Name: Kwantitatieve vergelijking van Cis-Regulatory Element (CRE) Activiteiten in transgene Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Leer kwantitatieve vergelijking van cis-regulatoire elementen in transgene Drosophila melanogaster. Deze methode meet genregulatie tijdens metamorfose met confocale microscopie en ImageJ-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken: Nicolas Gompel en Benjamin Prud&#39;homme voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol, Melissa Williams en vier anonieme reviewers voor commentaar op het manuscript, de Universiteit van Dayton Graduate School voor onderzoek beurzen naar WAR, en de University of Dayton Biology afdeling en Research Institute (UDRI) voor ondersteuning van onderzoek voor TMW. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Grant 11BGIA7280000 aan TMW.

<ol><li>Davidson, E. H. The Regulatory Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Gene+Regulatory+Networks+in+Development+and+Evolution%22">Gene Regulatory Networks in Development and Evolution</a>. , Academic Press. (2006).</li>
<li>Wray, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+significance+of+cis-regulatory+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary significance of cis-regulatory mutations.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).</li>
<li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+developmental+biology+and+the+problem+of+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary developmental biology and the problem of variation.</a> Evolution. 54, 1079-1091 (2000).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134, 25-36 (2008).</li>
<li>Sethupathy, P., Collins, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+target+site+polymorphisms+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA target site polymorphisms and human disease.</a> Trends Genet. 24, 489-497 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461, 199-205 (2009).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+cloned+P+elements+into+Drosophila+germ+line+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes.</a> Science. 218, 341-347 (1982).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%22">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes</a>. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).</li>
<li>Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+modification+of+a+modular+enhancer+underlies+adaptation+in+a+Drosophila+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population.</a> Science. 326, 1663-1667 (2009).</li>
<li>Williams, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+evolution+of+a+genetic+switch+controlling+sexually+dimorphic+traits+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila.</a> Cell. 134, 610-623 (2008).</li>
<li>Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+sex+pheromone-producing+enzyme+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila.</a> PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).</li>
<li>Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+and+beta-galactosidase+transformation+vectors+for+promoter%2Fenhancer+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila.</a> BioTechniques. 29, 726-732 (2000).</li>
<li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFish%2C+MP+%22Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phiC31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid%22">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid</a>. , England. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook%22">Drosophila: A laboratory handbook</a>. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+noncoding+variant+to+phenotype+via+SORT1+at+the+1p13+cholesterol+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus.</a> Nature. 466, 714-721 (2010).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

cis-regulatorische elementen coderen genomische programma dat de genexpressie patronen en daarmee het proces van ontwikkeling een specificeert, en zijn prominente locaties voor beide mutaties ten grondslag liggen aan morfologische evolutie 2-4 en fenotypische variatie voor menselijke trekjes 5,6,19. Ondanks dit belang, blijven de wettelijke logica voor Cres slecht begrepen. Een prominente reden voor dit inzicht tekort is het gebrek aan geschikte methoden om kwantitatief te verge...

kwantitatieve vergelijking van cis-regulatory element (cre) activiteiten in transgene drosophila melanogaster</em

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Genexpressie patronen worden gespecificeerd door cis-regulerende element (CRE) sequenties, die ook worden genoemd enhancers of cis-regulatorische modules. Een typische CRE beschikt over een regeling van bindingsplaatsen voor diverse transcriptiefactor eiwitten die een regulerende logica te geven wanneer, waar en op welk niveau het gereguleerde gen (s) wordt uitgedrukt verlenen. De volledige set Cres in een dier genoom codeert voor het organisme-programma voor ontwikkeling van een, en empirische als theoretische studies tonen aan dat mutaties in Cres een prominente rol gespeeld in morfologische evolutie 2-4. Bovendien, het menselijk genoom wide association studies wijzen erop dat genetische variatie in Cres wezenlijke bijdrage leveren aan fenotypische variatie 5,6. Zo, het begrijpen van de regelgeving logica en hoe mutaties invloed hebben op een dergelijke logica is een centrale doelstelling van de genetica. Reporter transgenen bieden een krachtige methode om de studie van de in vivo functieTIE Cres. Hier een bekende of vermoede CRE sequentie wordt gekoppeld aan heterologe promoter en coderende sequenties voor een reporter gen dat codeert voor een gemakkelijk waarneembare eiwit product. Toen een journalist transgen wordt ingebracht in een gastheerorganisme, de CRE de activiteit wordt zichtbaar in de vorm van de gecodeerde reporter eiwit. P-element gemedieerde transgenese in de fruitvlieg Drosophila soorten (D.) melanogaster 7 is gebruikt voor de komende decennia reporter transgenen te introduceren in dit model organisme, hoewel de genomische plaatsing van transgenen is willekeurig. Daarom is het reportergen-activiteit sterk beïnvloed door de lokale chromatine en gen-omgeving, het beperken van CRE vergelijkingen met zijn kwalitatief. In de afgelopen jaren, was de phiC31 gebaseerde integratie-systeem aangepast voor gebruik in D. melanogaster om transgenen in te voegen in specifieke genoom landingsplaatsen 8-10. Deze mogelijkheid heeft de kwantitatieve meting van gen-en, hier van belang, CRE-activiteit 11 tot 13 ​​feasible. De productie van transgene fruitvliegjes kan worden uitbesteed, zoals phiC31-gebaseerde integratie, waardoor de noodzaak om dure apparatuur kopen en / of vaardigheden bij gespecialiseerde transgen injectie protocollen. Hier presenteren we een algemeen protocol om kwantitatief te evalueren een CRE activiteit, en laten zien hoe deze aanpak kan worden gebruikt om de effecten van een mutatie geïntroduceerd op de activiteit een CRE&#39;s te meten en de activiteiten van de orthologe CRES vergelijken. Hoewel de gegeven voorbeelden zijn voor een CRE actief tijdens de fruitvlieg metamorfose, kan de aanpak worden toegepast op andere ontwikkelingsstadia, fruitvlieg soorten, of model organismen. Uiteindelijk moet een meer wijdverbreide gebruik van deze aanpak om te studeren CRES vooraf een goed begrip van de regelgeving logica en hoe logica kan variëren en evolueren.

Fenotypische variatie voor de kenmerken kan het gevolg zijn van mutaties in cis-regulerende element (CRE) sequenties die de controle genexpressie patronen. Methoden afgeleid voor gebruik in Drosophila melanogaster kan kwantitatief vergelijken met het niveau van de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie gemedieerd door gewijzigde of natuurlijk voorkomende CRE varianten.

Kwantitatieve vergelijking van Cis-Regulatory Element (CRE) Activiteiten in transgene Drosophila melanogaster</em

Genexpressiepatronen worden bepaald door sequenties van cis-regulatoire elementen (CRE), die ook wel enhancers of cis-regulatoire modules worden genoemd. Een typisch CRE ...

Het algemene doel van deze procedure is om de genregulerende activiteiten van CIS-regulatoire elementen of CRE's die actief zijn tijdens de metamorfose-ontwikkeling van drosophila melan gastro kwantitatief te meten. Begin met site-specifieke integratiemethoden om lijnen van CRE's te genereren die als reporter-transgenen transgeen zijn ingebouwd. Verkrijg met behulp van een stereomicroscoop transgene exemplaren in het juiste ontwikkelingsstadium.Verwijder de specimens uit de buitenste pub en monteer ze op een glazen microscoopglas. Registreer vervolgens het niveau en het patroon van de expressie van het fluorescerende reportereiwit in whole-mount monsters middels confocale microscopische analyse. Kwantificeer tot slot het niveau van de expressie van het fluorescerende reportereiwit voor de opgenomen confocale beelden met behulp van de Image J-softwaretool.Deze resultaten wijzen een niveau van genregulerende activiteit toe om regulatoire elementen te identificeren en verdere vergelijkende genexpressiestudies op gemodificeerde CRE-versies te faciliteren. Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in genregulatie en de wijze

quantitative-comparison-cis-regulatory-element-cre-activities

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om de activiteit van cis-regulatorische elementen (dat wil zeggen, enhancer / promotor) te kwantificeren in levende muis netvlies via explantatie elektroporatie. DNA-voorbereiding, retinale dissectie, elektroporatie, retinale Explantatie cultuur, en post-fixatie analyse en kwantificering worden beschreven.

Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

Drosophila melanogaster is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuunsystemen en de fysiologische gevolgen van infectie en ziekte. Dit protocol beschrijft hoe robuuste en kwantitatief herhaalbare bacteriële infecties aan D. melanogaster kunnen worden toegediend, en hoe vervolgens de ernst van de infectie kan worden gemeten en de immuunrespons van de gastheer kan worden gekwantificeerd.

Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In dit werk bieden we een experimentele workflow van hoe actieve enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd.

Voorspelling en Validatie van Gene Regulatory Elements geactiveerd tijdens retinoïnezuur Induced embryonale stamcellen Differentiatie

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

We presenteren een protocol voor een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit voor de kwantificering van intacte mitochondriale massa in Drosophila weefsel homogenates.

Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster

Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het gebruik van het RNA-targeting Cas13D-enzym (RfxCas13D) in vliegen.

Alomtegenwoordige en weefselspecifieke RNA-targeting in Drosophila Melanogaster met CRISPR/CasRx

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

In dit artikel zullen we laten zien hoe het centrale zenuwstelsel ontleden uit derde instar Drosophila larven.

Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster

Leer kwantitatieve vergelijking van cis-regulatoire elementen in transgene Drosophila melanogaster. Deze methode meet genregulatie tijdens metamorfose met confocale microscopie en ImageJ-analyse.

Kwantitatieve vergelijking van Cis-Regulatory Element (CRE) Activiteiten in transgene Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen