Name: Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Leer hoe je store-operated calcium entry (SOCE) evalueert in kankercellen en skeletspiervezels met fluorescentiebeeldvorming. Deze methode biedt hoge resolutie voor calciumdynamica-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr Noah Weisleder voor het lezen en bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Research Grants UMDNJ Stichting 62-09 te ZP, American Heart Association SDG2630086 aan XZ, 0535555N naar MB en National Institutes of Health RC2AR058962-01 naar MB.

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice%3A+roles+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+the+immune+system+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li>
<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li>
<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hoewel de golflengten van Ca2 +-binding en Ca2 + vrije Fura-2 zijn 340 nm en 380 nm respectievelijk de beste verhouding dynamisch bereik van Fura-2 Ca2 +-concentratie kan op andere golflengten in een bepaalde microscoop systeem. Deze verschuivingen golflengte gewoonlijk als gevolg van veranderingen in de lichtweg van de toevoeging van verschillende optische componenten. In deze studie werden de excitatiegolflengten voor Fura-2 bepaald als 350 nm en 390 nm door het uitvoeren van spectrale analyse van Fura-2 fluorescentie. De intracellulaire Ca2 +-niveau in het cytosol resultaten van een saldo van verschillende bronnen, waaronder intracellulair Ca2 + release extracellulaire Ca2 + ingang, alsmede Ca2 + uitsluitingsmechanisme de ER en plasmamembraan. Om de unidirectionele SOC gemedieerde Ca2 + influx isoleren van intracellulair Ca2 + en afgifte Ca2 + extrusion kan de Mn2 + quenching assay gebruikt worden. Mn2 + bekend kunnen doordringen in de cellen via SOCE maar ongevoelig oppervlaktemembraan extrusie of ER opname door Ca2 + pompen. Daarom fluorescentie quenching is een meting van unidirectionele Mn2 + flux in cellen die de mate van activering van SOCE schat. Mn2 + quenching assay uitgevoerd op de isosbestic punt, zoals golflengte Fura-2 fluorescentie intensiteit is onafhankelijk van Ca2 + concentratie. De isosbestic punt voor elk systeem moet worden bepaald door spectrum scannen. Als alternatief kan Mn2 + quenching opgenomen door aangepaste fluorescentie bij elke twee golflengten zodanig dat de uiteindelijke waarde onafhankelijk van Ca2 +-concentratie 13. Om de ruimtelijke en temporele informatie van de activiteit van SOCE in de skeletspieren te krijgen, hebben we gebruik van een dual-dye methode, die gelijktijdig MeasureMe maaktnt van SOCE activiteit en SR Ca 2 +-gehalte in huid volwassen zoogdieren EDL spiervezels. De correlatie tussen veranderingen in de SR Ca 2 + inhoud en SOCE activiteit kan worden uitgezet om de drempel en de gevoeligheid van SOCE activering tot uitputting van de SR Ca 2 + opslag te geven. De TT-laden oplossing geoptimaliseerd bovendien de T-buisjes geladen met Ca2 + en priming van de T-buisjes en de SR-laden oplossing is ontworpen om maximaal SR Ca 2 + lading te bevorderen en tevens laden T-buisjes met ~ 500 uM Ca 2 +. FCCP is opgenomen in de TT / SR-laden oplossing en SR-afbrekende oplossing voor de effecten van de mitochondria elimineren.

Tabel van specifieke reagentia en apparatuur: <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10 tot 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham&#39;s F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10 tot 080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10 tot 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Dish </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, seal strak, beschermd tegen licht, opgelost in DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, seal strakke, beschermd tegen light </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, seal strakke, beschermd tegen licht </td></tr><tr><td> Quartz Cuvette </td><td> Starna Cellen </td><td> 3 Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-benzyl-p-tolueen sulfonamide (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Type I collagenase </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Uitrusting: <ol><li> Een spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon-arc booglamp, computer-gestuurde high-speed random access monochromator, kuvet op basis van emissie-monochromator, Nikon TE-200 omgekeerde fluorescentie microscoopE, S Fluor 40x/1.30 olie objectieve, PMT detectoren. </li><li> Laser scanning confocale microscoop (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 omgekeerde microscoop, 60X objectief (NA 1.4, olie). </li><li> Een stereomicroscoop met een vergroting vermogen&gt; 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo). </li></ol>

fluorescentie-gebaseerde waardering van store-bediende calcium entry in levende cellen: van cultured cancer cell op skeletal muscle fiber

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store bediend Ca 2 + entry (SOCE), eerder aangeduid als capacitieve Ca 2 + ingang, is een strak gereguleerd mechanisme voor instroom van extracellulaire Ca 2 + in de cellen aan verarmd endoplasmatisch reticulum (ER) of sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2 +-winkels te vullen 1,2. Sinds Ca 2 + is een alomtegenwoordige tweede boodschapper, is het niet verwonderlijk om te zien dat SOCE speelt een belangrijke rol in verschillende cellulaire processen, met inbegrip van proliferatie, apoptose, gentranscriptie en beweeglijkheid. Door zijn brede aanwezigheid in bijna alle typen cellen, waaronder epitheelcellen en skeletspieren, heeft deze route ontvangen grote belangstelling 3,4. Echter, de heterogeniteit van SOCE kenmerken verschillende celtypes en de fysiologische functie nog niet duidelijk 5-7. De functionele eigenschappen van SOCE kanaal kan worden onthuld door de patch-clamp studies, terwijl een grote hoeveelheid kennis over this pad is opgedaan door middel van fluorescentie-based intracellulaire Ca 2 + metingen vanwege het gemak en de haalbaarheid van high-throughput screening. Het doel van dit rapport is om een paar fluorescentie gebaseerde methoden samen te vatten aan de activering van SOCE in monolaag cellen, geschorst cellen en spiervezels 5,8-10 te meten. De meest gebruikte deze fluorescentie methoden rechtstreeks controleren de dynamiek van intracellulair Ca2 + met de verhouding van F 340 Nm en F 380 nm (510 nm voor emissie golflengte) van de ratiometrische Ca2 + indicator Fura-2. Om de activiteit van unidirectionele SOCE isoleren van intracellulair Ca2 + en afgifte Ca 2 + extrusie wordt een Mn 2 + quenching gebruikte assay. Mn2 + bekend kunnen doordringen in de cellen via SOCE terwijl het ondoordringbaar het oppervlak membraan extrusie of ER opname door Ca2 + pompen vanwege de zeer hoge affiniteit with Fura-2. Hierdoor de quenching van fluorescentie Fura-2 geïnduceerd door de vermelding van extracellulaire Mn2 + in de cellen is een meting van de activiteit van SOCE 9. Ratiometrisch meting en de Mn +2 quenching assays worden uitgevoerd op een cuvet gebaseerde spectrofluorometer een celpopulatie, of in een microscoop-gebaseerd systeem om afzonderlijke cellen te visualiseren. Het voordeel van single cell metingen is dat individuele cellen blootgesteld aan gen-manipulaties kunnen worden geselecteerd met behulp van GFP of RFP verslaggevers, waardoor studies in genetisch gemodificeerde of gemuteerde cellen. De eigenschappen van spatiotemporele SOCE in structureel gespecialiseerde skeletspier kan op huid spiervezels door gelijktijdig controle van de fluorescentie van twee lage affiniteit Ca2 + indicatoren afgestemd op de compartimenten van het spierweefsel, zoals Fluo-5N in SR en Rhod- 5N in de dwars-tubuli 9,11,12.

De omvang van de winkel bediende Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Entry (SOCE) kan worden gecontroleerd met behulp van fluorescerende Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicatoren. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Quenching van dergelijke indicatoren testen SOCE in gekweekte cellen en skeletspieren vezels. Een techniek waarmee ruimtelijke en temporele resolutie van SOCE door confocale beelden van mechanisch gevild spiervezels wordt ook beschreven.

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store-operated Ca2+-instroom (SOCE), voorheen aangeduid als capacitatieve Ca2+-instroom, is een strak gereguleerd mechanisme voor de influx van extracellulair Ca2+ in cellen om ...

Deze experimentele methode wordt gebruikt om de eigenschappen van store operated calcium entry of SOCE in kankercellen en skeletspiercellen te onthullen met behulp van fluorescentiegebaseerde methoden. Dit wordt bereikt door de fluorescentie van URA two in levende cellen vast te leggen, welke gevoelig is voor de intracellulaire calciumconcentratie. Daarnaast wordt de snelheid van fluorescentiedooving door toevoeging van mangaan bij een golflengte die ongevoelig is voor de calciumconcentratie gemeten, wat direct de activatie van SOCE weerspiegelt om SOCE te bestuderen.In structureel gespecialiseerde skeletspiercellen worden spieren gedissekeerd en ontdaan van hun membraan (skinned). Spiervezels worden geprepareerd. De vezels worden vervolgens behandeld met calciumindicatoren met een lage affiniteit en hun interne fluorescentie wordt gemonitord.Deze methoden tonen aan dat SOCE voorkomt in zowel niet-exciteerbare cellen als in skeletspieren, met een gegradeerde activatie en een nauwe koppeling aan de inhoud van de intracellulaire calciumvoorraad. Het belangrijkste voordeel van deze op fluoresceïne gebaseerde techniek ten opzichte van andere methoden, zoals elektrofysiologie en de patch-clamp methode, is dat deze gebruiksvriendelijk is en kan worden toegepast voor onderzoek naar celpopulaties of high-throughput screening. Het is belangrijk om de juiste reagentia te gebruiken voor de ratiometrische omgeving en de magnesium-concentratie assay.Daarom is de kalibratie van elk individueel instrument cruciaal, aangezien elk instrument verschilt. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat het proces van het mechanisch onthoeden van individuele spiervezels moeilijk te leren is; het vereist specifieke praktijktraining, een diepgaand begrip en het aanleren van microdissectietechnieken, zorgvuldige observatie en een flinke dosis geduld. Kalibreer vóór aanvang de microscoopopstelling voor de meting van URA two fluorescentie. Hoewel de excitatiegolflengten voor calciumbinding en calcium three URA two 340 en 380 nanometer zijn, kan het beste ratio-dynamische bereik van URA two voor calciummeting bij andere golflengten liggen in een specifiek microscoopsysteem.Dergelijke verschuivingen in golflengten worden veroorzaakt door veranderingen in het optische pad door de toevoeging van diverse optische componenten. Op dezelfde wijze varieert het ISO-spasticum punt voor elk systeem. Daarom is het belangrijk om deze golflengten via spectrumscanning te bepalen.Als alternatief kan Ming-screening worden geregistreerd met behulp van fluorescentie bij twee willekeurige golflengten, zodanig dat de uiteindelijke waarde onafhankelijk is van de calciumconcentratie. Begin met het transfecteren van gekweekte K Ys SE one 50-cellen met plasmiden die RFP tot expressie brengen en een shRNA bevatten dat specifiek is tegen I one of een gescrambelde sequentie voor 48 uur. Kweek de getransfecteerde cellen op schaaljes met een glazen bodem.Verwijder vervolgens het medium en spoel de cellen met een gebalanceerde zoutoplossing of BSS. Voeg na het spoelen één milliliter BSS toe met twee micromolaire RA 2:00 AM en houd de schaal 40 minuten op 37 °C. Laat de cellen 15 minuten op kamertemperatuur komen om de intracellulaire URA 2:00 AM-vorm te laten converteren naar URA twee.Was daarna de plaat tweemaal met BSS onder de microscoop. Selecteer in de visualisatiemodus cellen die RFP tot expressie brengen. Selecteer de excitatieverhoudingsmodus met de emissiegolflengte ingesteld op 510 nanometers en de excitatiegolflengten op 350 en 390 nanometers.De ratio wordt in het derde venster weergegeven. Neem vervolgens de metingen op. De fluorescentie van de geselecteerde cellen wordt bij de vooraf bepaalde golflengten geregistreerd terwijl de cellen worden geperfuseerd met vier verschillende oplossingen.Op dezelfde wijze worden KYSE one 50-cellen geladen met ferra two en onderworpen aan registratie. In de excitatieverhoudingsmodus wordt, in tegenstelling tot de vorige procedure, het ISO spastic point 360 nanometers gekozen als excitatiegolflengte. Vervolgens wordt de fluorescentie bij 360 en 390 nanometers gelijktijdig geregistreerd terwijl de cellen worden geperfuseerd met vijf verschillende BSS-oplossingen.Voor dit protocol moeten C2C12-cellen, een myogene muiscellijn, tot confluentie worden gekweekt op schaaltjes met een glazen bodem, om vervolgens te worden gedifferentieerd tot myotubes in differentiatiemedium dat 2,5% paardenserum bevat. Belaad de C2C12-myotubes met een eindconcentratie van 5 µM RA 2:00 AM in BSS-oplossing en incubeer deze gedurende 40 minuten. Voeg vervolgens een eindconcentratie van 20 µM benzo-p-tolueensulfonamide (BTS) toe om spiercontracties en de daarmee gepaard gaande bewegingsartefacten te remmen.Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en houd ze in alle oplossingen in BTS. Laad vervolgens vier volumes gebalanceerde zoutoplossingen in het perfusiesysteem.Zoals eerder beschreven. Registreer tijdens elke perfusie de fluorescentie van geselecteerde cellen bij 360 en 390 nanometer. In deze reeks worden magnesium en thapsigargine samen toegevoegd om de quenching door magnesiumionen te monitoren.Terwijl de calciumvoorraden van het endoplasmatisch reticulum worden uitgeput. Om de musculus extensor digitorum longus of EDL-spier te dissekeren, positioneert u het been van een geëuthanaseerde muis lateraal en verwijdert u de huid van het enkelgebied tot aan de knie. Snijd de oppervlakkige spierlagen van het weefsel door om de EDL bloot te leggen en doorsnij zowel de bovenste als de onderste pezen om de intacte EDL-spier vrij te maken.Het is belangrijk om de pezen zo lang mogelijk te houden. Om contracties te voorkomen, wordt de EDL nu onder een stereomicroscoop overgeplaatst naar een T-road-oplossing die 0,1 millimolair EGTA bevat en geen calcium. Druk de pezen van de knie-insertie in twee helften en splits de EDL-spier in twee bundels.Herhaal dit proces tot er acht bundels zijn verkregen. Als er pezen verloren gaan uit een bundel, dient deze bundel te worden weggegooid. Pak vervolgens beide pezen van een EDL-bundelstrip vast en rek de strip voorzichtig uit tot er drie of vier gescheiden individuele spiervezels intact overblijven met peesweefsel aan beide zijden.Plaats een druppel calciumvrije tyro-buffer in een schaaltje met glazen bodem. Leg de EDL-strips recht op het schaaltje en verwijder snel zoveel mogelijk van de oplossing. Plak vervolgens beide pezen stevig vast met waterbestendige plakband.Was de vezel eerst met de calciumvrije oplossing en daarna twee keer met een 2,5 millimolaire calciumoplossing. Als de vezel hypercontracteert en er schade wordt opgemerkt, dient de vezel te worden weggegooid; was de geselecteerde gezonde spiervezels drie keer met wasoplossing nummer één en laat ze vervolgens vijf minuten weken in een gemodificeerde intracellulaire skinning-oplossing. Gebruik een wolfraamnaald bevestigd aan een pincethouder om de vezel mechanisch te skinnen onder een stereomicroscoop; de vezels zullen opnieuw sluiten en rhodamine 5N geconjugeerd met calcium in de transversale tubuli inkapselen.Het verkrijgen van gezonde, intacte enkele spiervezels, of althans bundels van dit type vezels waar nog een deel van de pees aan vastzit, is naar mijn mening een van de meest uitdagende stappen, gevolgd door de altijd zeer moeilijke overdracht van deze vezels naar de uiteindelijke experimentele kamer. Tijdens dit proces kunnen vezels hypercontracteren of zelfs breken. Wanneer u gezonde vezels heeft, zal de mechanische skinning zelf veel eenvoudiger zijn om de SR te laden. Incubeer de vezels in de skinning-oplossing met 20 µM flow five N am.Volg de incubatie met uitgebreide wasbeurten met wasoplossing nummer twee en een aanvullende incubatie van 30 minuten om volledige de-esterificatie van de kleurstof mogelijk te maken. De vezels kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop met een 60 x objectief vanuit de regio's van belang. Registreer gelijktijdig de fluorescentie van elke kleurstof terwijl de vezel wordt geperfuseerd met SR-laad- en SR-depletie-oplossingen.De SOCE-activiteit in KYS, SE one 50-cellen werd onderzocht met behulp van intracellulaire calciummeting. De cellen werden gecotransfecteerd met RFP en een short hairpin RNA tegen het OR I one-gen, dat codeert voor het A-S-O-C-E-kanaal, vergeleken met controles gerepresenteerd door de zwarte lijn. Het knock-downen van de OR I one-expressie resulteerde in een verminderde SOCE-activiteit. SOCE in KYC one 50-cellen werd daarnaast bevestigd met de mangaan-quenching assay. Nadat TG de calciumvoorraden in het ER volledig had uitgeput, leidde de perfusie van mangaan tot een significante afname van de fluorescentie.De steilere helling van het signaalverlies bij URA twee duidt op een actievere SOCE. Bijgevolg geeft de langzame afname van de fluorescentie in cellen behandeld met twee A PB aan dat de SOCE-activiteit door deze verbinding werd geblokkeerd. De mangaan-quenching-snelheden werden bepaald op basis van de eerste 10 seconden, waarin de quenching nog in het lineaire bereik was zonder verzadiging; een vergelijkbare mangaan-quenching-assay werd uitgevoerd in gekweekte spiercellen.In dit geval werd mangaan samen met tg toegepast. Terwijl TG de calciumvoorraden in het SR uitputte, veranderde de helling van de fluorescentie-quenching geleidelijk totdat deze de maximale snelheid bereikte. De sigmoïdale curve duidde op de graduele activatie van SOCE onder deze experimentele omstandigheden.Bij confocale beeldvorming vertoonde de trapping van rhodaanine 5 en dye in het TT-compartiment van de geskinde vezel het kenmerkende zoogdier-doubletpatroon, zoals te zien is in het rode kanaal. Na het laden van het SR met fluoresceïne 5 NM was het typische gepuncteerde SR-patroon zichtbaar in het groene kanaal na perfusie van de geskinde vezel met TTSR-laadoplossing. De fluorescentie-intensiteit van zowel rhodaanine 5 N als fluoresceïne 5 n nam toe na perfusie met SR-depletie-oplossing, waarna de fluorescentieniveaus in het SR-compartiment en het TT-compartiment begonnen af te nemen. Dit gaf aan dat er sprake was van koppeling tussen depletie van de SR-calciumvoorraad en SOCE-activatie.Na het bekijken van deze video zou u een uitstekend inzicht hebben in hoe u eerst levensvatbare, gezonde en intacte spiervezels verkrijgt. Deze moeten voldoende pees aan hun uiteinden hebben om een effectief dissectieproces mogelijk te maken, wat de experimentator uiteindelijk in staat stelt om een fysiologisch relevante preparatie te verkrijgen met een enorm voordeel. Vergeet niet dat alle fluorescente kleurstoffen die in deze studie worden gebruikt doorgaans lichtgevoelig zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het laden in een donkere schaal en het wassen in een donkere kamer, moeten daarom altijd worden toegepast tijdens het uitvoeren van deze procedure.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele uren worden uitgevoerd. We raden aan om eerst meerdere intacte vezels te verkrijgen om een hoger slagingspercentage bij de mechanische dissectiestappen te garanderen, en ook indien u deze vezels na de procedure gedurende de nacht wilt cultiveren. Deze techniek heeft onderzoekers op het gebied van calciumsignalering de weg vrijgemaakt om de rol van store-operated calcium entry bij de groei en sterfte van kankercellen te onderzoeken.De fysiologische en pathologische functie in spieren.

fluorescence-based-measurement-store-operated-calcium-entry-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij presenteren een methode om snel (microseconde) calcium gebeurtenissen isoleren van trager stromen in levende cellen met behulp van laser scanning confocale microscopie. De methode meet fluorescentie-intensiteit schommelingen van calcium indicatoren door het opnemen van lijn scans van enkele honderden pixels in een cel. Histogram-analyse laat ons toe om te isoleren van de tijdschalen van de verschillende calcium fluxen.

Het meten van Fast Calcium stromen in cardiomyocyten

Source: Heredia, D. J., et. al. Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates fluorescence imaging of calcium dynamics at neuromuscular junctions (NMJs) in a transgenic mouse expressing genetically encoded calcium indicators. A NJM is identified by fluorescently tagged acetylcholine receptors in the diaphragm with the phrenic nerve. An image splitter is used to visualize multiple signals...

Fluorescence Imaging of Calcium Dynamics at Neuromuscular Junctions in the Diaphragm of a Transgenic Mouse

Hier beschreven is een methode om direct te meten calcium vonken, de elementaire eenheden van Ca2 + vrij van sarcoplasmatisch reticulum in intacte spiervezels. Deze methode maakt gebruik van osmotische stress-gemedieerde activering van Ca 2 + vrijlating uit ryanodinereceptor in geïsoleerde spiervezels. De dynamiek en homeostatische aantal intracellulaire Ca2 +-signalen kunnen worden gebruikt om spierfunctie in gezondheid en ziekte te beoordelen.

Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Hier beschrijven we een methodologie om een ​​pure bevolking van menselijke myoblasten te verkrijgen uit volwassen spierweefsel. Deze cellen worden gebruikt om in vitro skeletspierdifferentiatie te bestuderen en in het bijzonder om eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering te bestuderen.

Isolatie van Menselijke Myoblasten, Beoordeling van Myogene Differentiatie, en Opslag Met Calcium Ingangsmeting

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Het huidige artikel beschrijft het uitvoeren van een intravitale beeldvormingsbenadering om mechanisch geïnduceerde calciumsignalering van ingebedde osteocyten in vivo in realtime te observeren als reactie op mechanische belasting op weefselniveau van het derde middenvoetsbeentje van de muis.

Een fluorescerende intravitale beeldvormingsbenadering om door belasting geïnduceerde calciumsignaleringsdynamiek in osteocyten van muizen te bestuderen

Functionele site-directed fluorometrie is een methode om eiwitdomeinbewegingen in realtime te bestuderen. Modificatie van deze techniek voor de toepassing ervan in native cellen maakt nu de detectie en tracking mogelijk van bewegingen van enkele spanningssensor van spanningsafhankelijke Ca2 + -kanalen in murine geïsoleerde skeletspiervezels.

Functionele site-directed fluorometrie in inheemse cellen om de prikkelbaarheid van skeletspieren te bestuderen

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Leer hoe je store-operated calcium entry (SOCE) evalueert in kankercellen en skeletspiervezels met fluorescentiebeeldvorming. Deze methode biedt hoge resolutie voor calciumdynamica-onderzoek.

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber (Video) | JoVE Journal

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Meer video's verkennen