Name: Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: Leer hoe je kinase- en fosfataseactiviteit door de celcyclus volgt met ratiometrische FRET in U2 OS-cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van fosforylering tijdens de G2-M-transitie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs worden ondersteund door de Zweedse onderzoeksraad, de Zweedse stichting voor strategisch onderzoek, de Zweedse Cancer Society, de Zweedse kind Cancer Society, Åke Wibergs fundering en Jeanssons stichting.

1. Introductie van de sonde naar de cellen <ol><li> Co-transfecteren cellen met een FRET-gebaseerde probe en een plasmide resistentie. Kies een transfectie methode die efficiënt is in uw cel-type van belang. Voor U2OS cellen, standaard calciumfosfaat transfectie methoden geven voldoende resultaat 15. </li><li> Selecteer cellen in de juiste antibioticum voor ten minste zeven dagen. Dit verrijkt de hoeveelheid cellen die de sonde en beperkt de hoeveelheid cellen met giftige expressie levels, of expressie niveaus, die sterk van invloed op de celcyclus. </li><li> (Optioneel) Selecteer voor stabiele klonen. </li><li> Met behulp van vaste of levende cellen, controleert zowel de CFP en YFP zijn aanwezig in alle cellen op ongeveer dezelfde verhouding. </li><li> In het geval dat sommige cellen bevatten slechts CFP of YFP, is recombinatie waarschijnlijk plaatsgevonden. Recombinatie kan optreden tijdens de groei van bacteriën of na transfectie van de sonde en kan in het laatste geval hangt af van plasmide kwaliteit. Herhalen plasmide preparatie en lineariseren het plasmide voor transfectie als het probleem aanhoudt. </li></ol> 2. Monitoring ratiometrische FRET <ol><li> Zaad cellen op met glazen bodem gerechten, of dekglaasjes voor montage in een kamer. Zorg ervoor dat de borden / dekglaasjes zijn geen 1.5 (170 micrometer dik). </li><li> Mount cellen in groei medium zonder fenol rood op een gemotoriseerde epifluorescentiemicroscoop met temperatuurregeling ingesteld op 37 ° C. Zorg voor pH-regulering van media, hetzij door CO 2 of met behulp van CO 2-onafhankelijke media, zoals Liebowitz-15. </li><li> Focus op cellen met behulp van doorvallend licht. Kijk niet op cellen met behulp van TL-licht. </li><li> Begin met het verwerven van een 12 of 16 bits beeld met YFP excitatie (YFPex) en YFP emissie (YFPem) filters en een geschikte dichroïde spiegel. Gebruik maximaal binning beschikbaar die nog steeds toelaat de vereiste subcellulaire resolutie. Met behulp van een hoge binning de blootstelling tijd of intensiteit verlagen is cruciaal voor fototoxiciteit te voorkomen. </li><li> Measure of schatten de achtergrond intensiteit en de benadering door het meten van geluid of het schatten van de ruwe gemiddelde, minimale en maximale pixel waarden in een gebied zonder cellen. Verandering belichtingstijd en grijsfilters, zodat het gemiddelde signaal in de cel is ongeveer de achtergrond intensiteit plus vijf tot tien keer het verschil tussen max en min achtergrond intensiteiten. </li><li> Controleer of de afbeeldingen niet goed als verzadigd. De maximale lichtsterkte in de afbeelding moet worden minder dan de helft van het dynamisch bereik (bijv. max 2000 in een 12-bits afbeelding) om te zorgen voor de intensiteit verschillen wanneer de cellen in te voeren mitose. </li><li> Herhaal stap 2,4 tot 2,6 met behulp van CFP excitatie-en emissie YFP filters en een geschikte dichroïde spiegel. </li><li> Selecteer meerdere regio's met getransfecteerde cellen, met uitzondering van de regio's gebruikt worden voor punt 2.4 van 2.7, en ervoor zorgen dat maximale intensiteit is minder dan de helft van het dynamisch bereik in alle cellen. </li><li> Start een time-lapse experiment de overname van twee beelden per 45 min met behulp van YFPex - YFPem en CFPex - YFPem filter sets. </li></ol> 3. Verifiëren en optimaliseren van voorwaarden <ol><li> Open de verworven beelden en toezicht op de celcyclus tijd van mitose tot mitose voor cellen die de getransfecteerde sonde uit te drukken. </li><li> Vergelijk de gemeten celcyclus tijd om gepubliceerde gegevens voor de gebruikte celtype. Als alternatief, film ongetransfecteerde cellen door het verwerven van een beeld van doorvallend licht slechts (bijvoorbeeld DIC of fase-contrast) elk uur om te verwijzen cel cyclustijden te krijgen. </li><li> In het geval dat de tijd van mitose naar mitose stemt overeen met referentie celcyclus timings, ga dan naar stap 4. Als alternatief, re-te verwerven beelden met behulp van harder blootstelling, meer tijd-punten of meerdere z-niveaus en herhaal stap 3. </li><li> In het geval dat de tijd van mitose naar mitose niet overeenkomt met de celcyclus timings referentie-, film-getransfecteerde cellen door de overname van een beeld van doorvallend licht slechts (bijvoorbeeld DIC of fase-contrast) elk uur gevolgd door een image op het eindevan het experiment om getransfecteerde cellen te identificeren. </li><li> Als de getransfecteerde cellen vertonen nog steeds langere celcyclus keer, herhaalt u stap 1, maar transfecteren minder sonde of te kiezen voor een stabiele klonen die zeer kleine hoeveelheden van de sonde bevatten. </li><li> Als de getransfecteerde cellen vertonen een normale celcyclus keer in de afwezigheid van TL-licht, herhaalt u stap 2, maar lagere blootstelling door het wijzigen binning, grijsfilters, belichtingstijd, en de tijd tussen de afbeeldingen. </li></ol> 4. Analyseren van FRET <ol><li> De analyse kan worden uitgevoerd door de meeste software gewijd aan de microscopie. Hier beschrijven we hoe u de analyse met behulp van de freeware ImageJ (uit te voeren <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> ) gebruik te maken van de plugin Ratio Plus ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus.html" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html</a> ). </li><li> Open de afbeeldingen in ImageJ. In het geval dat uw foto's worden in de vorm van een multicolor STACk (bv. Deltavision), apart van de afzonderlijke kanalen door eerst te converteren naar een HyperStack: Image-HyperStack-stack te HyperStack en vervolgens te splitsen naar single channel stacks met: Image-HyperStack-dimensionaliteit te verminderen </li><li> Vermenigvuldig de YFPex - YFPem stack met 3 met behulp van: Proces-Math-Vermenigvuldigen Deze stap is optioneel, want het is alleen bedoeld om het visuele helderheid van de beelden te verhogen door ervoor te zorgen dat niet ratio's worden in het bereik tussen 0 en 1. </li><li> In de YFPex - YFPem stack, trekken een regio of interest (ROI) in een gebied dat verstoken is van cellen, maar dat is dicht bij een cel te meten. Verschillende cellen in dezelfde afbeelding kunnen verschillende regio's, zowel als achtergrond en intensiteit van het signaal meestal is het sterkst in het midden van een beeld. </li><li> Voeg de ROI aan ROI manager: Analyseren-tools-ROI manager. </li><li> Meet de gemiddelde intensiteit van de ROI in zowel de YFPex - YFPem en de CFPex - YFPem stack: Analyseer-Meet </li><li> Herhaal dit op meerdere tijdstippen en controleer of achtergrond intensiteiten dicht bij de cel van belang zijn vergelijkbaar in de hele film. </li><li> Stel metingen om een minimale intensiteit zijn onder meer: ​​Analyze-Set-metingen-Min en Max grijs waarde. </li><li> Teken een regio van belang die het grootste deel van een cel en meet de minimale intensiteit in zowel de YFPex - YFPem en de CFPex - YFPem stack. Neem het verschil tussen de gemeten minimale intensiteit en de achtergrond intensiteit van 4,6 en delen door twee. Dit biedt een uitgangspunt schatting voor een clipping waarde. </li><li> Open Ratio Plus. Selecteer de YFPex - YFPem en de CFPex - YFPem stack. Voor de FRET-ratio, selecteer CFPex - YFPem als stack 1, voor de omgekeerde FRET-ratio visualiseren van sondes waar efficiëntie afneemt FRET op fosforylering, selecteer YFPex - YFPem als stack 1. </li><li> Plaats de gemeten intensiteiten achtergrond en het knippen waarden. </li><li> Stel de schaling van de daaruit voortvloeiende verhouding tussen stack en toepassen van een geschikte blik up table (LUT) naar verhouding veranderingen te visualiseren. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Plk1 activiteit voor het eerst zichtbaar in de kern in de G2-fase en pieken tijdens de mitose. Figuur 3 toont een experiment met minimale fototoxiciteit instellingen zoals beschreven in paragraaf 2. Let op: dit is een representatief eerste resultaat en dat de blootstelling voorwaarden of de tijd tussen de beelden kunnen worden aangepast om het signaal te verhogen tot ruis ratio of temporele resolutie. Figuur 3D toont aan dat een meerderheid van de cellen die de sonde vermenigvuldigen met een celcyclus tijd van tussen de 20 en 25 uur, wat aangeeft dat de beeldvorming voorwaarden en de expressie van de sonde niet celcyclus timings beïnvloeden. Hoewel er veel ruis, de trend van Plk1 activiteit toe in G2 en een piek in de mitose 14 is duidelijk zichtbaar (fig. 3A). De verwerking van de ruwe data, hier door betekenen filteren gepresenteerd als een kymograaf (fig. 3B), of kwantificering van de gemiddelde omgekeerde ra Tio (fig. 3C) kan verbeteren duidelijkheid. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Principe van een FRET-gebaseerde sonde naar kinase en fosfatase te controleren. Twee fluoroforen, typisch CFP (blauw) en YFP (groen), zijn verbonden door een fosfo-bindend domein (oranje) en een fosforyleerbare sequence (geel). Fosforylering (rood) bemiddelt binding aan de fosfo-bindende domein, en veroorzaakt daardoor een conformationele verandering in de sonde. De conformationele verandering resulteert in een verschil in de afstand of oriëntatie tussen de twee fluoroforen, die invloed op de FRET efficiëntie tussen het GVB en YFP. FRET kan worden gevisualiseerd door spannende CFP en YFP controle emissie (stippellijnen). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3410/3410fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schematisch overzicht van de experimentele procedure. p_upload/3410/3410fig3.jpg "/&gt; Figuur 3. Plk1 activiteit voor het eerst zichtbaar in de kern in de G2-fase en pieken tijdens de mitose. U2OS cellen die een FRET-gebaseerde probe controle Plk1 activiteit 9,14 werden gefilmd voor 60 uur gebruik van een Deltavision Spectris imaging systeem uitgerust met een 20x NA 0,7 lucht-doelstelling en een kwiklamp. Imaging omstandigheden werden geselecteerd om minimaal fototoxiciteit veroorzaken, zoals uiteengezet in sectie 2, met behulp van 4x binning en neutrale dichtheid filters die blokkeren 99% van het binnenkomende licht. A, valse voorstelling van kleur omgekeerde FRET-ratio, het volgen van een cel tot en met 4 divisies. B, kymograaf van de cel getoond in A na het toepassen van een gemiddelde filter. C, kwantificering van de omgekeerde FRET-ratio van de cel getoond in A. D, cumulatieve mitotische ingang van 50 FRET-probe tot expressie brengende cellen, met inbegrip van divisies van dochtercellen.

<ol><li>Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+microscopy+in+2010%3A+the+legacy+of+Theodor+Forster+on+the+100th+anniversary+of+his+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth.</a> Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).</li>
<li>Allen, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+dynamics+of+protein+kinase+A+activity+visualized+by+FRET-based+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).</li>
<li>Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+protein+kinase+B%2FAkt+signaling+revealed+by+a+genetically+encoded+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter.</a> J. Biol. Chem. 280, (2005).</li>
<li>Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+reveals+oscillatory+phosphorylation+by+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase.</a> C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).</li>
<li>Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+regulation+of+protein+kinase+D+revealed+by+a+genetically+encoded+kinase+activity+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).</li>
<li>Harvey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+ERK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).</li>
<li>Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+JNK+activity+dynamics+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+activation+of+CyclinB1-Cdk1+coordinates+entry+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.</a> Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).</li>
<li>Fuller, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midzone+activation+of+aurora+B+in+anaphase+produces+an+intracellular+phosphorylation+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient.</a> Nature. 453, 1132-1136 (2008).</li>
<li>Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+kinase+dynamics+in+living+cells+with+FRET+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters.</a> Methods. 40, 279-286 Forthcoming.</li>
<li>Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorgan%2C+DO+%22The+cell+cycle+%3A+principles+of+control%22">The cell cycle : principles of control</a>. , New Science Press, in association with Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+decision+to+enter+mitosis%3A+feedback+and+redundancy+in+the+mitotic+entry+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network.</a> J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).</li>
<li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).</li>
<li>Macurek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase-1+is+activated+by+aurora+A+to+promote+checkpoint+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery.</a> Nature. 455, 119-123 (2008).</li>
<li>van der Eb, A. J., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+transforming+activity+of+tumor+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of transforming activity of tumor virus DNA.</a> Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).</li>
<li>Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+free%2C+versatile+software+for+automated+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.</a> Biotechniques. 42, 71-75 (2007).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75, 761-767 (2009).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Monitoring FRET gedurende de celcyclus vereist overwegingen die minder belangrijk bij de beoordeling van de korte termijn reacties op prikkels van buitenaf. Ten eerste is celcyclusprogressie gemakkelijk verstoord door stress signaleren, te verlangen dat fototoxiciteit is tot een minimum beperkt. Ten tweede, kunnen alle reporters potentieel van invloed op cellulaire processen door titratie van kinasen, fosfatasen of interactie domeinen. De waarschijnlijk meest eenvoudige manier om te beoordelen of de experimentele omstan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Catalogus nummer </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15, geen fenol rood </td><td> 21083-027 </td><td> GIBCO, door Life Technologies </td></tr><tr><td> DMEM + Glutamax-I </td><td> 31966 </td><td> GIBCO, door Life Technologies </td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum (FBS) </td><td> SV30160.03 </td><td> Hyclone </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsine EDTA </td><td> SH30236.01 </td><td> Hyclone </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> SV30010 </td><td> Hyclone </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> 14287 </td><td> GIBCO, door Life Technologies </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> P8833 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table>

monitoring kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door ratiometrische fret

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

Förster resonance energy transfer (FRET)-gebaseerde verslaggevers 1 laat de beoordeling van de endogene kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen. Dergelijke sondes bestaan ​​gewoonlijk uit van varianten van het GVB en YFP, ingegrepen door een fosforyleerbare volgorde en een fosfo-bindend domein. Bij fosforylering, de sonde verandert conformatie, hetgeen resulteert in een verandering van de afstand of oriëntatie tussen het GVB en YFP, wat leidt tot een verandering in de FRET efficiëntie (afb. 1). Verschillende sondes zijn gepubliceerd in het laatste decennium, het toezicht op de activiteit saldo van meerdere kinases en fosfatasen, waaronder verslaggevers van PKA 2, 3 PKB, PKC 4, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 en Plk1 9 . Gezien de modulaire ontwerp, extra sondes waarschijnlijk ontstaan ​​in de nabije toekomst 10. Voortgang door de celcyclus wordt beïnvloed door stress signaling paden 11. Met name, is de celcyclus en gemeente verschillend geregeld tijdens onverstoord de groei in vergelijking met wanneer de cellen zich herstellen van stress 12. Time-lapse beeldvorming van cellen door de celcyclus dan ook bijzondere voorzichtigheid vereist. Dit wordt een probleem, vooral wanneer zij een beroep ratiometrische imaging, aangezien twee beelden met een hoge signaal-ruisverhouding nodig zijn om correct te interpreteren de resultaten. Ratiometrische FRET beeldvorming van celcyclus afhankelijke veranderingen in kinase en fosfatase activiteiten is voornamelijk beperkt tot sub-secties van de celcyclus 8,9,13,14. Hier bespreken we een methode om FRET-gebaseerde probes met ratiometrische beeldvorming in de gehele menselijke cel-cyclus te volgen. De methode is gebaseerd op materiaal dat beschikbaar is voor veel onderzoekers in life sciences en vereist geen specialistische kennis van microscopie of beeldverwerking.

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Reporters op basis van F&ouml;rster-resonantie-energietransfer (FRET)1 maken het mogelijk om de endogene kinase- en fosfataseactiviteiten in levende cellen te beoordelen. Dergelijke ...

In deze video worden kinase- en fosfataseactiviteiten gedurende de gehele celcyclus gemonitord met behulp van Förster-resonantie-energietransfer of FRET. Hier is een probe voor de activiteit van polo-like kinase 1 of PLK1, waarbij een cyaan fluorescent protein (CFP) aan het ene uiteinde is geplaatst en een geel fluorescent protein (YFP) aan het andere uiteinde. Deze probe wordt getransfecteerd in U2 OS-cellen.Om vervolgens de fosforyleringsstatus van LK-doelwitten tijdens de G2-M-overgang te onderzoeken, worden de getransfecteerde U2 OS-cellen onderworpen aan fluorescence time-lapse imaging. Wanneer CFP en YFP zich in nauwe nabijheid bevinden en CFP wordt geëxciteerd, wordt energie overgedragen naar YFP en kan YFP-emissie worden gedetecteerd. Echter, wanneer de probe gefosforyleerd raakt, zorgt een conformationele verandering in het eiwit ervoor dat CFP en YFP van elkaar gescheiden worden.Wanneer CFP nu wordt geëxciteerd, worden een sterke CFP-emissie en slechts een zwakke YFP-emissie gedetecteerd; kwantificering van de ratio van de YFP-emissie na zowel CFP- als YFP-excitatie toont aan dat de PLK1-activiteit toeneemt in G2 en piekt tijdens de mitose. Het belangrijkste voordeel van

monitoring-kinase-phosphatase-activities-through-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het bepalen van de celcyclus positie van een populatie van cellen, of begrijpen hoe signalen proliferatie van invloed zijn, gemakkelijk kan worden gemeten door middel van flowcytometrie gebruik van dit protocol. We brengen verslag uit een eenvoudige experimentele benadering voor vlekken cellen en kwantificeren van hun positie in de cel cyclus.

Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

This video describes the time-resolved Förster resonance energy transfer or TR-FRET assay to determine endogenous protein phosphorylation with the help of donor and acceptor fluorophores tagged on antibodies specific to a test protein. This technique is designed to measure the phosphorylation of test proteins in cell lysates.

Time-Resolved Forster Resonance Energy Transfer for Monitoring Protein Phosphorylation in Cells

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

De activering van de multifunctionele Ser/Thr kinase AURKA wordt gekenmerkt door zijn autofosforylering op Thr288. Fluorescerende sondes die op FRET vertrouwen, kunnen onderscheid maken tussen de inactieve en geactiveerde toestanden. Hier illustreren we enkele strategieën voor sonde-engineering, samen met een snel FRET-protocol om de kinase-activering tijdens mitose te volgen.

Real-Time Monitoring van Aurora kinase A Activatie met behulp van Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht cel-gebaseerde assay protocollen worden beschreven voor de eenvoudige, specifieke, gevoelige en robuuste kwantificering van endogene gefosforyleerde signaal transducer en activator van transcriptie (STAT) 1/3/4/5/6 eiwitten in cellysaten in een 384-well formaat.

Tijd-opgeloste Förster Resonantie Energie Transfer Assays voor meting van endogene gefosforyleerde STAT-eiwitten in menselijke cellen

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ  bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

Hier presenteren we een protocol om de spatiotemporele dynamiek van Akt-activering en fosforylering in levende HepG2-cellen te kwantificeren. Förster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel dat waardevolle inzichten biedt in insulinesignaleringsroutes en metabole regulatie in kankercellen.

Levende cel Förster resonantie energieoverdracht beeldvorming van metabolisch gereguleerde akt-activeringsdynamiek in HepG2-cellen

Leer hoe je kinase- en fosfataseactiviteit door de celcyclus volgt met ratiometrische FRET in U2 OS-cellen. Deze methode maakt real-time monitoring van fosforylering tijdens de G2-M-transitie mogelijk.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Meer video's verkennen