouding van 2.6-3.0:1 (tabel 1). </li><li> Opmerking: Hoe hoger de concentratie bicelle hoe moeilijker het is om ontbinding van de lipide resulteert in een hogere viscositeit van de oplossing. Kan echter een geconcentreerde bicelle formulering voordelig zijn wanneer het eiwit concentratie laag is. </li><li> Het oplossen van het lipide om een ​​homogene oplossing te verkrijgen vereist een aanzienlijke inspanning, waardoor deze stap wordt het meest tijdrovende in de bicelle methode. Doorloop de volgende stappen totdat het DMPC is volledig gemengd: <ol><li> Warm het mengsel tot ~ 40 ° C met behulp van een waterbad of een incubator en vortex voor ~ 1 minuut. <ul type="disc"><li> Opmerking: Zoals meer cycli worden uitgevoerd, zal opwarming van het mengsel resulteert in een gel-achtige conconsistentie waardoor het moeilijk te vortex. </li></ul></li><li> Cool het mengsel op ijs en vortex voor een paar minuten. Koeling helpt vloeibaar te maken van de oplossing waardoor het makkelijker te vortex. <ul type="disc"><li> Opmerking: Zoals meer cycli worden uitgevoerd, kan het mengsel troebel is geworden na het afkoelen. </li></ul></li><li> Herhaal bovenstaande stappen (1.2.1 en 1.2.2) tot de lipide volledig is opgelost. <ul type="disc"><li> Opmerking: Dit proces kan enkele uren duren. Bicelle formatie wordt aangegeven door de veranderingen in het fasegedrag van de DMPC: CHAPSO formulering. Na voltooiing zal het mengsel een heldere gel op of boven kamertemperatuur en een stroperige vloeistof op het ijs. </li></ul></li></ol></li><li> De bicelle mengsel is nu klaar voor gebruik en kan worden bewaard bij -20 ° C voor lange-termijn opslag (tot 5 jaar). Vanwege het risico van hydrolyse van de fosfolipide hoofd groep is het niet raadzaam om bicelles op te slaan op kamertemperatuur gedurende langere tijd. </li></ol> 2. Integratie van eiwitten in bicelles De meeste MP structuren verkregen uit bicelles werden gekristalliseerd in DMPC: CHAPSO bicelle concentratie variërend van 2 tot 8% met behulp van een eiwit concentratie van 8 tot 12 mg / ml (tabel 1). Indien mogelijk dient de eerste schermen gebruik maken van deze richtlijnen en extra concentraties kunnen worden vertoond op de optimalisatie fase. Vergeleken met de LCP-methode, eiwit opname met bicelles is een eenvoudig proces (figuur 3), die moet dezelfde dag worden gedaan als kristallisatie onderzoeken. <ol><li> Ontdooi de DMPC: CHAPSO bicelle mengsel bij kamertemperatuur totdat de fase verandert in een heldere gel. <ul type="disc"><li> Let op: Meerdere vries-dooi heeft geen invloed op bicelle gedrag. </li></ul></li><li> Leg het mengsel op ijs naar vloeibaar en kort vortex tot een homogene bicelle fase te herstellen. Bij plaatsing op ijs kan het mengsel troebel wordt. </li><li> FrOM dit punt, houden de bicelle mengsel en gezuiverd eiwit op ijs. Dit zorgt ervoor dat de bicelle in een vloeibare fase waardoor het vatbaar is voor pipetteren. </li><li> Voeg het mengsel aan bicelle het gezuiverde detergent-oplosbaar eiwit in een 1:4 (v / v) verhouding. <ul type="disc"><li> Bijvoorbeeld: 100 pi eiwit-bicelle mengsel is verkregen door het mengen van 80 ul eiwit met 20 ul bicelle. Als het eiwit concentratie is 15 mg / ml en de bicelle concentratie is 35%, zal dit een bicelle-opgenomen eiwitmengsel geven met een eiwit concentratie van 12 mg / ml en een bicelle concentratie van 7%. </li></ul></li><li> Meng door zachtjes pipetteren van de inhoud op en neer totdat de oplossing helder en homogeen is. <ul type="disc"><li> Opmerking: Als bellen verschijnen, snel een rondje (30-60 seconden, 13000 rpm, 4 ° C) met een tafelblad centrifuge kan helpen verwijderen. </li></ul></li><li> Incubeer dit mengsel op ijs gedurende minstens 30 minuten in beslag opname van eiwit int bevordereno bicelles. Het eiwit-bicelle mengsel is nu klaar voor kristallisatie onderzoeken. </li></ol> 3. Het opzetten van kristallisatie onderzoeken Andere lipiden kristallisatie technieken zoals de LCP vereisen gespecialiseerde apparatuur door de hoge viscositeit van het medium, maar de unieke fasegedrag van bicelles vergunningen implementatie in vrijwel alle standaard kristallisatie formaat inclusief robotica (figuur 3). Kristallisatie onderzoeken kunnen worden uitgevoerd zowel in opknoping of zittend laten vallen formats met behulp van standaard in de handel verkrijgbare schermen. <ol><li> Of het opzetten van trays handmatig of met behulp van een kristallisatie-robot, onderhouden van de eiwit-bicelle mengsel op ijs. Dit zorgt ervoor dat het eiwit-bicelle mengsel koud en ervoor te zorgen dat de viscositeit van de oplossing minimaal is. </li><li> Handmatige Kristallisatie Trials - Het gebruik van een standaard pipet, kan het eiwit-bicelle mengsel worden gemengd met reservoir oplossing op dezelfde manier als normaal uit te voerened voor oplosbare of een wasmiddel-gesolubiliseerde membraaneiwitten. <ul type="disc"><li> Opmerking: Bewaar het eiwit-bicelle mengsel op ijs tijdens de trials. </li></ul></li><li> Robotic Kristallisatie Trials - We hebben op maat van deze trials voor de Mosquito kristallisatie robot, maar in principe (volgens dezelfde voorzorgsmaatregelen) de techniek moet compatibel zijn met alle kristallisatie robots. De volgende tips zorgen ervoor dat het eiwit-bicelle mengsel afkoelen blijft en nauwkeurig gepipetteerd door de robot: <ol><li> Precool de plaat die de eiwit-bicelle mengsel door het op ijs. </li><li> Pipetteer de eiwit-bicelle mengsel in de plaat en blijven de plaat te houden op het ijs. Deze plaat moet het laatste item om op de robot gaan voor aanvang van de termijn. </li><li> Set-up het reservoir lade en kristallisatie deksels op het platform van 3 en 5, van de mug robot. </li><li> Plaats de plaat met een eiwit-bicelle mengsel op perron 4van de mug robot. Dit verzekert de eiwit-bicelle mengsel is de laatste om opgehaald te worden door de robot en het is meteen vrijgelaten. </li><li> Om te voorkomen dat verwarming en verhoogde viscositeit, moet het reservoir niet mengen met het eiwit-bicelle mengsel. </li><li> Bij het uitvoeren van meerdere schermen, direct terug het bicelle-eiwit plaat ijs voor de koeling, zodra een run is voltooid. </li></ol></li><li> Drop volume en de ratio (eiwit: reservoir) kan worden gekozen als voor conventionele kristallisatie onderzoeken. Bijvoorbeeld, kan in eerste instantie kristal onderzoeken het gebruik van de Mosquito robot worden ingesteld met behulp van 0,25 ul eiwit: bicelle mengsel plus 0,25 ul reservoir. </li><li> Incubeer het kristal proeven in een kamer bij 20 ° C. Temperatuur is een goede screening en optimalisatie parameter omdat het fasegedrag van bicelles is afhankelijk van de temperatuur. <ul type="disc"><li> Hogere temperaturen veroorzaken de lamellaire fase 12 (figuur 1), die het voordeel van de pre-organisatie heefthet eiwit in lagen. Temperaturen onder 20 ° C kan worden gescreend, maar je moet niet gaan onder 4 ° C sinds dit kan de lipiden veroorzaken neerslag gedurende langere perioden van tijd. </li></ul></li><li> Op dezelfde wijze als traditionele kristallisatie onderzoeken, moet bicelle proeven worden gecontroleerd op een regelmatige basis voor kristal uitstraling en groei. Wij raden u aan trays controleren op de 1 e en 3 e dag post-setup gevolgd door wekelijkse inspectie. </li><li> Crystal-optimalisatie kan worden uitgevoerd met behulp van methoden routinematig gebruikt voor reinigingsmiddel op basis van kristallen inclusief rooster screening, additief screening, wisselende temperaturen etc. Daarnaast bicelle percentage en eiwit: bicelle-verhouding kan worden gevarieerd. Bovendien kan bicelles worden gedoteerd met specifieke lipiden die nodig kunnen zijn voor eiwit stabiliteit of functie. </li></ol> 4. Visualisatie, kristal extractie en invriezen Omdat kristallen proeven met het eiwit-bicelle mengsel hebben een viscositeit gelijk aan eiwit-detergent drops, visualisatie en kristal extractie routine is en wordt uitgevoerd zoals de traditionele set-ups. <ol><li> Visualisatie: In tegenstelling tot LCP media die vaak van hoge kwaliteit verlichting vereist onder normale en gepolariseerd licht voor kristal detectie, visualisatie wordt niet gehinderd door bicelles. Gekleurde en kleurloze proteïne kristal druppels kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van standaard-microscopen en geen speciale apparatuur nodig. </li><li> Bicelles, net als andere lipide media, hebben de neiging om een ​​hoog percentage valse positieven te produceren. Een UV-microscoop helpt enorm in het onderscheiden van eiwitten uit zoutkristallen (figuur 4). </li><li> Extractie en Invriezen: Crystal extractie en vriezen is betrekkelijk eenvoudig en vereist geen ontbinding van de omliggende bicelle media. Daarnaast is de bicelle fase zelf biedt een aantal matige cryo-bescherming. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: nt "&gt; Het duurt meestal 2-3 dagen voor de kristallen om te verschijnen en ongeveer een week of meer voor hen om te groeien naar hun maximale grootte. Dit was het geval voor bacteriorhodopsin en muis voltage-afhankelijke anion kanaal 1 (mVDAC1) kristallen 4,8 . Voor andere membraaneiwitten kan het enkele weken duren voor de kristalgroei, dus het is belangrijk om te blijven monitoren van de kristallen proeven veel verder dan de eerste weken. Net als bij andere lipide media, bicelles hebben de neiging om vormen die kunnen blijken te zijn kristallijne vorm. Het is ook waargenomen dat ze leiden tot een hoger percentage van zout en afwasmiddel kristallen. Een UV-fluorescentie microscoop die tryptofaan detecteert aanzienlijk kan helpen elimineren dergelijke niet-eiwitachtige false positives. Figuur 4 toont lipide vormen, zout en eiwitkristallen zoals weergegeven in zichtbaar en UV-licht om te helpen de verschillende resultaten die kunnen worden waargenomen onderscheiden. 83fig1.jpg "/&gt; Figuur 1. Bicelle Schematische. Bicelles zijn samengesteld uit een bilaag vormen van lipide molecuul zoals DMPC (blauw) en een amfifiele, zoals CHAPSO (groen), die de hydrofobe randen van de bilaag beschermt. Naarmate de temperatuur wordt verhoogd, disc-achtige bicelles ondergaan een fase transformatie tot een geperforeerde plaat lamellaire 12. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Stroomdiagram voor de bicelle kristallisatie-methode waarin de vier basisstappen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Kristal studies set-up schema. Gezuiverd detergent-oplosbaar membraan eiwitten kunnen direct worden gemengd met bicelles op het ijs door simpelweg pipetteren van de inhoud samen. Na het incuberen van de eiwit / bicelle mengsel op ijs voor ~ 30 minuten, kristallisatie onderzoekenkan worden ingesteld met behulp van een standaard-formaat inclusief robotica. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Visualisatie van kristal proeven. Zichtbare beeld (bovenste paneel) en UV-beeld (onderste paneel) van (A) naaldvormige kristallen waargenomen in een zout-enige voorwaarde. Geen fluorescentie gedetecteerd kan worden van de kristallen, een indicatie van vals-positieve. (B) staafvormige kristallen gevormd in een MPD staat. Het kristal fluoresced zwak, maar bleek te zijn niet-eiwitachtige met behulp van röntgendiffractie. (C) Crystal waargenomen ongeveer vier weken na het opzetten van studies. De sterke fluorescentie onder UV-licht bevestigt het is een eiwit kristal. <table border="1"><tbody><tr><td> Nee. </td><td> Eiwit </td><td> Bron </td><td> Bicelle Formulering </td><td> Eiwit Concentratiop </td><td> Wasmiddel 1 </td><td> Resolutie (Å) </td><td> Referentie </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bacteriorhodopsin 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8% DMPC: CHAPSO (2.8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2.0 </td><td> Faham en Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8% DTPC: CHAPSO (03:01) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1.8 </td><td> Faham et al.., 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-adrenerge receptor / Fab complex </td><td> Homo sapiens </td><td> 8,3% DMPC: CHAPSO (03:01) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen et al.., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Voltage-afhankelijke anionen kanaal 1 </td><td> Mus musculus </td><td> 7% DMPC: CHAPSO (2.8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2.3 </td><td> Ujwal et al.., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4,2% DMPC, 5% NM </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1.9 </td><td> Luecke et al.., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Parallellogram protease </td><td> Escherichia coli </td><td> 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Nonyl glucoside </td><td> 1.7 </td><td> Vinothkumar, 2011 </td></tr></tbody></table> 1 Wasmiddel gebruikt voor membraaneiwit zuivering 2 Inheemse lipiden van paars membranen kunnen worden meegenomen tijdens de zuivering Tabel 1. Samenvatting van de kristallisatie voorwaarden voor het membraan eiwit structuren opgelost met behulp van bicelles.

<ol><li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phases%3A+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4+Monoacylglycerols%3A+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li>
<li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicelle+crystallization%3A+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li>
<li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li>
<li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin%2C+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li>
<li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+%C3%85+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+human+%5Bbgr%5D2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li>
<li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering%3A+a+new+model+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Bicelles zijn een unieke lipidische media die een native bilaag-achtige omgeving te bieden terwijl ze zelf als oplosbaar gemaakt door detergenten. Deze eigenschap geeft bicelles een duidelijk voordeel ten opzichte van andere lipide-gebaseerde methoden kristallisatie aangezien er geen leercurve of gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor deze techniek. Zodra bicelles beschikbaar zijn, zowel commercieel of bereid in het laboratorium, kunnen ze direct worden gemengd met gezuiverd eiwit en vanaf dit moment kristallisat...

high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten met behulp van de lipidische bicelle method

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membraaneiwitten (MP&#39;s) spelen een cruciale rol in vele fysiologische processen, zoals het verpompen van specifieke moleculen door de anders ondoordringbare membraan bilaag dat alle cellen en organellen omringt. Wijzigingen in de functie van de parlementsleden resulteren in een groot aantal menselijke ziekten en aandoeningen, dus een ingewikkeld begrip van hun structuren blijft een kritische doelstelling voor biologisch onderzoek. Echter, de structuur bepaling van de parlementsleden blijft een belangrijke uitdaging vaak in het kader van hun hydrofobiciteit. Kamerleden hebben grote hydrofobe regio&#39;s ingebed in de bilaag. Wasmiddelen worden vaak gebruikt om deze eiwitten solubiliseren van de bilaag het genereren van een eiwit-detergent micel die vervolgens kan worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als oplosbare eiwitten. Traditioneel, kristallisatie onderzoeken gaat met behulp van een eiwit-detergent mengsel, maar ze vaak tegen kristallisatie of produceren kristallen van slechte kwaliteit. Deze problemen ontstaan ​​door dereinigingsmiddel niet in staat is adequaat te bootsen de bilaag resulteert in een slechte stabiliteit en heterogeniteit. Daarnaast, het wasmiddel schilden het hydrofobe oppervlak van de MP het verminderen van de beschikbare oppervlakte voor de kristallen contacten. Om deze nadelen te omzeilen Kamerleden kunnen worden gekristalliseerd in lipide media, die nauwer simuleert hun endogene omgeving, en is sinds kort een de novo techniek voor MP kristallisatie. Lipidische kubieke fase (LCP) is een drie-dimensionale lipide bilaag doorboord door een stelsel van systemen van waterige kanalen 1. Hoewel monoolein is de lipide van keuze, hebben verwante lipiden, zoals monopalmitolein en monovaccenin ook gebruikt om de LCP 2 te maken. Kamerleden zijn opgenomen in de LCP, waar ze verspreiden in drie dimensies en diervoeders kristal kernen. Een groot voordeel van de LCP is dat het eiwit blijft in een meer eigen omgeving, maar de methode heeft een aantal technische nadelen zoals hoge viscositeitosity (die gespecialiseerde apparaten), en de moeilijkheden in kristal visualisatie en manipulatie 3,4. Door deze technische problemen, gebruikten we een ander lipide medium voor kristallisatie-bicelles 5,6 (figuur 1). Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels gevormd door het mengen van een phosphatidylcholine lipide (DMPC) met een amfifiel (CHAPSO) of een korte keten lipide (DHPC). Binnen elke bicelle schijf, de lipide moleculen genereren een bilaag, terwijl de amfifiele moleculen langs de randen van het verstrekken van apolaire gunstige eigenschappen van zowel de dubbellagen en detergenten. Belangrijk is dat beneden hun overgang temperatuur, eiwit-bicelle mengsels hebben een gereduceerde viscositeit en worden gemanipuleerd op een soortgelijke wijze als detergent-oplosbaar parlementsleden, waardoor bicelles compatibel met kristallisatie robots. Bicelles zijn met succes gebruikt te kristalliseren verschillende membraaneiwitten 5,7-11 (tabel 1). Deze groeiende collectievan eiwitten toont de veelzijdigheid van bicelles voor kristalliseren zowel alfa helix en beta-sheet parlementsleden van prokaryote en eukaryote bronnen. Vanwege deze successen en de eenvoud van high-throughput implementatie, moet bicelles deel uitmaken van arsenaal van elke membraaneiwit kristallograaf&#39;s. In deze video beschrijven we de bicelle methodologie en bieden een stap-voor-stap protocol voor het opzetten van high-throughput kristallisatie proeven van gezuiverd Kamerleden met behulp van standaard robotica.

Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP&#39;s) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van kristallisaties trials (zowel handmatig als robot) en het oogsten van kristallen van het medium.

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Membraaneiwitten (MP's) spelen een cruciale rol in vele fysiologische processen, zoals het pompen van specifieke moleculen door het anders ondoordringbare membraan ...

Deze video demonstreert een methode voor het opzetten van high-throughput kristallisatieproeven van gezuiverde membraaneiwitten met behulp van Lipic B-cellen. Eerst worden B-cellen geprepareerd door een lipide en een detergent te mengen, waarna het gezuiverde membraaneiwit in het B-celmengsel wordt geïncorporeerd en de kristallisatieproeven worden uitgevoerd met een nanoliter-robot. Visuele inspectie met een standaard lichtmicroscoop onthult de aanwezigheid van kristallen.Zodra ze zijn gevormd, kunnen de proteïnekristallen worden geëxtraheerd en ingevroren voor datacollectie en structuurbepaling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat, dankzij het unieke fasegedrag van B-cellen, standaardapparatuur en robotica die in het laboratorium beschikbaar zijn, kunnen worden gebruikt voor kristallisatie. Het opzetten van B-cellen is een zeer eenvoudige techniek en stelt u in staat om uw doelwitmembraaneiwit uit de detergentmicel te halen en in een lipide medium te plaatsen.Dit biedt u een geheel nieuwe set condities om te screenen. Het is een methode die zo eenvoudig is en met succes is toegepast op veel membraaneiwitten, dat er simpelweg geen reden is om het niet te proberen. D

high-throughput-crystallization-membrane-proteins-using-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige aanpak voor het screenen van eiwitkristallisatieomstandigheden en kristalgroei met behulp van een 96-well high-throughput dialyseplaat. Het gebruik van dialysatorbuizen voor de grootschalige groei van microkristallen wordt ook gedemonstreerd voor seriële kristallografie en MicroED-toepassingen.

High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Hierin beschreven procedures uitgevoerd in de Caffrey Membrane Biology Structurele en functionele groep te oogsten en cryo-cool membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische kubieke spons fasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie.

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

Leer hoe je hoge-doorvoer kristallisatie van membraaneiwitten uitvoert met behulp van de lipidische bicelle-methode. Deze techniek maakt efficiënt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en robotica voor structurele biologie.

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Meer video's verkennen