Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET
27 januari 2012
FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.
In deze video worden kinase- en fosfatase-activiteiten gedurende de celcyclus gemonitord met behulp van Forrester Resonance Energy transfer of fret. Hierbij is aan het ene uiteinde een cyan fluorescente eiwit CFP geplaatst en aan het andere uiteinde een geel fluorescente eiwit YFP. Deze sonde wordt getransfecteerd in U2 OS-cellen.
Vervolgens worden de getransfecteerde U2 OS-cellen onderworpen aan time-lapse fluorescentie-beeldvorming om de fosforylatiestatus van LK een doelwitten tijdens de G twee twee M-overgang te onderzoeken. Wanneer CFP en YFP dicht bij elkaar zijn en CFP is opgewonden, wordt energie overgedragen aan YFP en kan YFP-admissie worden gedetecteerd. Wanneer de sonde echter wordt gefosforyleerd, scheidt een conformationele verandering in het eiwit CFP en YFP.
Wanneer CFP nu wordt opgewonden, worden een sterke CFP-emissie en slechts een zwakke YFP-emissie gedetecteerd. De kwantificering van de verhouding van YFP-emissie na zowel CFP- als YFP-opwinding toont aan dat PLK een activiteit toeneemt in G twee en een piek bereikt tijdens de mitose. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals standaard geometrisch filmen, is dat specifieke aandacht wordt besteed aan het feit dat de celcyclus niet wordt verstoord, hetzij door filmomstandigheden, hetzij door expressie van een sonde. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het celcyclusveld, zoals waar en wanneer specifieke kinasen of fosfatasen worden geactiveerd.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in celcyclusgereguleerde enzymen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen waarbij onres-omstandigheden vereist zijn, zoals celproliferatie-assays. Om de menselijke celcyclus te monitoren, worden U2 OS-cellen getransfecteerd met een fret-gebaseerde PK een activiteitssonde. Met behulp van een standaard calciumfosfaat-transfectiemethode worden de cellen gedurende minimaal zeven dagen geselecteerd in purmycine.
Dit verrijkt de populatie cellen die de sonde tot expressie brengen en beperkt het aantal cellen met toxische expressieniveaus of expressieniveaus die de celcyclus ernstig beïnvloeden. Stabiele klonen worden vervolgens geselecteerd door beperkte verdunning. De expressie van CFP en YFP wordt vervolgens onderzocht om te verifiëren dat ze in alle cellen ongeveer in dezelfde verhouding aanwezig zijn. Als sommige cellen alleen CFP of YFP bevatten, is er waarschijnlijk recombinatie opgetreden. Herhaal in dit geval de plasmidevoorbereiding met behulp van bacteriën die minder vatbaar zijn voor homologe recombinatie, zoals Sure Two-cellen. Bereid vervolgens het plasmide voor en herhaal de transfectie.
Zodra de cellen de sonde stabiel tot expressie brengen, zaai ze dan op nummer 1,5 glazen bodembakken nadat ze zijn gehecht en 30 tot 50% confluent zijn. Verander het medium naar een medium dat CO2-onafhankelijk is en geen fenolrood bevat. Monteer de cellen op een gemotoriseerde epifluorescentiemicroscoop met temperatuurregeling ingesteld op 37 graden Celsius. De microscoop moet zijn uitgerust met CFP- en YFP-excitatieverlichting en -emissiefilters.
Een ROIC-spiegel die geschikt is voor het monitoren van CFP en YFP en een objectief dat geschikt is voor de vereiste resolutie. Hier wordt een 20 x NA 0,75 luchtobjectief gebruikt. Breng de cellen met behulp van doorgelaten licht scherp.
Gebruik op dit punt geen fluorescerend licht, omdat dit een stressrespons kan veroorzaken die de celcyclus kan verstoren. Om fototoxiciteit te voorkomen, stel de buiging in op de maximaal beschikbare waarde die de vereiste subcellulaire resolutie toelaat. Voor dit experiment moet het mogelijk zijn om het kern en het cytoplasma te onderscheiden.
Stel een korte belichtingstijd in en plaats een hoog neutraal dichtheidsfilter. Vervolgens wordt een 12- of 16-bits testafbeelding verkregen. Gebruik YFP-excitatieverlichting en -emissie, pas de belichtingstijd en neutraal dichtheidsfilters aan zodat de gemiddelde intensiteit in een cel ongeveer gelijk is aan de achtergrondintensiteit plus vijf keer het verschil tussen de minimale en maximale achtergrondintensiteiten. Om te verifiëren dat de afbeeldingen niet verzadigd zijn, onderzoekt u de fluorescentie-intensiteit voor de steekproefafbeelding.
De maximale intensiteit in de afbeelding moet minder dan de helft van de dynamische bereik zijn om intensiteitsverschillen mogelijk te maken wanneer cellen de mitose binnengaan. Herhaal vervolgens dit proces met behulp van CFP-excitatieverlichting en YFP-emissiefilters. Selecteer meerdere regio's met getransfecteerde cellen, met uitzondering van de regio's die worden gebruikt voor scherpstelling en het optimaliseren van de belichtingsomstandigheden.
Aangezien deze procedures mogelijk een stressrespons hebben opgeroepen, zorg ervoor dat de maximale intensiteit minder dan de helft van het dynamische bereik is in alle cellen. Instrueer de software om elke 45 minuten twee afbeeldingen te verwerven met behulp van YFP-excitatieverlichting, YFP-emissie en CFP-excitatieverlichting. YFP-emissiefilters.
Stel ook de totale lengte van het experiment in om de duur van de celcyclus te overschrijden. Zodra alles is ingesteld, begint u met het verwerven van afbeeldingen. Na voltooiing van de acquisitie, opent u de verkregen afbeeldingen en bewaakt u de celcyclustijd van mitose tot mitose. Voor cellen die de getransfecteerde sonde hier tot expressie brengen, was de celcyclustijd ongeveer 20 tot 25 uur.
Vergelijk dit met controlegegevens voor het gebruikte celtype. Als de celcyclustijd overeenkomt met referentietiming, kan fret worden geanalyseerd. Zodra de timing is geverifieerd, kunnen de afbeeldingen worden geanalyseerd.
De analyse kan worden uitgevoerd door de meeste software die is gewijd aan microscopie. Hier wordt Image J freeware gebruikt met de ratio plus-plugin. Begin de analyse door de afbeeldingen in Image J te openen. Als de afbeeldingen in een multicolor stack-indeling zijn, scheidt u de individuele kanalen door ze om te zetten in een hyperstack Door te selecteren afbeelding.
Kies vervolgens hyperstack en vervolgens stack naar hyperstack. Het venster
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het monitoren van kinase- en fosfataseactiviteiten in levende cellen met behulp van FRET-gebaseerde reporters. De focus ligt op het beoordelen van celcyclusafhankelijke veranderingen in de fosforylering van doeleiwitten.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- FRET (Forster Resonance Energy Transfer) is een krachtige techniek voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- Kinasen en fosfatasen spelen een cruciale rol bij celsturing en regulatie.
- Het monitoren van deze activiteiten in levende cellen biedt inzicht in cellulaire processen.
- De celcyclus is een kritieke periode voor het bestuderen van fosforyleringsveranderingen.
Doel van de studie
- Om het gebruik van FRET-gebaseerde reporters voor het monitoren van kinaseactiviteit te demonstreren.
- Om fosforyleringsveranderingen tijdens de celcyclus te beoordelen.
- Om een visuele methode te bieden voor het in real-time volgen van deze biochemische processen.
Gebruikte methoden
- Transfectie van U2 OS-cellen met een FRET-probe die CFP en YFP bevat.
- Time-lapse fluorescentiebeeldvorming om de fosforyleringsstatus waar te nemen.
- Excitatie van CFP om energieoverdracht naar YFP te detecteren.
- Analyse van conformationele veranderingen in de probe na fosforylering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van kinase-activiteit gedurende de gehele celcyclus.
- Aangetoonde veranderingen in FRET-efficiëntie die correleren met de fosforyleringsstatus.
- Visueel bewijs geleverd van kinase-activiteit tijdens de overgang van G2 naar M.
- De bruikbaarheid van FRET in live-cell imaging-studies benadrukt.
Conclusies
- FRET-gebaseerde reporters zijn effectief voor het monitoren van kinase- en fosfataseactiviteiten.
- Deze methode maakt real-time observatie van celcyclusafhankelijke fosforyleringsveranderingen mogelijk.
- De aanpak kan worden toegepast op diverse studies binnen de celbiologie en biochemie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het monitoren van kinase- en fosfataseactiviteiten gedurende de gehele celcyclus maakt nauwkeurige analyse mogelijk van signaleringsdynamiek die cruciaal is voor targetvalidatie in de oncologie en celproliferatiepaden. Deze ratiometrische FRET-benadering biedt kwantitatieve real-time read-outs van de fosforyleringsbalans, wat mechanische risicoreductie ondersteunt door enzymactiviteit te koppelen aan de progressie van de celcyclus zonder de natuurlijke fysiologie te verstoren. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door te identificeren wanneer en waar specifieke kinasen worden geactiveerd, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in lead-identificatiepipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe observatie mogelijk van de balans tussen endogene kinase- en fosfataseactiviteit in levende cellen, wat therapeutische hypothesen en betrokkenheid van signaalpaden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van standaard microscopieapparatuur en transfectiemethoden, waardoor er geen gespecialiseerde expertise nodig is voor implementatie in discovery-labs.
- Voorspellende waarde: Volgt activiteitsveranderingen tijdens de G2/M-overgang, wat de temporele resolutie biedt om kinaseactivatie te koppelen aan fenotypische uitkomsten in proliferatieassays.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert ratiometrische FRET-readouts die resistent zijn tegen variabiliteit in expressieniveaus en imaging-artefacten, wat een robuuste screening van verbindingen mogelijk maakt.
- Kwantitatieve output: Meet YFP/CFP-emissieverhoudingen om de fosforyleringsstatus te kwantificeren, ter ondersteuning van dosis-responscurves en inhibitorprofilering.
- Schaalbaarheid: Compatibel met time-lapse imaging in multi-well formaten na aanpassing, waardoor longitudinale monitoring van kinaseactiviteit in met geneesmiddelen behandelde populaties mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekte-relevantie: Monitort de activiteit van PLK1, een mitotische kinase die vaak ontregeld is bij kanker, waardoor moleculaire mechanismen worden gekoppeld aan fenotypes van de celcyclus.
- Translationele continuïteit: Verbindt vroege waarnemingen van target-engagement met functionele progressie van de celcyclus, ter ondersteuning van preklinische validatie op basis van biomarkers.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt onderscheid tussen kinase-gestuurde fosforylering en de tegenwerkende activiteit van fosfatasen, waardoor het aantal fout-positieven in studies naar target-modulatie wordt verminderd.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het discovery-continuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij dynamische activiteitsmetingen inzicht geven in de effecten van verbindingen op signaleringsknopen voorafgaand aan de fenotypische verankering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door spatiotemporele kinase-activatiepatronen in levende cellen te visualiseren, waardoor pathway-modulatie wordt verduidelijkt.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via ratiometrische normalisatie, wat de reproduceerbaarheid over verschillende condities en tijdspunten verbetert.
- Analytics: Genereert kwantitatieve ratio-metrieken waarmee kinase-activiteitstoestanden kunnen worden vergeleken, wat discussies over structuur-activiteitsrelaties faciliteert.
- Translational Research: Stemt de modulatie van moleculaire targets af op fenotypes van celcyclus-exit of -arrest, wat go/no-go-criteria in preklinische modellen ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het monitoren van elk kinase/fosfatase-paar via modulair probe-ontwerp, waardoor de inspanningen voor herontwikkeling in verschillende projecten worden verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in de kinase-fosfatasebalans, waardoor ambiguïteit bij doelwitvalidatie en padanalyse wordt verminderd.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van breed beschikbare hardware (epi-fluorescentiemicroscoop, standaardfilters) en software (ImageJ met ratio plus-plug-in), wat de drempel voor adoptie verlaagt.
- Strategische waarde: Verhoogt de besluitvaardigheid door biochemische activiteit te koppelen aan de progressie van de celcyclus, waardoor uitval in een laat stadium door onverwachte signaleringseffecten wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van celcyclusafhankelijke activiteitsprofielen, wat de kapitaalefficiëntie bij lead-optimalisatie verbetert.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering voor het genereren van FRET-probes met CFP/YFP en fosfo-sensoren domeinen.
- Toegang tot fluorescentiemicroscopie met CFP/YFP excitatie-/emisiefilters, temperatuurregeling en een opstelling voor beeldvorming met lage fototoxiciteit is noodzakelijk.
- Gestandaardiseerde workflows voor transfectie en clonale selectie zijn vereist om een uniforme expressie van de probe te waarborgen zonder verstoring van de celcyclus.
- Omvat zorgvuldige optimalisatie van belichtingstijden en neutrale dichtheidsfilters om verzadiging en fototoxiciteit tijdens langdurige beeldvorming te voorkomen.
- Afhankelijk van vaardigheden in beeldanalyse voor het verwerken van ratiometrische gegevens met tools zoals ImageJ en de ratio plus-plugin voor nauwkeurige kwantificering.
