Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

Het algemene doel van deze procedure is om degradatie van biologische beelden, veroorzaakt door de luchtruimtes in plantenbladeren, te minimaliseren om duidelijkere beelden te verkrijgen van levende cellen binnen het blad. Wanneer het blad wordt gemonteerd in een waterig montagemedium en een fluorofoor wordt geëxciteerd door een laser, beperken veel ongevulde luchtruimtes en veranderingen in de brekingsindex binnen het weefsel (in oranje weergegeven) de sterkte van het signaal diep uit het weefsel in het resulterende beeld. Indien het blad in plaats daarvan wordt gemonteerd in perfluordecaline of PFD, is de resulterende laser-excitatie van de fluorofoor minder gedempt, wat een betere transmissie van geëmitteerde signalen mogelijk maakt.

Uiteindelijk levert het gebruik van scanning laser confocale microscopie met het PFD-montagemedium heldere beelden op van levende cellen in het plantblad op een diepte die meer dan het dubbele is van wat mogelijk is bij het gebruik van een waterig montagemedium. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fixatie of het monteren van bladeren in waterige media, is dat het de refractie binnen het mesofyl vermindert en nauwkeurigere beeldvorming mogelijk maakt van levende cellen dieper in het blad, wat voorheen problematisch was. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de plantwetenschap, zoals het onderzoeken van het mesofyl, de celbiologie en signalering in vivo, de kolonisatie van bladeren door pathogenen en interacties met pathogenen, waardoor deze methode inzicht kan bieden in de fundamentele plantbiologie.

Het kan ook worden toegepast op andere sterk brekende weefsels die rijk zijn aan luchtruimtes, zoals slakkenhuisspiralen of de longen van gewervelden. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. George Littlejohn uit mijn laboratorium To Mount Leaf. Monsters in PFD beginnen met het voorbereiden van een microscoopglasplaat met een gasdoorlatende pakking van polydimethylsiloxaan of PDMS. PDMS is een viscoelastisch polymeer dat kan worden gevormd om een kamer te creëren die is afgestemd op de experimentele vereisten.

Equilibreer de PFD met lucht door een klein volume PFD in een met lucht gevulde fles te schudden. Dit kan ook worden bereikt door lucht door de PFD te borrelen; giet de PFD vervolgens in een open Petrischaal en laat een hele kiemplant of een uitgesneden blad vijf minuten op de vloeistof drijven. Het weefsel moet doorschijnend worden, vergelijkbaar met geverifieerd weefsel.

Bladeren kunnen donkerder of lichter lijken dan vóór de blootstelling aan PFD, afhankelijk van de lichtomstandigheden en de leeftijd van het gebruikte weefsel. Vul tenslotte de PDMS-kamer met beluchte PFD en breng de weefselmonsters voorzichtig over van de incubatie-Petrischaal naar de PDMS-kamer. Sluit het objectglas af met een dekglas en maak een opname.

Afhankelijk van de experimentele vereisten werden bladeren gedurende vijf minuten geïncubeerd in een suspensie van recombinant groen fluorescent eiwit of GFP. Bij microscopische inspectie van de in PFD geïncubeerde bladmonsters blijkt dat de meeste luchtruimtes gevuld zijn met recombinant GFP gesuspendeerd in PFD. Het GFP is groen, en het rood vertegenwoordigt chlorofyl, autofluorescentie en de cellen van het mesofyl.

Het is duidelijk dat het blad wordt overstroomd bij incubatie met PFD, maar dat er incidenteel luchtbellen kunnen overblijven. Water overstroomt het blad onder deze omstandigheden niet. Hier worden opsys-bladeren die Venus tot expressie brengen, een variant van YFP die in het cytosol lokaliseert, geïncubeerd en gemonteerd in lucht, water of PFD laser scanning. Confocale microscopie van de monsters toont een voordeel van PFD ten opzichte van lucht en water, met een ongeveer tweevoudige toename in de beelduitsnijdingsdiepte.

Bij het vergelijken van PFD en water kan deze techniek, eenmaal beheerst, in vijf tot 10 minuten worden uitgevoerd indien correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat perfluordecaline nagellak en Teflon oplost, maar compatibel is met siliconenvet. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe perfluordecaline als montage medium kan worden gebruikt om de beeldvorming in cellen van plantenbladeren te verbeteren.

Vergeet niet dat, hoewel perfluoro-decaline niet giftig is, we aanbevelen om standaard veiligheidspraktijken toe te passen bij het uitvoeren van deze procedure.