Name: Opschaling van zoogdiercelculturen met behulp van een nieuw Meerlaagse Flask (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer hoe je homogene zoogdiercellen opschaalt met meerlaagse BD Falcon Multi flasks voor biotechnologisch onderzoek. Deze methode levert drie tot vijf keer meer cellen op dan traditionele T175 flasks.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Protocol bij Multi-Kolven gebruiken voor celcultuur <ol><li> De voorbereiding van de schepen en het toevoegen celsuspensie <ol><li> Bereid de celgroei medium als dat nodig is. </li><li> Line up Multi-Fles verticaal op zijn kant met de dop naar boven op het werkvlak (steriel laminaire flow afzuigkap). <ol><li> Deze kolven zijn verkrijgbaar in 3 en 5-layer-formaten en het gebruik van een soortgelijk werk-flow patroon als een T-175 kolf. </li></ol></li><li> Los en verwijder caps. Voeg benodigde hoeveelheid voorverwarmd medium in erlenmeyer met behulp van een 50 of 100 mL pipet of door gieten. <ol><li> Pipetten die ≤ 10 ml kan de bodem van het vat te bereiken wanneer Multi-Kolven worden verticaal geplaatst met dop naar boven. Pipetten ≥ 10 ml direct bereiken in het vat verleden het logo op de Multi-Flask, en bieden zodoende een handig portaal naar grotere volumes van de media van de schepen toe te voegen. </li></ol></li><li> Om te voorkomen dat borrelen van medium, laat vloeistofstroom naar flow langs de binnenwand van de Multi-Flask deksel (logo-side). </li><li> Voeg celsuspensie van een geconcentreerde cel bouillon in groeimedium door de bovenste laag met behulp van een pipet van 10 ml en pet flessen. Tips: - Vervoer Multi-vaten aan een wagen om incubator site en uit te voeren stappen. - De cel zaaien dichtheid zal variëren afhankelijk van het celtype, medium en cultuur duur nodig hebben. Begin met het zaaien dichtheid en de media het volume dat wordt gebruikt in standaard T-175 flessen en vermenigvuldig dat met 3 of 5, afhankelijk van de Multi-Flask formaat gebruikt. </li></ol></li><li> Het mengen van cellen <ol><li> Mix positie: Houd de Multi-Flask met het logo naar u toe en draai tegen de klok in een hoek van 45 ° met een mix poort naar u toe. </li><li> Houden onder dezelfde hoek, zacht Multi-Flask kantelen van voor naar (de hals van je af) terug tot vloeistof in de bovenste laag riool volledig downwards door de mix heen-poort. Pivot op vermengen bakboord. </li><li> Ook schud Multi-Flask van achter naar voren (de hals naar u toe) tot medium riolering volledig van de onderste laag naar boven door de mix heen-poort. Herhaal de stappen 1.2.2 en 1.2.3 een meer tijd om een ​​goede menging te garanderen. </li><li> Breng Multi-Flask terug te mengen positie (stap 1.2.1) en ga verder met stap 1.3 </li><li> Als alternatief kan celsuspensie extern worden bereid uit de Multi-kolf en celsuspensie kan worden toegevoegd aan het schip met behulp van een pipet of door zachtjes te gieten. <ol><li> Mix poort maakt het mogelijk in-vat mengen van cellen met de media en elimineert de noodzaak om extern te maken van grote hoeveelheden celsuspensies. </li><li> Het maakt het ook mogelijk media-egalisatie over de lagen van de Multi-Flask </li></ol></li></ol></li><li> Evenwicht van vocht <ol><li> Na het mengen / toevoegen van de celsuspensie, te plaatsen Multi-Fles verticaal op een vlakke werkoppervlak gelijk vloeistofvolume vergelijkingenlly in alle lagen. </li></ol></li><li> Partitie vloeistof in elke laag <ol><li> Houd de Multi-Flask met het logo naar u toe en draai met de klok mee naar een hoek van 45 ° tot afscherming van de vloeistof in elk van de lagen. Tip: - Voor de beste resultaten, is het belangrijk om een plat werkoppervlak te gebruiken voor Steps 1.3-1.4 </li></ol></li><li> Transport <ol><li> Zodra media met celsuspensie is gepartitioneerd, transport Multi-Flask in dezelfde hoek van 45 ° (met de klok mee), zoals in stap 1.4.1 met media uit de buurt van de mix-poort in de incubator. Deze positie is ook geschikt bij het verwijderen van kolven van de incubator voor weergave op een microscoop. </li></ol></li><li> Het plaatsen van Multi-Flask op incubator shelf <ol><li> Holding Multi-Flask op de hoek van 45 ° (met de klok mee, weg van de mix-poort), voorzichtig draai het naar beneden horizontaal op de incubator oppervlak (met behulp van de hoek uit de buurt van de mix-poort als eenpivot). Lay Multi-fles met logo naar boven. <ol><li> Falcon Multi-Flask ontwerp maakt het mogelijk schepen te stapelen en houdt ze op zijn plaats door een stevige stapelen rib. </li></ol></li></ol></li><li> Distributie van cellen en reagentia <ol><li> Na het plaatsen van Multi-Flask plat op het werkvlak, zachtjes heen en weer en side-naar rechts gelijkmatig te verdelen cellen op cultuur oppervlakken zorg dat u geen vloeistoffen gemorst van elke laag. Stack kolven. <ol><li> Deze fles is gemaakt van optisch helder materiaal en cellen op de laatste laag kan gemakkelijk worden bekeken op een microscoop. </li></ol></li></ol></li><li> Media-uitwisseling <ol><li> Zuigen, terwijl het kantelen van de Multi-Flask naar links (mix port-zijde) met het logo naar u toe. </li><li> Vervolgens tilt, de Multi-Flask naar rechts, blijven alle overblijvende media aspireren. </li><li> Voeg juiste hoeveelheid media en volg de stappen 1.3-1.7 </li></ol></li></ol> 2.Oogsten cellen van Multi-Kolven <ol><li> Aan cellen, line-up Multi-Kolven verticaal dissociëren en brengen elk een stand (stap 1.2.1) Mix. Voorzichtig omdraaien kolven met de hals naar je toe zodat de media drain naar de bovenste laag van de Multi-Flask. </li><li> Steek een 5 of 10 ml opzuigen tip via de nek tot je vloeistof niveau in de buurt van de mix-poort. Aspiratie uitgeput medium. </li><li> Voeg dissociatie reagens / wasbuffer en breng aan de positie Mix zoals in stap 1.2.1, ga dan verder en volg de stappen 1.3-1.7. Neutraliseren met groeimedium / neutraliserend agent en giet celsuspensie in een ontvangende buis of omkeren fles zodanig dat cellen drain naar de bovenste laag van het vat en het verzamelen van cellen met behulp van een pipet van 10 ml. Tip: Om herstel van cellen of reagentia te verbeteren, brengen Multi-kolf met positie (stap 1.2.1) mix, omkeren met nek naar de gebruiker om volledige afvoer van materiaal uit al laten<html> l lagen om de bovenste laag. Dan tilt Multi-Flask de klok mee om hoek van 45 ° (weg van de mix-poort), terwijl de Multi-Flask blijft omgekeerd. Gebruik een pipet (1-10 ml) om de resterende reagentia te verzamelen. </li></ol> 3. Aanbevolen werkvolume in Falcon Multi-Kolven Groeimedia 3-laag: 75 tot 150 ml per Multi-Flask 5-laag: 125 tot 250 ml per Multi-Flask Dissociatie-agent 3-Layer: ≥ 15 ml per Multi-Flask 5-Layer: ≥ 25 ml per Multi-Flask Tip: Begin met een gemiddelde volume gebruikt in de standaard T-175 flessen en vermenigvuldig dat met 3 of 5 keer, afhankelijk van de Multi-Flask format geëvalueerd, zodat ml per oppervlakte-eenheid blijft hetzelfde. 4. Representatieve resultaten: 1. Ontwerp van Falcon Multi-Flask files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg &quot;/&gt; . Figuur 1: Multi-Flask Cultuur van de Cel schepen zijn verkrijgbaar in een 3 - en 5-laags stapelbaar formaat voor schaal-up van cellen leveren 525 en 875 cm 2 groei van oppervlakte, respectievelijk. Pipetteer toegang vergemakkelijkt toevoeging en verwijdering van cellen en reagentia in-en uit het vat. Aanwezigheid van mix-poort zorgt voor een snelle in-vat mengen en egalisatie van de media in alle lagen van de Multi-Flask. 2. Celopbrengst met behulp van Multi-Flask: Deze schepen zijn beschikbaar in 3-laags en 5-layer-formaten die overeenkomen met 3 en 5 maal de oppervlakte van de T-175 flessen. Dienovereenkomstig, ≥ 3 en 5 maal (130 ± 6,8 x 10 6 en 218 ± 23,6 x 10 6 cellen, respectievelijk) het aantal BHK-21 (baby hamster nier) cellen werden gekweekt en hersteld van Multi-Flask in vergelijking met T-175 kolven (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellen, fig. 2a). Celopbrengst per unit oppervlakte was gelijk in 3 - en 5-layer Multi-Kolven en T-175 flessen voor de BHK-21, LNCaP (menselijke prostaat adenocarcinoma cellijn), Hep-G2 (menselijke levercarcinoom cellijn), EcoPack 2-293 (menselijke nier cellijn) gekweekt voor een periode van 48-96h (Fig.2B) in groeimedia (35 ml per laag), zoals aanbevolen door cel verkoper (ATCC, Sigma en / of Clontech). Cellen werden opgesomd op een geautomatiseerde Vi-CELL teller (1). <img alt="Figuur 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg" /> Figuur 2A: Drie en vijf keer het aantal van de BHK-21 cellen werden gekweekt en hersteld van 3 - en 5-layer Multi-Kolven in vergelijking met T-175 flessen. Verwachte opbrengst werd bepaald met behulp van gemiddelde cel opbrengst van de controle T-175 flessen, vermenigvuldigd met drie en vijf keer voor de 3 - en 5-layer Multi-Kolven respectievelijk (n = 4 kolven / formaat). <img alt="Figuur 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg" /><br/&gt; Figuur 2B: Cell opbrengst per cm 2 was gelijk in 3 - en 5-layer Multi-Kolven en T-175 flessen voor de BHK-21, LNCaP, HepG2 en EcoPack2-293 cellen. Elke staaf stelt betekenen van 4 tot 6 flessen. BHK-21 cellen (11.000 cells/cm2) werden gekweekt gedurende 72 uur, LNCaP cellen (20.000 cells/cm2) en EcoPack2-293-cellen (~ 35.000 cells/cm2) werden gekweekt gedurende 96 uur en HepG2-cellen (25.000 cellen / cm 2 ) werden gekweekt gedurende 48 uur voorafgaand aan de oogst. 3. Media verdeling lagen van Multi-Flask Celcultuur medium (DMEM, Invitrogen) werd toegevoegd aan 5-layer Multi-Kolven (250 mL/5-layer schip) en verdeeld in lagen volgens protocol zoals hierboven beschreven. Mediadistributie werd gemeten door het boren van gaten in elke laag en media gepompt uit afzonderlijke lagen. Gewicht van de vloeistof teruggewonnen uit elke laag bleek vrij uniform zijn van laag naar laag zoals getoond in Fig 3. Ze zijn als volgt: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0.58, 50.21 ± 0.13, 49.88 ± 0.35, 49.45 ± 0.37 (gm). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg" /> Figuur 3. Uniform mediadistributie in elk van de vijf lagen van een 5-layer Multi-Flask. Celkweekmedium werd toegevoegd aan Multi-Kolven (250 ml/5-layer schip), in evenwicht gebracht en verdeeld aan individuele lagen. De media werd gepompt uit door gaten geboord in de afzonderlijke lagen en vocht gewicht was opgenomen van elke laag (n = 6 flessen). 4. Cell verdeling tussen de lagen van Multi-Flask Cellen kunnen worden toegevoegd en gemengd in de Multi-Flask. We gesimuleerde verdeling van de cellen tussen de lagen van Multi-Flask met behulp van kralen (10μm; Polysciences Inc), vergelijkbaar in grootte aan cellen. Kraal suspensie werd toegevoegd aan Multi-Flask schip met behulp van een 10 ml pipet door de bovenste laag en gemengd met de media in het vat als aflopendribed in het protocol hierboven. Kraal distributie werd gemeten door het boren van gaten in elke laag en vloeistof met kraal suspensie werd gepompt uit afzonderlijke lagen. Bead concentratie hersteld van iedere laag werd gelezen op een Coulter Counter en geregistreerd. Hieronder weergegeven gelijkwaardig zijn inter-layer kraal distributies in 3-lagen Multi-Kolven (fig.4a). De mix-poort maakt een homogene verdeling van de cellen en reagentia tussen Multi-Flask lagen. <img alt="Figuur 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg" /> Figuur 4A: Bead distributie in elk van de drie lagen van een 3-laags Multi-Flask. Een suspensie van kralen (3,6 x 10 6 / ml) werd toegevoegd aan medium gedispenseerd in Multi-Kolven (bead schorsing: mediavolume is 1:10, vol: vol) en gemengd, gevolgd door evenwicht en partitie stappen met behulp van de beschreven protocol. Bead concentratie hersteld van elke laag (medium gepompt door de gaten geboord op elke laag) werd gelezen op een Coulter CountER en geregistreerd. Hieronder weergegeven gelijkwaardig zijn inter-layer kraal distributies in 3 - lagen Multi-Kolven (n = 5 flacons) Hieronder volgt zijn representatief beeld van Ecopack 2-293 kleurpatronen van cellen uitgegroeid tot&gt; 80% confluentie op 3-layer Multi-Kolven in groei aangevuld media. Celmonolagen werden gefixeerd en gekleurd met kristalviolet en Multi-Flask lagen werden vervolgens gesneden en afbeeldingen die zijn gescand (2). Let op, cel patroon was homogeen op alle lagen van de Multi-Kolf (Fig.4B). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met meerdere celtypen geëvalueerd (gegevens niet getoond). <img alt="Figuur 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg" /> Figuur 4B: Deze figuur illustreert homogene celgroei tussen de lagen van Multi-kolven. Ecopack-2-293-cellen gegroeid tot&gt; 80% confluentie in 3-lagen Multi-Kolven en T-175 waren gefixeerd en gekleurd met kristalviolet. Multi-Flask schepen werden gesneden en elke gekleurde laag werd gescand. 5 luchttoevoer in Multi-kolf.: Analyse van gebruikte media met BioProfile FLEX analyser (3,4) (Nova Biomedical) van EcoPack2-293 cellen gekweekt gedurende 96 uur lieten geen verschil in de lucht verzadiging van cellen gekweekt in 5-layer Multi-Kolven vs T-175 flessen (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% omgevingslicht O 2). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg" /> Figuur 5: Air verzadiging (% ambient O 2) van gebruikte media waren gelijk in de pre-mixed media van 5-layer Multi-Kolven vs T-175 flessen. EcoPack2-293 cellen werden uitgezet met een dichtheid van 35.000 cellen / cm 2 en gekweekt gedurende 96 uur voorafgaand aan de media-analyse (n = 3 flessen).

<ol><li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+mesurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).</li>
<li>Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+growth+assay+for+epidermal+cell+cultures+by+their+crystal+violet+binding+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol.+Res%22%5BJournal%5D)">Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity.</a> Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).</li>
<li>Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Flux+analysis+of+CHO+cell+metabolism+in+the+late+non-growth+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).</li>
<li>Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+elevated+pCO2+and+osmolality+on+growth+of+cells+and+production+of+antibody%E2%80%93fusion+protein+B1%3A+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 21, (2005).</li>
<li>Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+medium+volume+on+cell+density+and+life-span+of+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts.</a> Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).</li>
<li>Flaherty, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlaherty%2C+P+%22Tips+and+Techniques+for+enhancing+your+cell+culture%22">Tips and Techniques for enhancing your cell culture</a>. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).</li>
<li>Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanyal%2C+S+%22Scaling+up+cells+in+BD+Falcon+Cell+Culture+Multi-Flasks%22">Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks</a>. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).</li>
<li>DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+coordinately+modulates+liver+transcription+factors+and+hepatocyte+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).</li>
<li>Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+of+%CE%B21+integrins+for+keratinocyte+migration+in+vitro+and+during+cutaneous+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair.</a> Dev. 129, 2303-2303 (2002).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn medewerkers van Becton Dickinson, Biosciences Segment, Discovery Labware Unit.

De huidige studie toont de stijging van de productiviteit, dat de Multi-Flask ontwerp onderzoekers biedt. Hoewel het belangrijk is het volgen van de hierboven beschreven stappen voor optimale prestaties bij het gebruik van Multi-Kolven, zijn er weinig kritische stappen in dit protocol worden geacht dat de meest essentiële. Deze omvatten (i) het mengen van cellen en het gebruik van de reagentia mix haven in het vat (ii) het vervoer van Multi-Flask bij een hoek van 45 ° met de klok mee na de faseverdeling vloeistof in elk van de lagen (iii) houdende Multi-Flask vlak na de opdeling in de incubator. Correct gebruik van Multi-Flask leidt tot de productie van een homogene cel bevolking dat in elk vaartuig dat is gekweekt in een omgeving die is congruent aan T-175 flessen (5). Deze schepen bieden 3 en 5 keer meer cellen in een soortgelijke voetafdruk als de T-175 kolf. De 3 en 5-laags schip biedt 525 en 875cm 2 van groeigebied, respectievelijk en bieden zowel ruimte en arbeid savings aan gebruikers. Tissue Culture Oppervlaktebehandeling is vergelijkbaar met de standaard kolven waardoor schaal-up zonder de noodzaak om opnieuw te optimaliseren van bestaande cultuur voorwaarden of afbreuk te doen aan de kwaliteit, homogeniteit of de prestaties van cellen (6, 7). Dit biedt ook voor de vergelijkbaarheid met eerder verzamelde gegevens. Deze schepen kunnen ook worden bekleed met reagentia, zoals collageen, fibronectine, poly-D-lysine naar een gespecialiseerde substraat voor hechting, groei en differentiatie van bepaalde celtypes, zoals hepatocyten 8, 9 kertainocytes, stamcellen gekweekt in serum-vrije media formuleringen. Coating oplossingen kunnen worden verwijderd met minimale residuele vloeistof retentie om zo verspilling van waardevolle reagentia en effectieve verwijdering van de coating-oplossing te verminderen voorafgaand aan het kweken van cellen. De aanbevolen optimale media volume aan cultuur cellen in Multi-kolven range ,142-0.287 ml / cm 2, die vertalen naar 25-50 ml per laag. In tegenstelling tot de andere lagen kolf, tzijn product biedt een mix-poort in het vat die het mogelijk maakt een snelle in-schip mixen en gelijkmatige verdeling van cellen en reagentia binnen en tussen de lagen van elk schip. Diverse cellijnen, primaire culturen en stamcellen zijn opgeschaald efficiënt gebruik van Multi-kolven. Deze schepen zijn bijzonder voordelig in toepassingen die een groot aantal cellen, zoals in high throughput-screening, de productie van vaccins, virale vector transfecties en celtherapie vraag. Besparingen in tijd, ruimte, arbeid en een verminderde afvalproductie zijn de belangrijkste winst van de Multi-Flask versus conventionele culturen in single-gelaagde schepen. We kunnen de cultuur ongeveer drie keer het aantal cellen geoogst van 5, T-175 flessen in dezelfde ruimte met behulp van 3, 5-laags Multi-kolven. Dit voordeel in de ruimte besparen is niet alleen beperkt tot T-175, maar kan ook worden uitgebreid tot andere schepen: een standaard-roller flesje apparaat dat past in gewone laboratorium incubators huizen ~ 4 rolLER flessen (2200 ml), die elk 850cm 2 oppervlak. In hetzelfde gebied, kan ~ 20, 5-layer Multi-Kolven worden gehuisvest waardoor het verstrekken van vijf keer de groei van het oppervlak tot cultuur cellen. Bovendien, met een toename van de &quot;Go-Green&quot; bewustzijn, mogelijkheden om afval te verminderen is zeer wenselijk. In dat opzicht is er een 38% (5, T-175 flessen wegen ~ 640g terwijl een, 5-laags Multi-Flask weegt ~ 400 g) daling van de afvalproductie met behulp van Multi-Kolven in vergelijking met T-175 kolven en deze voordelen leiden af te nemen in de opslag van afvalstoffen en de verwijdering kosten en leiden tot economische besparingen voor de gebruiker.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Equipment </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 3-laags Tissue Culture behandeld 525cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences Cel Cultuur - BD Falcon Multi-Kolven</a> </td></tr><tr><td> 5-laags Tissue Culture behandeld 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100 ml pipet </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10 ml pipet </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml pipet opzuigen </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357.501 </td></tr><tr><td> 50 ml polypropyleen conische buis </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 fles Tissue Culture behandeld </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gram Crystal Violet </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Tryptose Fosfaat Broth </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK-21-cellen </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LNCaP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Polystyreen Bead </td><td> Polysciences Inc </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Profile Flex Analyzer </td><td> Nova BioMedical </td><td></td></tr></tbody></table>

opschaling van zoogdiercelculturen met behulp van een nieuw meerlaagse flask

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Een groeiend aantal cel-gebaseerde toepassingen vereisen een groot aantal cellen. Gebruik van een laag T-flessen, dat er voldoende zijn tijdens kleinschalige uitbreiding, kan omslachtig, arbeidsintensief en tijdrovend wanneer grote aantallen cellen nodig zijn. Om aan deze behoefte, de prestaties van een nieuwe multi-layered celkweek schip een gemakkelijke schaal vergemakkelijken van cellen uit een gelaagde T-kolven zullen worden besproken. De geteste kolven zijn leverbaar in 3 - en 5-layer formaat en respectievelijk in staat stellen cultuur en volledig herstel van drie en vijf keer het aantal cellen, in vergelijking met T-175 flessen. Een belangrijk kenmerk van de BD Multi-Flask is een mix / evenwicht poort die het mogelijk maakt een snelle in-schip mixen en gelijkmatige verdeling van cellen en reagentia binnen en tussen de lagen van elk vaartuig en consequent produceren cellen die kunnen worden gekweekt in een omgeving die is congruent aan T-175 flessen. Het ontwerp van deze Multi-Kolven maakt het ook mogelijk voor convenient pipet toegang voor het toevoegen van reagentia en cellen rechtstreeks in de kolven en efficiënt herstel van waardevolle cellen en reagentia en vermindert het risico op besmetting te wijten aan het gieten. Voor toepassingen waar het gieten wordt de voorkeur boven pipetteren, het ontwerp zorgt voor minimale residuele vloeistof retentie zo te verminderen verspilling van waardevolle cellen en reagentia.

Cellen spelen een instrumentele en steeds grotere rol in het onderzoek, en de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe therapeutica. Met deze toenemende behoefte aan een groter aantal cellen we hebben meer efficiënte en effectieve manieren voor het kweken en oogsten van gehechtheid afhankelijke cellen. Een meerlaagse kolf met de juiste functies kan dienen dit doel.

Opschaling van zoogdiercelculturen met behulp van een nieuw Meerlaagse Flask

Een groeiend aantal celgebaseerde toepassingen vereist grote hoeveelheden cellen. Het gebruik van enkelwandige T-flasks, die adequaat zijn bij kleinschalige...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe men homogene cellen met een verhoogde productiviteit kan kweken met behulp van de BD Falcon Multi-flasks met drie of vijf lagen. Dit wordt bereikt door eerst medium aan de flask toe te voegen en deze te inoculeren met een celsuspensie. De tweede stap is het mengen en equilibreren van de inhoud om deze gelijkmatig te distribueren.De derde stap is het transportpartitioneren en het plat plaatsen van het vat in de incubator. De laatste stap is het oogsten van de cellen die in de multi-flask zijn gekweekt. Uiteindelijk kan er een celopbrengst worden geoogst die drie tot vijf keer hoger is dan bij T 1 75 flasks, met een homogene celgroei over alle lagen van de multi-flask, omdat er gebruik wordt gemaakt van een nieuw celkweekapparaat.Een visuele demonstratie van deze methode wordt sterk aanbevolen, aangezien de handelingen moeilijk te conceptualiseren zijn. Multi-flask kweekvaten voor cellen zijn verkrijgbaar in een stapelbaar formaat van drie of vijf lagen voor het opschalen van cellen, met respectievelijk 525 en 875 vierkante centimeter groeioppervlak; pipetteertoegang vergemakkelijkt het toevoegen en verwijderen van cellen en reagentia in en uit het vat. De aanwezigheid van de mengpoort maakt snel mengen in de vaten en egalisatie van het medium over alle lagen van de multi-flask mogelijk.Om een multi-fles voor celkweek te gebruiken, begint u met het verticaal op de zijkant plaatsen van het vat in een steriele laminaire flowkast. Label de multi-fles in deze positie, met de dopzijde naar boven, voordat er inhoud wordt toegevoegd, waarna u de dop losdraait en verwijdert. Voeg een pipet van 50 tot 100 milliliter in.Voeg onmiddellijk 35 milliliters voorverwarm cellengroeimedium per laag rechtstreeks toe aan de multi-fles. Om beluchtingsvorming van het medium te voorkomen, dient de vloeistofstroom langs de binnenwand van de multi-fles te lopen. Gebruik tot slot een pipette van minder dan of gelijk aan 10 milliliter.Voeg de experimentele cel-suspensie uit een geconcentreerde celvoorraad toe aan het groeimedium via de bovenlaag en sluit de fles af om het mengen van cellen met het medium door omkering te vergemakkelijken en om te voorkomen dat er extern grote volumes cel-suspensies moeten worden gemaakt. Til de multi-fles op en houd deze rechtop met het logo naar u toe gericht, en draai het vat tegen de klok in tot een hoek van 45 graden. Houd het vat vervolgens in dezelfde hoek vast.Kantel de multi-fles voorzichtig van voor naar achteren, met de hals van u af, totdat de vloeistof in de bovenste laag volledig naar beneden door de mengpoort loopt. Draai de fles rond de mengpoort en herhaal deze handeling om een adequate menging van de cellen met het medium mogelijk te maken. Zet de multi-fles vervolgens terug in de gemengde positie.Plaats na het mengen van de celsuspensie de multi-fles verticaal op een vlak werkoppervlak om het vloeistofvolume in alle lagen gelijkmatig te verdelen. Draai de multi-fles vervolgens, met het logo zoals eerder naar u toe gericht, met de klok mee in een hoek van 45 graden om de vloeistof over elke laag te verdelen.Zorg ervoor dat er geen vloeistof bij de mengpoort komt. Zodra de celsuspensie is verdeeld, transporteert u de multi-fles onder dezelfde hoek van 45 graden met de klok mee, met het medium van de mengpoort af, naar de incubator. Terwijl u het vat in deze hoek houdt, draait u de multi-fles voorzichtig horizontaal naar beneden op het oppervlak van de incubator, met het logo naar boven, waarbij u de hoek aan de tegenovergestelde zijde van de mengpoort als draaipunt gebruikt. Schud het vat vervolgens voorzichtig heen en weer en van links naar rechts om de cellen gelijkmatig over de kweekoppervlakken te verdelen.Zorg ervoor dat er geen vloeistof uit elke laag morst bij het stapelen van de vaten op elkaar. Zodra ze in de incubator zijn geplaatst, moet u ervoor zorgen dat het medium gescheiden blijft en uit de buurt van de mengpoort blijft wanneer het plat op het andere vat wordt gelegd. Houd eerst de multi-fles rechtop met het logo naar binnen gericht.Plaats vervolgens een aspiratietip van vijf milliliter en zuig het verbruikte medium af om de aspiratie te voltooien. Houd de multi-flask in een hoek van 45 graden tegen de klok in terwijl u het vat naar binnen kantelt en ga door met aspireren voor een maximale recovery. Terwijl het vat naar binnen gekanteld is, kantelt u het met de klok mee en aspireert u het resterende volume in de hoek tegenover de mengpoort vóór de dissociatie.Indien nodig kunnen celmonolagen worden gespoeld met PBS en worden afgezogen in een afvalcontainer. Voeg nu het tripsine-EDTA-dissociatiereagens toe en breng het vat terug naar de mengpositie. Nadat de partitionering is geëquilibreerd en het reagens over alle lagen is verdeeld, zoals zojuist is gedemonstreerd, wordt de kolf gedurende de gewenste tijd geïncubeerd bij 37 °C.Nadat de oplossing in het inactiveringsreagens is geneutraliseerd en de stappen voor mengen, equilibreren en partitioneren zijn herhaald, wordt de celsuspensie in een opvangbuis gegoten. Kantel tenslotte de multifles met de klok mee in een hoek van 45 graden weg van de mengpoort, terwijl het vat omgekeerd blijft.Gebruik een pipet om alle overgebleven reagentia te verzamelen. Neem een aliquot cellen af voor telling om de celconcentratie te bepalen. Bij het gebruik van groeimedium in een drielaagse multifunctionele fles wordt een volume celcultuurmedium van 75 tot 150 milliliter aanbevolen.Bij gebruik van een vijflaagse multi-flask is het mogelijk om tot 125 tot 250 milliliter per vat te incuberen. Voor dissociatiemiddelen kunnen 15 milliliter of meer worden toegevoegd per drielaagse multi-flask, en 25 milliliter of meer voor vijflaagse vaten bij gebruik van drielaagse en vijflaagse multi-flasks. Zoals weergegeven in deze staafgrafiek werden drie tot vijf keer zoveel babyhamster niercellen gekweekt en teruggewonnen uit de multi-flasks in vergelijking met T 1 75 flasks.In deze figuur is te zien dat de celopbrengst per eenheid oppervlakte gelijkwaardig is in multi-flasks van drie en vijf lagen en T 1 75 flasks voor babyhamsterniercellen. Een menselijke prostaatadenocarcinoom-cellijn, een menselijke hepatische carcinoom-cellijn en een menselijke niercellijn eco pack 2 2 9 3, die voor deze gegevens allemaal zijn gekweekt in de geschikte groeimedia voor celkweek.Medium werd toegevoegd aan vijf-laagse multi-flasks en verdeeld over de lagen. Volgens het zojuist gedemonstreerde protocol werden er vervolgens gaten in de afzonderlijke lagen geboord en werd het medium uit elke laag weggepompt en gemeten. Het gewicht van de teruggewonnen vloeistof uit elke laag was relatief gelijkmatig tussen de lagen, wat een gelijkmatige verdeling van het medium door het gehele vat bevestigde.Na de partitionering in deze figuur werd een gesimuleerde distributie van cellen tussen de lagen van een multi-flask uitgevoerd met behulp van beads met een vergelijkbare grootte als cellen, zoals blijkt uit de hier weergegeven gegevens van het aantal beads per laag. De mengpoort maakte een homogene distributie van de beads en reagentia tussen de lagen van de multi-flask mogelijk. Hier zijn representatieve afbeeldingen van kleuringspatronen van cellen die zijn gegroeid tot een confluentie van meer dan 80% op drie-laags multi-flasks.In aangevuld groeimedium worden celmonolagen getoond die gefixeerd en gekleurd zijn met kristalviolet. De lagen van de multi-fles zijn uitgesneden en de afbeeldingen zijn gescand. Let op het homogene celpatroon op alle lagen van de multi-fles.Deze laatste figuur toont gegevens van een analyse van verbruikte media, geïsoleerd uit menselijke embryonale niercelculturen na 96 uur met behulp van een bio profile flex analyzer. Er werd geen verschil in luchtsaturatie vastgesteld in de media die geïsoleerd waren uit de afzonderlijke lagen van vijf-laags multi-flasks vergeleken met T 1 75 flasks. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de multi-flask kunt gebruiken om de productiviteit te verhogen.

scale-up-of-mammalian-cell-culture-using-a-new-multilayered-flask

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Met behulp van een pneumatische bioreactor demonstreren we de assemblage, werking en prestaties van dit bioreactorsysteem voor eenmalig gebruik voor de groei van zoogdiercellen.

Teelt van zoogdiercellen met behulp van een Single-use Pneumatische bioreactorsysteem

Voedingsregulatie met behulp van continu aangepaste groeivoeding verbetert de groeisnelheid van zoogdiercelsferoïden in vergelijking met intermitterende batchvoeding voor culturen in geroerde suspensiebioreactoren. Deze studie toont de methoden die nodig zijn voor het vestigen van eenvoudige aangepaste voedingsculturen.

Nutrient verordening door continue toevoer voor grootschalige uitbreiding van zoogdiercellen in sferoïden

De beschreven protocollen stellen laboratoria in staat schaalbare, aderente stamcelcultuur uit te voeren met hoge doorvoer en minimale arbeid, ervaring en investeringskosten voor apparatuur met behulp van een programmeerbare robot voor vloeistofverwerking en 96-well platen.  iPSC's die meer dan 20 keer op dit systeem zijn gepasseerd, behielden pluripotentie, normale karyotypen en differentieerden in cardiomyocyten.

Schaalbare 96 putjes plaat Based iPSC Culture and Production Met een Robotic Liquid Handling System

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Hier presenteren we een protocol om aanhangende cellen uit meerlaagse kolven op een gesloten semi-geautomatiseerde manier te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatiesysteem. Dit protocol kan worden toegepast voor het oogsten van zowel adherente als suspensiecellen van andere celexpansieplatforms met weinig aanpassingen aan de bestaande stappen.

Menselijke mesenchymale stamcelverwerking voor klinische toepassingen met behulp van een gesloten semi-geautomatiseerde workflow

Hier presenteren we een protocol om de grootschalige productie van aanhangende cellen te bereiken via een volledig gesloten systeem op basis van GMP-kwaliteit oplosbare microdragers. De kweek van menselijke mesenchymale stamcellen, HEK293T cellen en Vero-cellen werd gevalideerd en voldeed aan zowel de kwantiteitseisen als de kwaliteitscriteria voor de cel- en gentherapie-industrie.

Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Leer hoe je homogene zoogdiercellen opschaalt met meerlaagse BD Falcon Multi flasks voor biotechnologisch onderzoek. Deze methode levert drie tot vijf keer meer cellen op dan traditionele T175 flasks.

Opschaling van zoogdiercelculturen met behulp van een nieuw Meerlaagse Flask

Meer video's verkennen