Name: Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Leer fluorescencedetectiemethoden voor microfluïdische druppelplatformen om hoge doorvoeranalyse en gevoelige data-extractie te realiseren. Deze technieken ondersteunen PCR, nanopartikelsynthese en single-cell assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de steun van de volgende research councils en subsidies luidt: EPSRC, HFSP, National Research Foundation van Korea (Grant nummer R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

<ol><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li>
<li>Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid%2FLiquid%2FGas+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li>
<li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplets%3A+A+sea+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li>
<li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li>
<li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li>
<li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+%CE%BCs+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li>
<li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li>
<li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li>
<li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li>
</ol>

We hebben de fabricage van een microfluïdische apparaat, een experimentele opstelling en de bijbehorende protocollen voor microdroplet vorming en reagens inkapseling en optische detectie van de verwerkte druppels. De twee voorbeelden geselecteerd (het opsporen van afzonderlijke cellen in druppels en het in kaart brengen van het mengen van processen binnen stromen druppeltjes) vertegenwoordigen gemeenschappelijke toepassingen die momenteel worden onderzocht met druppel microfluidics. Als de gepresenteerde experimenten illustreren, het gebruik van de druppel microfluïdische platformen bepaalde aantrekkelijke kenmerken, zoals high throughput, quasi-perfect opsluiting, hoge reproduceerbaarheid ... De grote hoeveelheid van de geproduceerde informatie en de hoge snelheid waarmee deze informatie wordt gegenereerd, echter, vereisen het gebruik van snelle detectiemethoden met een hoge resolutie tijdruimtelijke als de volledige voordeel is te behalen uit deze geminiaturiseerde platforms. In dit geval hebben we laten zien dat ditmogelijk met behulp van zeer nauwkeurige fluorescerende spectroscopische technieken. Met name de FLIM detectietechniek (die gebruik maakt van een gepulste laser met herhaling periodes zo kort als een paar ns) toont de capaciteit om heel snel informatie te verkrijgen uit snel stromende druppels (van rond de 200 per seconde). In dit geval is de tijdsresolutie van de gedetecteerde gebeurtenissen was zo laag als 1 microseconde. In termen van grenzen in druppelgrootte en concentratie, zou het gebruik van grotere numerieke apertuur lenzen en grotere vermogen lasers gemakkelijk te maken de opsporing van nM concentraties binnen de druppeltjes zo klein als 5 micrometer (de beperkingen in druppelgrootte wordt opgelegd door de resoluties van de fotolithografische fabricageproces en van de submicron positionering stadium). Microfluïdische druppeltjes zijn ideale kandidaten voor het uitvoeren van grootschalige experimenten waarbij kleine hoeveelheden van de reagentia, tot een doel / gebeurtenis. Huidige beperkingen van deze technologie betrekking op de moeilijkheid om dr te genererenoplets uit een grote verscheidenheid (tientallen of honderden) van verschillende bronnen in een high-throughput manier. Bovendien, de moeilijkheid te richten en te manipuleren elk gegenereerd enkel druppeltje legt strenge beperkingen op de praktische toepasbaarheid van deze technieken. Daarom zijn deze kwesties in het centrum van belangrijke onderzoeksinspanningen gericht op het ontwikkelen van de nodige technologische oplossingen die in staat zal stellen microfluïdische druppel platformen een standaard referentie methode van onderzoek en analyse in high throughput toepassingen te worden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Fluoresceïne 5-isothiocyanaat (FITC) </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidine-Alexa Fluor 488 </td><td> Reagens </td><td> Molecular Probes </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 siliconenelastomeer kit </td><td> Reagens </td><td> Premier Farnell Verenigd Koninkrijk LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramine-O </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm gepulste laser diode </td><td> Uitrusting </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC Card </td><td> Uitrusting </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dichroic spiegel </td><td> Uitrusting </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Microscoop doel </td><td> Uitrusting </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Avalanche fotodiode </td><td> Uitrusting </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidiumjodide </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli top 10 stam </td><td> Cellen </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

De ontwikkeling van microfluïdische platforms voor het uitvoeren van scheikunde en biologie heeft voor een groot deel gedreven door een scala van mogelijke voordelen die het systeem miniaturisatie begeleiden. De voordelen omvatten de mogelijkheid om efficiënt te verwerken nano-femoto-liter volume van het monster, gemakkelijke integratie van functionele componenten, een intrinsieke aanleg voor grootschalige multiplexing, verbeterde analytische doorvoer, betere controle en minder instrumentale voetafdrukken 1. In de afgelopen jaren veel aandacht heeft gericht op de ontwikkeling van de druppel-gebaseerde (of gesegmenteerde flow) microfluïdische systemen en hun potentieel als platformen in high-throughput experimenten. 2-4 hier water-in-olie emulsies zijn gemaakt om spontaan formulier in microfluïdische kanalen als gevolg van capillaire instabiliteiten tussen de twee niet-mengbare fasen. Belangrijk is, kan microdruppels van precies gedefinieerde volumes en composities worden gegenereerd bij frequentiesvan meerdere kHz. Bovendien, door het inkapselen van reagentia van belang in geïsoleerde compartimenten, gescheiden door een continue mengbare fase, zowel sample cross-talk en spreiding (diffusie-en Taylor-gebaseerd) kunnen worden geëlimineerd, wat leidt tot een minimale kruisbesmetting en de mogelijkheid om tijd analytische processen met grote nauwkeurigheid. Bovendien, aangezien er geen contact is tussen de inhoud van de druppels en het kanaal muren (die zijn bevochtigd door de continue fase) absorptie en het verlies van reagentia op het kanaal muren wordt voorkomen. Zodra druppeltjes van dit soort zijn gegenereerd en verwerkt, is het noodzakelijk om extract van de vereiste analytische informatie. In dit opzicht is de opsporingsmethode van de keuze moet snel zijn, een hoge gevoeligheid en lage detectiegrenzen, van toepassing zijn op een reeks van moleculaire species, niet-destructief en kunnen worden geïntegreerd met microfluïdische apparaten in een gemakkelijke manier. Om aan deze behoefte hebben wij als adresuite van experimentele instrumenten en protocollen die de winning van grote hoeveelheden informatie fotofysische van kleine-volume omgevingen mogelijk te maken, en zijn van toepassing op de analyse van een breed scala van fysische, chemische en biologische parameters. Hierin twee voorbeelden van deze methoden worden gepresenteerd en toegepast op de detectie van enkele cellen en het in kaart brengen van het mengen van processen binnen picoliter-volume druppels. Wij rapporteren het hele proces, inclusief experimentele microfluïdische chip fabricage, de optische installatie en het proces van druppel generatie en detectie.

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

De ontwikkeling van microfluïdische platforms voor het uitvoeren van chemie en biologie is grotendeels gedreven door een reeks potentiële voordelen die ...

Hallo, ik ben Jersey. Hi, mijn naam is Shabi en wij zijn beiden postdoctoral onderzoekers aan het Imperial College London, waar we werken met professor Andrew Di Melo en dr. Josh Del aan microfluïdische druppelplatforms. Druppelgebaseerde microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor experimenten met een hogere doorvoer, omdat ze gegenereerd kunnen worden met zeer hoge, nauwkeurig gedefinieerde volumes en hun generatiefrequentie kan oplopen tot meerdere kilo's per seconde.Bovendien kan, aangezien het gebied van interesse kan worden ingekapseld in compartimenten van slechts enkele liters, zowel crosstalk als dispersie worden geëlimineerd en kunnen analytische processen met grotere nauwkeurigheid worden getimed. In onze groep hebben we micro-druppelplatforms al met succes toegepast in talrijke applicaties. Denk hierbij aan de polymerasekettingreactie, nanodeeltjessynthese en de single molecular cell assay.De grote hoeveelheden informatie die binnen deze systemen worden gegenereerd, moeten efficiënt worden geëxtraheerd, benut en aangewend. In dit opzicht moet de gekozen detectiemethode geschikt zijn, een hoge gevoeligheid en lage detectielimieten bieden, toepasbaar zijn op een reeks moleculaire soorten, niet-destructief zijn en op een eenvoudige manier kunnen worden geïntegreerd met microfluïdische apparaten. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we een reeks experimentele hulpmiddelen en protocollen ontwikkeld die de extractie van grote hoeveelheden fysieke informatie uit omgevingen met een klein volume mogelijk maken en toepasbaar zijn voor de analyse van een breed scala aan fysische, chemische en biologische aspecten.In dit protocol presenteren we twee methoden die worden toegepast voor de detectie van enkelvoudige cellen en het in kaart brengen van mengprocessen in een droplet-systeem. Microfluïdische chips worden traditioneel gefabriceerd in polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van fotolithografische methoden. Dit proces dient te worden uitgevoerd in een cleanroom-faciliteit om microfluïdische kanalen te verkrijgen: spin SU-8 50 op een siliciumwafer, voer een soft bake uit op een hotplate bij 65 °C en 95 °C om het oplosmiddel te verdampen en de film te verdichten; belicht na afkoeling de SU-8 resist met UV-straling onder het juiste masker, en bak de wafer vervolgens bij 65 °C en 95 °C na afkoeling.Ontwikkel de niet-belichte gebieden met de geschikte ontwikkelaar terwijl u roert. Gebruik vers EC-oplosmiddel om de wafer te spoelen en droog deze vervolgens onder gas om een schoon oppervlak te verkrijgen. Behandel de wafer met wassingen van hexaan en methanol.Om het fabricageproces van de master voor de estates te voltooien, wordt er gedurende 40 minuten een fixatiemiddel in een desiccator op het oppervlak geëvaporeerd. Om gestructureerde microfluidische substraten te vormen, mengen we S guard 1 8 4 in een verhouding van 10:1 tussen hars en crosslinker en brengen we dit aan over de master. Ontgas dit in een desiccator en uithard het device bij 65 °C.Snijd het uitgeharde PDMS door en pel het van de master af. Maak toegangsgaten voor de vloeistofslangen met een biopsietpons. Hard een andere laag PDMS 20 minuten uit bij 65 graden.Plaats de voorbereide bovenlaag op de onderlaag en laat deze gedurende de nacht uitharden bij 65 °C. Pel de chips uit de Petrischaal en snijd ze in blokjes. Zodra de chips zijn gefabriceerd, kunnen ze worden gebruikt door de gewenste oplossingen te infuseren.Vul de spuiten met de vereiste oplossingen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slangetjes achterblijven. Voor de generatie van druppels worden twee fasen gebruikt. De waterige gedispergeerde fase bevat de relevante reagentia.De oliefase fungeert als de continue fase. Bevestig aan één uiteinde slangetjes met dezelfde binnendiameter als de naalden van de spuiten aan de naalden; plaats de spuiten op een spuitenpomp en stel de gewenste infusiesnelheid in. Voor elke fase wordt een minimale verhouding tussen de stroomsnelheden van olie en water van één aanbevolen om bevochtiging van het PDMS door de waterfase te voorkomen, wat zou leiden tot onstabiele druppelvorming. Verbind de andere uiteinden van de slangetjes direct met de gaten die in het PDMS-substraat zijn geponst.Voor complexere oplossingen kunnen ook silica, capillaire poorten of connectoren worden geïmplementeerd. Verbind de uitlaatpoort van de chip met de slang en leid deze naar een opvangvat voor afvalverzameling of verdere analyseverwerking. Zodra dit is ingesteld, zijn er twee hoofdconfiguraties van microkanalen om druppels te genereren: flow-focusing of een T-junction-formaat, als gevolg van de schuifkrachten die ontstaan bij het gebruik van deze geometrieën om de twee toegelaten vloeistoffen samen te brengen en de daaropvolgende capillaire instabiliteiten die zich op het grensvlak ontwikkelen.Er worden spontaan kleine, verspreide druppels van slechts enkele femtoliters gegenereerd. Zodra de druppels worden gegenereerd, kunnen deze worden onderzocht met een optische opstelling. De optische opstelling wordt volgens het volgende protocol ingericht.Gebruik een confocale microscoop met een automatische submicron positioneringscapaciteit en een laser die werkt op een golflengte die overeenkomt met de absorptie van de betrokken fluorforen. Om deze te exciteren, wordt voor fluorescentie-levensduurbeeldvorming een pulslaser gebruikt met herhalingsfrequenties van enkele megahertz. Bij experimenten met slijm worden beamsteering-spiegels en optica gebruikt om zowel de straalhoogte als de straalrichting te regelen.Gebruik een dichroïsche spiegel om de laserstraal naar de objectieflens te reflecteren. Als er twee lasers gelijktijdig worden gebruikt, kan een dual-band dichroïsche spiegel worden geïnstalleerd. Gebruik een oneindig gecorrigeerd microscoopobjectief met een hoge numerieke apertuur (NA) om de twee laserstralen te reflecteren en het laserlicht in een scherpe focus binnen een microfluïdisch kanaal te brengen.Vang de door het monster in het microfluïdische kanaal uitgezonden fluorescentie op, met gebruik van hetzelfde objectief met hoge NA en transmissie via dezelfde dichroïsche spiegel. Verwijder eventueel resterend excitatielicht met een enkel- of dubbelbandig emissiefilter. Focus de fluorescentie-emissie op een pinhole van 75 micrometer.Maak gebruik van een plano-convexe lens. Positioneer het pinhole in het confocale vlak van het microscoopobjectief. Gebruik een andere dichroïsche spiegel om het fluorescentiesignaal over twee detectoren te splitsen.Filter de door de dichroïsche spiegel gereflecteerde fluorescentie met een emissiefilter en focus deze met een vlakbolle lens op de eerste detector. Voor experimenten met een secundaire rode fluorvoor, filter de door de dichroïsche spiegel getransmitteerde fluorescentie met een ander emissiefilter en focus deze vervolgens met een andere vlakbolle lens op de tweede detector. Gebruik avalanche-fotodiodes voor de detectie van fluorescentiefotonen.Koppel voor de acquisitie van fluorescentiegegevens het elektronische signaal van de avalanche-fotodiodedetector aan een multifunctioneel DAQ-apparaat voor gegevensregistratie op een personal computer. Gebruik voor experimenten met slijm een gepulseerde laser en verbind de detectoren met een tijdgecorreleerde single-photon-counting (TCS) PC-kaart op een aparte pc. Met deze kaart kunnen fluorescentielevetijdsgegevens worden verkregen.Er wordt gebruikgemaakt van een TCS PC-methodologie. Elk gedetecteerd fluorescent foton wordt gecorreleerd aan een invallende laserpuls, waardoor aan elk uitgezonden fluorescent foton een vertragingstijd wordt toegewezen. Deze gegevens kunnen worden gefit aan een enkelvoudige of meervoudige exponentiële vervalkurve om een schatting van de radiatieve snelheid van de fluorofoor te verkrijgen.We weten inmiddels dat cellen zeer heterogeen zijn vanuit zowel biologisch, fysisch als chemisch perspectief. Daarom zouden we idealiter elke cel afzonderlijk moeten analyseren. De assays moeten echter met een hogere doorvoersnelheid worden uitgevoerd, zodat we voldoende kwantitatieve informatie kunnen verzamelen om tot een betrouwbare en betekenisvolle conclusie te komen.Hier hebben we een voorbeeld van het inkapselen van e coli-cellen in een enkele druppel, zodat dit kan worden uitgevoerd. Gebruik de e coli top 10-stam die gedurende de nacht is gekweekt. Om de levensvatbaarheid van de cellen aan te tonen, gebruikt u cyto nine en propidiumjodide.Beide kleurstoffen zijn DNA-intercalerende kleurstoffen en hun fluorescentie-intensiteit neemt met meer dan 20 keer toe. Na binding aan DNA is cyto nine een groen fluorescerende kleurstof die door membranen kan dringen, terwijl propidiumjodide een rood fluorescerende kleurstof is die niet door membranen kan dringen.Hierdoor fluoresceren levende cellen groen, terwijl dode cellen zowel groene als rode emissies vertonen. Hier kunnen we de druppelgeneratie en de inkapseling van een enkele cel met een T-verbinding zien. Deze video is opgenomen met een hogesnelheidscamera, maar druppels kunnen met een snelheid van duizenden per seconde worden gegenereerd.Bij het inkapselen van cellen moet men ervoor zorgen dat de celcultuur zodanig wordt verdund dat er minder cellen zijn dan er druppels worden gegenereerd, en dat sedimentatie van de cellen wordt voorkomen, wat kan gebeuren in de spuit of de slang. Gebruik een magnetische roerstaf in de spuit om de cellen gelijkmatig in de oplossing verdeeld te houden. Gebruik zeer dunne slang, 50 micrometers, om de spuit met de microchip te verbinden.Dit zorgt voor een hoge stroomsnelheid in de slang en voorkomt zo dat de cellen bezinken. Hier zijn typische voorbeelden van fotontellingen als functie van de tijd voor de celgebaseerde experimenten. Om mengprocessen binnen druppels in kaart te brengen.Druppels kunnen worden gegenereerd met behulp van twee verschillende fluorforen met verschillende levensduren. Binnen een stromende druppel wordt een stromingsveld gegenereerd, dat uiteindelijk de twee oorspronkelijk gescheiden oplossingen mengt om het mengproces te verbeteren. De symmetrie van het stromingsveld kan worden gewijzigd door kronkelende kanalen te gebruiken.Om de druppels te onderzoeken, wordt het volume van de optische probe gefocust op de helft van de hoogte van een microkanaal waarlangs druppels stromen; begin aan één zijde van het kanaal en voer elk experiment uit over de gehele breedte van het kanaal met intervallen van één micrometer. Implementeer een algoritme om individuele bursts die geassocieerd zijn met druppels te onderscheiden van de ruisachtergrond van de olifase en om de duur van elke burst vast te stellen.Implementeer een tweede algoritme om de vertragingstijd en intensiteitswaarden langs de lengte van elke druppel te extraheren bij de specifieke breedte waarop het experiment is uitgevoerd. Gebruik vervolgens een maximum likelihood estimator (MLE) algoritme om de fluorescentielevensduur van elke druppel in het experiment te evalueren. Door de levensduurwaarden voor alle druppels in het experiment te middelen, wordt de uiteindelijke fout van de MLE-berekening verkleind.Hoe meer druppels er worden onderzocht, hoe kleiner de fout zodra er een levensduurstraject is verkregen. Combineer voor elke breedte alle trajecten in een 2D-kaart. Aangezien elke levensduurwaarde is gekoppeld aan een specifieke mengeling van de twee fluorescente markers, kan op deze wijze een concentratie- of mengingskaart worden opgesteld.We hebben de vervaardiging van een micro-apparaat en een experimentele opstelling beschreven, samen met de bijbehorende protocollen voor de vorming van microdruppels, de inkapseling van regio's en de optische detectie van het proces, de druppels. De twee geselecteerde voorbeelden zijn de detectie van enkelvoudige cellen in druppels en het in kaart brengen van mengprocessen. Binnen de stromende druppel vertegenwoordigen dit veelvoorkomende toepassingen die momenteel worden onderzocht met druppelmicrofluidica.Zoals de gepresenteerde experimenten illustreren, vertoont het gebruik van druppel-microfluidische platforms bepaalde aantrekkelijke kenmerken, zoals een hoge doorvoer door de perfecte inkapseling en een hogere reproduceerbaarheid. De grote hoeveelheid geproduceerde informatie en de hoge snelheid waarmee deze informatie wordt gegenereerd, vereisen het gebruik van snelle detectiemethoden met een maximale spatiotemporele resolutie om het volledige voordeel van deze geminiaturiseerde platforms te benutten.In dit geval tonen we aan dat dit mogelijk is met behulp van zeer nauwkeurige fluorester spectroscopische technieken.

fluorescence-detection-methods-for-microfluidic-droplet-platforms

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Een lensless on-chip fluorescentie microscopie platform is aangetoond dat kan afbeelding fluorescerende voorwerpen over een ultra-breed-of-view van bijvoorbeeld,&gt; 0,6-8 cm2 met &lt;4μm resolutie met behulp van een steekproef op basis van compressie-algoritme decodering. Zo'n compacte en wide-field fluorescerende on-chip beeldvormende modaliteit kan waardevol zijn voor high-throughput cytometrie, zeldzame-cel onderzoek en microarray-analyse.

Lensless fluorescentie microscopie op een chip

We presenteren een nieuwe techniek om de laterale diffusie van een oppervlakteactieve soort op het vloeistof-vloeistof grensvlak te meten door een druppel monolaag samen te voegen met een platte monolaag.

Fluorescentie herstel na het samenvoegen van een druppel op de twee-dimensionale Verspreiding van een Phospholipid monolaag Meet

Meerkleurige fluorescentiedetectie in druppelmicrofluidica omvat doorgaans omvangrijke en complexe detectiesystemen op basis van epifluorescentiemicroscopen. Hier beschrijven we een compact en modulair meerkleurig detectieschema dat gebruikmaakt van een reeks optische vezels om meerkleurige gegevens die door een enkele fotodetector worden verzameld, tijdelijk te coderen.

Multicolor Fluorescentie detectie voor Droplet Microfluidics Met behulp van optische vezels

Dit werk geeft een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfismen detecteren op een pneumatische druppel manipulatie platform. Met de voorgestelde werkwijze, het gehele experiment, met inbegrip druppeltje manipulatie en detectie van multi-nucleotide polymorfismen dergelijke kunnen bij 23 ° C zonder behulp van geavanceerde instrumenten.

De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform

We tonen een microfluïdische platform met een geïntegreerde oppervlakte-elektrode netwerk resistieve pulse sensing (RPS) met code division multiple access (CDMA) combineert, om detectie en afmeting van deeltjes in meerdere microkanalen multiplexen.

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Het algemene doel van het protocol is om meer dan een miljoen geordende, uniforme, stabiele en biocompatibele femtoliter druppels voor te bereiden op een 1 cm2 vlakke substraat die kan worden gebruikt voor celvrije eiwitsynthese.

Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Het protocol beschrijft een geavanceerd microfluïdisch platform om de cytokinesecretiedynamiek van individuele menselijke perifere mononucleaire bloedcellen kwantitatief te meten. Het platform meet tot drie cytokines parallel (IL-6, TNFα en IL-1β) voor elke individuele cel die wordt gestimuleerd met lipopolysaccharide als voorbeeld.

Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen 

Een toegankelijke, open-source microfluïdische workflow wordt gepresenteerd voor de geparallelliseerde analyse van plasmideretentie in bacteriën. Door fluorescentiemicroscopie toe te passen om de aanwezigheid van plasmide in eencellige microkolonies in gelmicrodruppels te kwantificeren, biedt deze methode een nauwkeurig, toegankelijk en schaalbaar alternatief voor traditionele plaattelling.

Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer fluorescencedetectiemethoden voor microfluïdische druppelplatformen om hoge doorvoeranalyse en gevoelige data-extractie te realiseren. Deze technieken ondersteunen PCR, nanopartikelsynthese en single-cell assays.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Meer video's verkennen