Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Deze experimentele methode wordt gebruikt om de eigenschappen van store operated calcium entry of SOCE in kankercellen en skeletspiercellen te onthullen met behulp van fluorescentiegebaseerde methoden. Dit wordt bereikt door de fluorescentie van URA two in levende cellen vast te leggen, welke gevoelig is voor de intracellulaire calciumconcentratie. Daarnaast wordt de snelheid van fluorescentiedooving door toevoeging van mangaan bij een golflengte die ongevoelig is voor de calciumconcentratie gemeten, wat direct de activatie van SOCE weerspiegelt om SOCE te bestuderen.

In structureel gespecialiseerde skeletspiercellen worden spieren gedissekeerd en ontdaan van hun membraan (skinned). Spiervezels worden geprepareerd. De vezels worden vervolgens behandeld met calciumindicatoren met een lage affiniteit en hun interne fluorescentie wordt gemonitord.

Deze methoden tonen aan dat SOCE voorkomt in zowel niet-exciteerbare cellen als in skeletspieren, met een gegradeerde activatie en een nauwe koppeling aan de inhoud van de intracellulaire calciumvoorraad. Het belangrijkste voordeel van deze op fluoresceïne gebaseerde techniek ten opzichte van andere methoden, zoals elektrofysiologie en de patch-clamp methode, is dat deze gebruiksvriendelijk is en kan worden toegepast voor onderzoek naar celpopulaties of high-throughput screening. Het is belangrijk om de juiste reagentia te gebruiken voor de ratiometrische omgeving en de magnesium-concentratie assay.

Daarom is de kalibratie van elk individueel instrument cruciaal, aangezien elk instrument verschilt. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat het proces van het mechanisch onthoeden van individuele spiervezels moeilijk te leren is; het vereist specifieke praktijktraining, een diepgaand begrip en het aanleren van microdissectietechnieken, zorgvuldige observatie en een flinke dosis geduld. Kalibreer vóór aanvang de microscoopopstelling voor de meting van URA two fluorescentie. Hoewel de excitatiegolflengten voor calciumbinding en calcium three URA two 340 en 380 nanometer zijn, kan het beste ratio-dynamische bereik van URA two voor calciummeting bij andere golflengten liggen in een specifiek microscoopsysteem.

Dergelijke verschuivingen in golflengten worden veroorzaakt door veranderingen in het optische pad door de toevoeging van diverse optische componenten. Op dezelfde wijze varieert het ISO-spasticum punt voor elk systeem. Daarom is het belangrijk om deze golflengten via spectrumscanning te bepalen.

Als alternatief kan Ming-screening worden geregistreerd met behulp van fluorescentie bij twee willekeurige golflengten, zodanig dat de uiteindelijke waarde onafhankelijk is van de calciumconcentratie. Begin met het transfecteren van gekweekte K Ys SE one 50-cellen met plasmiden die RFP tot expressie brengen en een shRNA bevatten dat specifiek is tegen I one of een gescrambelde sequentie voor 48 uur. Kweek de getransfecteerde cellen op schaaljes met een glazen bodem.

Verwijder vervolgens het medium en spoel de cellen met een gebalanceerde zoutoplossing of BSS. Voeg na het spoelen één milliliter BSS toe met twee micromolaire RA 2:00 AM en houd de schaal 40 minuten op 37 °C. Laat de cellen 15 minuten op kamertemperatuur komen om de intracellulaire URA 2:00 AM-vorm te laten converteren naar URA twee.

Was daarna de plaat tweemaal met BSS onder de microscoop. Selecteer in de visualisatiemodus cellen die RFP tot expressie brengen. Selecteer de excitatieverhoudingsmodus met de emissiegolflengte ingesteld op 510 nanometers en de excitatiegolflengten op 350 en 390 nanometers.

De ratio wordt in het derde venster weergegeven. Neem vervolgens de metingen op. De fluorescentie van de geselecteerde cellen wordt bij de vooraf bepaalde golflengten geregistreerd terwijl de cellen worden geperfuseerd met vier verschillende oplossingen.

Op dezelfde wijze worden KYSE one 50-cellen geladen met ferra two en onderworpen aan registratie. In de excitatieverhoudingsmodus wordt, in tegenstelling tot de vorige procedure, het ISO spastic point 360 nanometers gekozen als excitatiegolflengte. Vervolgens wordt de fluorescentie bij 360 en 390 nanometers gelijktijdig geregistreerd terwijl de cellen worden geperfuseerd met vijf verschillende BSS-oplossingen.

Voor dit protocol moeten C2C12-cellen, een myogene muiscellijn, tot confluentie worden gekweekt op schaaltjes met een glazen bodem, om vervolgens te worden gedifferentieerd tot myotubes in differentiatiemedium dat 2,5% paardenserum bevat. Belaad de C2C12-myotubes met een eindconcentratie van 5 µM RA 2:00 AM in BSS-oplossing en incubeer deze gedurende 40 minuten. Voeg vervolgens een eindconcentratie van 20 µM benzo-p-tolueensulfonamide (BTS) toe om spiercontracties en de daarmee gepaard gaande bewegingsartefacten te remmen.

Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en houd ze in alle oplossingen in BTS. Laad vervolgens vier volumes gebalanceerde zoutoplossingen in het perfusiesysteem.

Zoals eerder beschreven. Registreer tijdens elke perfusie de fluorescentie van geselecteerde cellen bij 360 en 390 nanometer. In deze reeks worden magnesium en thapsigargine samen toegevoegd om de quenching door magnesiumionen te monitoren.

Terwijl de calciumvoorraden van het endoplasmatisch reticulum worden uitgeput. Om de musculus extensor digitorum longus of EDL-spier te dissekeren, positioneert u het been van een geëuthanaseerde muis lateraal en verwijdert u de huid van het enkelgebied tot aan de knie. Snijd de oppervlakkige spierlagen van het weefsel door om de EDL bloot te leggen en doorsnij zowel de bovenste als de onderste pezen om de intacte EDL-spier vrij te maken.

Het is belangrijk om de pezen zo lang mogelijk te houden. Om contracties te voorkomen, wordt de EDL nu onder een stereomicroscoop overgeplaatst naar een T-road-oplossing die 0,1 millimolair EGTA bevat en geen calcium. Druk de pezen van de knie-insertie in twee helften en splits de EDL-spier in twee bundels.

Herhaal dit proces tot er acht bundels zijn verkregen. Als er pezen verloren gaan uit een bundel, dient deze bundel te worden weggegooid. Pak vervolgens beide pezen van een EDL-bundelstrip vast en rek de strip voorzichtig uit tot er drie of vier gescheiden individuele spiervezels intact overblijven met peesweefsel aan beide zijden.

Plaats een druppel calciumvrije tyro-buffer in een schaaltje met glazen bodem. Leg de EDL-strips recht op het schaaltje en verwijder snel zoveel mogelijk van de oplossing. Plak vervolgens beide pezen stevig vast met waterbestendige plakband.

Was de vezel eerst met de calciumvrije oplossing en daarna twee keer met een 2,5 millimolaire calciumoplossing. Als de vezel hypercontracteert en er schade wordt opgemerkt, dient de vezel te worden weggegooid; was de geselecteerde gezonde spiervezels drie keer met wasoplossing nummer één en laat ze vervolgens vijf minuten weken in een gemodificeerde intracellulaire skinning-oplossing. Gebruik een wolfraamnaald bevestigd aan een pincethouder om de vezel mechanisch te skinnen onder een stereomicroscoop; de vezels zullen opnieuw sluiten en rhodamine 5N geconjugeerd met calcium in de transversale tubuli inkapselen.

Het verkrijgen van gezonde, intacte enkele spiervezels, of althans bundels van dit type vezels waar nog een deel van de pees aan vastzit, is naar mijn mening een van de meest uitdagende stappen, gevolgd door de altijd zeer moeilijke overdracht van deze vezels naar de uiteindelijke experimentele kamer. Tijdens dit proces kunnen vezels hypercontracteren of zelfs breken. Wanneer u gezonde vezels heeft, zal de mechanische skinning zelf veel eenvoudiger zijn om de SR te laden. Incubeer de vezels in de skinning-oplossing met 20 µM flow five N am.

Volg de incubatie met uitgebreide wasbeurten met wasoplossing nummer twee en een aanvullende incubatie van 30 minuten om volledige de-esterificatie van de kleurstof mogelijk te maken. De vezels kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop met een 60 x objectief vanuit de regio's van belang. Registreer gelijktijdig de fluorescentie van elke kleurstof terwijl de vezel wordt geperfuseerd met SR-laad- en SR-depletie-oplossingen.

De SOCE-activiteit in KYS, SE one 50-cellen werd onderzocht met behulp van intracellulaire calciummeting. De cellen werden gecotransfecteerd met RFP en een short hairpin RNA tegen het OR I one-gen, dat codeert voor het A-S-O-C-E-kanaal, vergeleken met controles gerepresenteerd door de zwarte lijn. Het knock-downen van de OR I one-expressie resulteerde in een verminderde SOCE-activiteit. SOCE in KYC one 50-cellen werd daarnaast bevestigd met de mangaan-quenching assay. Nadat TG de calciumvoorraden in het ER volledig had uitgeput, leidde de perfusie van mangaan tot een significante afname van de fluorescentie.

De steilere helling van het signaalverlies bij URA twee duidt op een actievere SOCE. Bijgevolg geeft de langzame afname van de fluorescentie in cellen behandeld met twee A PB aan dat de SOCE-activiteit door deze verbinding werd geblokkeerd. De mangaan-quenching-snelheden werden bepaald op basis van de eerste 10 seconden, waarin de quenching nog in het lineaire bereik was zonder verzadiging; een vergelijkbare mangaan-quenching-assay werd uitgevoerd in gekweekte spiercellen.

In dit geval werd mangaan samen met tg toegepast. Terwijl TG de calciumvoorraden in het SR uitputte, veranderde de helling van de fluorescentie-quenching geleidelijk totdat deze de maximale snelheid bereikte. De sigmoïdale curve duidde op de graduele activatie van SOCE onder deze experimentele omstandigheden.

Bij confocale beeldvorming vertoonde de trapping van rhodaanine 5 en dye in het TT-compartiment van de geskinde vezel het kenmerkende zoogdier-doubletpatroon, zoals te zien is in het rode kanaal. Na het laden van het SR met fluoresceïne 5 NM was het typische gepuncteerde SR-patroon zichtbaar in het groene kanaal na perfusie van de geskinde vezel met TTSR-laadoplossing. De fluorescentie-intensiteit van zowel rhodaanine 5 N als fluoresceïne 5 n nam toe na perfusie met SR-depletie-oplossing, waarna de fluorescentieniveaus in het SR-compartiment en het TT-compartiment begonnen af te nemen. Dit gaf aan dat er sprake was van koppeling tussen depletie van de SR-calciumvoorraad en SOCE-activatie.

Na het bekijken van deze video zou u een uitstekend inzicht hebben in hoe u eerst levensvatbare, gezonde en intacte spiervezels verkrijgt. Deze moeten voldoende pees aan hun uiteinden hebben om een effectief dissectieproces mogelijk te maken, wat de experimentator uiteindelijk in staat stelt om een fysiologisch relevante preparatie te verkrijgen met een enorm voordeel. Vergeet niet dat alle fluorescente kleurstoffen die in deze studie worden gebruikt doorgaans lichtgevoelig zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het laden in een donkere schaal en het wassen in een donkere kamer, moeten daarom altijd worden toegepast tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele uren worden uitgevoerd. We raden aan om eerst meerdere intacte vezels te verkrijgen om een hoger slagingspercentage bij de mechanische dissectiestappen te garanderen, en ook indien u deze vezels na de procedure gedurende de nacht wilt cultiveren. Deze techniek heeft onderzoekers op het gebied van calciumsignalering de weg vrijgemaakt om de rol van store-operated calcium entry bij de groei en sterfte van kankercellen te onderzoeken.

De fysiologische en pathologische functie in spieren.