Name: Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer reverse genetics voor vaccinontwikkeling tegen Rift Valley Fever virus met behulp van MP-12 mutanten. Deze methode karakteriseert NSs-eiwitmutaties om immunogeniciteit en veiligheid te verbeteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Grant Nummer 5 U54 AI057156-07 door de Western Regional Center of Excellence (WRCE), een R01 AI08764301-A1 van Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, en een interne financiering van Sealy Center for Vaccine Development aan de Universiteit van Texas Medical Branch.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Reverse genetics voor RVFV zijn ontwikkeld door verschillende groepen door gebruik te maken van T7-promotor 2,4,5 of muis 3 of 4 mensen pol-I promotor. In dit manuscript beschrijven we een protocol om recombinant RVFV MP-12-stammen te genereren door gebruik te maken BHK/T7-9 cellen 15 die stabiel uitdrukken T7 RNA-polymerase. De efficiëntie van virale herstel gevarieerd afhankelijk van de conditie van BHK/T7-9 cellen, de hoogte van plasmiden, het aantal getransfecteerde cellen...

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM)-alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Gewijzigde minimum Dulbecco&#39;s essentieel medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> Modified Eagle Medium (MEM 2x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Cellgro </td><td> 30 tot 240-CR </td><td></td></tr><tr><td> Tryptose fosfaat bouillon </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> Noble agar </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> Aerosol strakke deksel </td><td> Eppendorf </td><td> C-2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> 0,33% neutraal rood oplossing </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N2889-100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF cellen </td><td> InvivoGen </td><td> MEF-c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> InvivoGen </td><td> Ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> InvivoGen </td><td> ANT-zn-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kwantitatieve-Blue </td><td> InvivoGen </td><td> vertegen-QB1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 cellen 15 </td><td> Gifu universiteit, Japan </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vero-cellen E6 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td><td></td></tr></table>

met behulp van reverse genetics aan de nss-gen van de rift valley fever virus mp-12 strain om vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Rift Valley-koorts virus (RVFV), dat hemorragische koorts, neurologische aandoeningen of blindheid bij mensen, en een hoog percentage abortussen en foetale misvormingen bij herkauwers 1 veroorzaakt, is geclassificeerd als een HHS / USDA overlap te selecteren agent en een risico groep 3 ziekteverwekker. Het behoort tot het geslacht Phlebovirus in de familie Bunyaviridae en is een van de meest virulente leden van deze familie. Verschillende reverse genetics systemen voor de RVFV MP-12 vaccinstam 2,3 evenals wild-type stammen RVFV 4-6, waaronder ZH548 en ZH501, zijn ontwikkeld sinds 2006. De MP-12 stam (dat is een risico groep 2 ziekteverwekker en een niet-select agent) is sterk verzwakt door verschillende mutaties in de M-en L-segmenten, maar nog steeds draagt ​​virulente S-segment RNA 3, die een functionele virulentie codeert factor, NSS. De RMP12-C13type (C13type) dragen 69% in-frame verwijderen van NSS ORF mist alle bekende NSS-functies, terwijl het repliceert als efficient doet als MP-12 in VeroE6 cellen ontbreekt type I IFN. NSS induceert een shut-off van gastheer transcriptie waaronder interferon (IFN)-bèta mRNA 7,8 en bevordert de afbraak van double-stranded RNA-afhankelijke proteïne kinase (PKR) op de post-translationele niveau. 9,10 IFN-beta is transcriptioneel opgereguleerd door interferon regulerende factor 3 (IRF-3), NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1), en de binding van IFN-beta aan IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) stimuleert de transcriptie van IFN-alfa genen of andere interferon gestimuleerde genen (ISGs) 11, welke host antivirale activiteiten induceert, terwijl gastheer transcriptie onderdrukking waaronder IFN-beta-gen door NSS voorkomt dat het gen upregulations van die ISGs in reactie op virale replicatie, hoewel IRF-3, NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1) kan geactiveerd worden door RVFV7. . Zo NSS is een uitstekend doelwit verder te verzwakken MP-12 en voor het hosten aangeboren immuunrespons te verhogen door het afschaffen van de IFN-beta onderdrukking functie. HierBeschrijven we een protocol voor het genereren van een recombinant MP-12 codering gemuteerde NSS, en geven een voorbeeld van een screening methode om NSS mutanten die niet over de functie om IFN-beta mRNA-synthese onderdrukken identificeren. In aanvulling op haar essentiële rol in de aangeboren immuniteit, type-I IFN is belangrijk voor de rijping van dendritische cellen en de inductie van een adaptieve immuunrespons 12-14. Zo NSS mutanten het induceren van type I IFN worden verder verzwakt, maar tegelijkertijd efficiënter zijn op het stimuleren gastheer immuunreacties dan wild-type MP-12, waardoor ze ideale kandidaten voor vaccinatie benaderingen.

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Riftvalleykoorts-virus (RVFV), dat hemorragische koorts, neurologische aandoeningen of blindheid bij mensen veroorzaakt, en een hoog percentage abortussen en foetale...

Deze procedure genereert recombinant Rift Valley koortsvirus stam MP 12 dat gemuteerd NSS codeert middels reverse genetica en beoogt de fenotypen te karakteriseren voor vaccinontwikkeling. Ten eerste worden, met behulp van een transfectiesysteem in BHK-21-cellen die stabiel T7 RNA-polymerase tot expressie brengen, recombinante MP 12 stammutanten hersteld; vervolgens worden de herstelde recombinante MP 12 stammutanten geamplificeerd in Vero E6-cellen en worden de geamplificeerde MP 12-mutanten getitreerd via een plaque-assay. De laatste stap van de procedure is het screenen op het ontbreken van interferon-alfa- of betasupressie door mutante NS-eiwitten.Uiteindelijk kunnen de resultaten de voorbereiding van een kandidaat levend verzwakt vaccin voor Rift Valley-koorts faciliteren via een reverse genetics-systeem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het willekeurig introduceren van mutaties in het virale genoom door middel van chemische mutagenese of seriële passage, is de mogelijkheid om specifieke mutaties in het virale genoom te introduceren met behulp van een genetisch systeem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van vaccins tegen Rift Valley-koorts, zoals het belang van de belangrijke virulentiefactor NSs voor de immunogeniciteit van vaccinkandidaten.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat voor het Rift Valley-koortsvirus, net als bij andere doelen, blokkade en visualisatie van de blokkade een geoptimaliseerde techniek vereisen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor viraal herstel en hydratatie moeilijk aan te leren zijn omdat een stapsgewijs protocol voor deze methode niet is gerapporteerd. Plaats T 79 babyhamster-niercellen, die T7 RNA-polymerase stabiel tot expressie brengen, in schalen van zes centimeter en plaats deze in een incubator bij 70 tot 80% celconfluentie; vervang het medium door compleet MEM alpha zonder hygromycine B. Begin binnen een uur met het transfectieproces voor het herstel van het Rift Valley-koortsvirus.Maak één set plasmiden die virale genomische RNA's coderen voor expressie van het volledige virale RNA en een tweede set die virale gen Open reading frames coderen voor virale eiwitexpressie. Voeg nu 30 µL transit LT one toe aan 385 µL Optum in een 1,5 mL buis. Vortex kort en incubeer gedurende vijf minuten.Voeg bij kamertemperatuur de resulterende liposomen langzaam toe aan de sets van 10 microgram plasmide, die voorzichtig met pipetteren zijn gemengd, en incubeer dit 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het transfectiemengsel druppelgewijs toe aan bhk T seven nine cellen en incubeer gedurende 24 uur. Vervang het cultuursupernatans door compleet MEM alpha en cultiveer nog vier dagen. Oogst de cultuursupernatanten in een buis van 50 milliliter en verwijder celresten door centrifugatie.Pipetteer nu de supernatanten in cryobuisjes van 5 mL met schroefdop en bewaar deze passage 0 virusstock bij -80 °C om downstream experimenten te faciliteren. Om P0-virus te amplificeren in cellen die interferon-alfa- en bètagenen missen, kweek 80% confluente Vero E6-culturen in compleet DMEM, vervang het medium door het verdunde P0-virus en incubeer gedurende één uur.Verwijder het inoculum en kweek in 10 milliliters volledig DMEM gedurende drie tot vier dagen totdat het cytopathisch effect van Vero E6-cellen zichtbaar wordt. Oogst het supernatant zoals eerder beschreven en bestempel de monsters als E6 P1. Kweek Vero E6-cellen in platen met zes putjes tot 80% confluentie in volledig DMEM. Aspireer het medium van de Vero E6-cellen en voeg 400 microliters van tienvoudige seriële verdunningen van de E6 P1-viruspreparatie toe; incubeer gedurende een uur.Bereid ondertussen twee buizen van 15 milliliter voor voor de agar-overlay. Buis A bevat zeven milliliter 1,2% noble agar in water en buis B bevat zeven milliliter tweevoudig compleet MEM en 10% trip dose fosfaatbuffer. Giet na 15 minuten in de waterbaden buis B in buis A en meng deze met een pipet. Vervang het virale inoculum door twee milliliter per put van een één-op-één mengsel van buis A en B. Cultiveer de cellen gedurende drie tot vier dagen.Bereid de auger-overlay voor door 1,2% noble agar, twee x complete MEM en neutraalrood toe te voegen aan buis A en B, en een derde buis te labelen als neutraalrood. Plaats buis A in een waterbad van 42 °C en de andere twee buisen in een waterbad van 37 °C gedurende 15 minuten. Meng vervolgens zeven milliliter van buis A, zeven milliliter van buis B en 0,5 milliliter van het neutraalrood. Aliquoteer twee milliliter van het mengsel in elke put van een zes-wellplaat en incubeer de plaat overnight. Bepaal nu het aantal plaque-vormende eenheden per milliliter. C 57 wild-type embryonale fibroblasten van muizen coderen voor een gesecreteerd embryonaal alkalische fosfatase-gen dat induceerbaar is door NF kappa B en IRF drie of zeven.Hieronder bepalen we de seep-activiteit geïnduceerd door aangeboren immuunresponsen. Infecteer sub-confluente cellen in 12-wells platen met recombinant MP 12 met NS-mutaties of MP 12 controle en incubeer gedurende één uur. Verwijder het inoculum, voeg één milliliter complete DMEM per well toe en kweek gedurende 14 uur. Oogst de cultuursupernatanten voor een seep-assay. Voeg aan elke well van een 96-wells plaat 200 µL Quantum Blue en 50 µL van elk monster toe; verzegel de plaat en incubeer deze bij 37 °C gedurende één uur.Meet de OD bij 650 nanometer met een platenlezer. Het Rift Valley fever-virus heeft een tripartiet negatief-strengs RNA-genoom bestaande uit SM- en L-segmenten vergeleken met NSS van de MP 12-stam. Het open leesraam van het C 13-type is met 69% getrunceerd. Doorgaans genereert het reverse genetic-systeem levensvatbare recombinante MP 12-virussen met titers hoger dan 1 × 10⁶ PFU per milliliter voor het C 13-type virus.Cellen met een gebrek aan N-functies vormden grote troebele plaques, terwijl MP 12 heldere plaques van verschillende groottes vormde in vergelijking met mock-geïnfecteerde cellen na 14 uur post-infectie. C 57 wild-type meth-cellen geïnfecteerd met MP 12 vertonen geen stijging van het seep-niveau in cultuur.In tegenstelling tot het supernatant induceert een infectie van type C 13 een verhoogd niveau van seep na 14 uur post-infectie; northern blots met gebruik van een RNA-probe specifiek voor muis ISG 56 mRNA bevestigen de upregulatie van ISG 56 mRNA bij afwezigheid van N'S-expressie. Door deze procedure te volgen als methode voor muisimmunisatie en het testen van neutraliserende antilichamen, kunnen vragen worden onderzocht zoals de immunogeniciteit van NSS-mutanten. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van Valley Fever om de functies van non-structurele genen in geïnfecteerde cellen en dieren te verkennen.Vergeet niet dat het werken met infectieuze virussen uiterst gevaarlijk kan zijn, dus neem altijd voorzorgsmaatregelen om inademing van aerosol te voorkomen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u recombinante MP 12-stammen kunt herstellen en titreren en hoe u NSS-mutanten kunt screenen die de suppressiefunctie voor interferon alfa beta missen.

using-reverse-genetics-to-manipulate-nss-gene-rift-valley-fever-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Norovirussen zijn een belangrijke oorzaak van gastro-enteritis nog moleculaire technieken voor de karakterisering zijn nog relatief nieuw. Hier rapporteren wij twee verschillende reverse genetics benaderingen voor de doeltreffende inning van murine norovirus (MNV), het enige lid van dit geslacht die kunnen worden gekweekt in celcultuur.

Reverse genetics Mediated Herstel van infectieuze Murine Norovirus

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter...

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Vacciniavirus (VV) is op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en de verbetering van de volksgezondheid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige, zeer efficiënte methode om de VV genoom bewerken met een CRISPR-Cas9 systeem.

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

Herpesvirus van kalkoenen (HVT) wordt veel gebruikt als een vector-platform voor de generatie van recombinante vaccins tegen een aantal aviaire ziekten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en snelle aanpak voor de generatie van recombinante HVT-vectored vaccins met behulp van een geïntegreerde NHEJ-CRISPR/Cas9 en de Cre-Lox systeem.

Genereren van recombinante aviaire Herpesvirus vectoren met CRISPR/Cas9 Gene bewerken

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.

Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.

Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen

Leer reverse genetics voor vaccinontwikkeling tegen Rift Valley Fever virus met behulp van MP-12 mutanten. Deze methode karakteriseert NSs-eiwitmutaties om immunogeniciteit en veiligheid te verbeteren.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren (Video) | JoVE Journal

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Meer video's verkennen