Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms
December 10th, 2011
Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.
Hallo, ik ben Jersey. Hoi, mijn naam is Shabi en we zijn allebei postdoctoraal onderzoeker aan het Imperial College of London, werkend met Professor Andrew Di Melo en Dr. Josh Del in microfluïdische druppelplatforms. Druppelgebaseerde microfluïdische platformen zijn veelbelovende kandidaten voor experimenten met een hogere doorvoer, omdat ze kunnen worden gegenereerd in zeer hoge nauwkeurig gedefinieerde volumes en hun concurrenties, de generatiefrequentie kan zo hoog zijn als enkele duizend pers.
Bovendien, omdat het gebied van belang kan worden ingekapseld in compartimenten zo laat als een paar liter, kunnen zowel crosstalk als spreiding worden geëlimineerd, en kunnen analytische processen worden getimed met grotere nauwkeurigheid. In onze groep hebben we al met succes micro druppelplatformen geïmplementeerd voor een groot aantal toepassingen. Bijvoorbeeld, polymerasekettingreactie, nanodeeltjessynthese, en de enkele moleculaire celtest.
De grote hoeveelheden informatie die binnen deze systemen worden gegenereerd, moeten efficiënt worden geëxtraheerd, benut en gebruikt. In dit opzicht zou de detectiemethode van keuze juist moeten zijn, hoge gevoeligheid en lage detectielimieten moeten bieden, toepasbaar moeten zijn op een reeks moleculaire soorten, niet-destructief moeten zijn, en op een eenvoudige manier kunnen worden geïntegreerd met microfluïdische apparaten. Om deze behoefte aan te pakken, hebben we een reeks experimentele hulpmiddelen en protocollen ontwikkeld die de extractie van grote hoeveelheden fysische informatie uit kleine volumeomgevingen mogelijk maken, en zijn toepasbaar op de analyse van een breed scala aan fysische, chemische en biologische tors.
In dit protocol zullen we twee methoden presenteren die worden toegepast op de detectie van enkele cellen en het in kaart brengen van mengprocessen in Dropbox. Microfluïdische chips worden traditioneel vervaardigd in poly dimethyl Sloane PGMS met behulp van fotolitografiemethoden. Dit proces moet worden uitgevoerd in een cleanroom-faciliteit om microfluïdische kanalen Spinco, SU acht 50 op een siliciumwafer zacht te bakken op een hotplate bij 65 graden en 95 graden om het oplosmiddel te verdampen en de film te verdichten na afkoeling, de SU acht blootstelling, weerstand met UV-straling onder het juiste masker, en bak dan de wafer bij 65 graden en 95 graden na afkoeling.
Ontwikkel de niet-belichte gebieden met de juiste ontwikkelingsoplossing tijdens het roeren. Gebruik vers EC-oplosmiddel om de wafer te spoelen en droog hem dan onder gas om een schone oppervlakte te genereren. Behandel de wafer met hexane en methanol wasbeurten.
Ook om het esate master fabricageproces te voltooien, verdampt een beslagmiddel op het oppervlak in een desiccat voor 40 minuten. Om gestructureerde microfluïdische substraten te vormen, mengen we S guard 1 8 4 in een 10 tot een verhouding van harscrosslinker en trekken dit over de master. Ontgast dit in een desiccat en geneest het apparaat bij 65 graden.
Snijd het uitgeharde PDMS en trek het van de master. Maak toegangsgaten voor vloeistofslangen met behulp van een biopsiepomp. Genees een andere laag PDMS gedurende 20 minuten bij 65 graden.
Plaats de voorbereide bovenlaag op de onderlaag en genees deze een nacht bij 65 graden. Trek de chips van de Petri-schaal en diceer. Zodra de chips zijn vervaardigd, zijn ze klaar om te worden gebruikt door de oplossingen van belang te infuseren.
Vul spuiten met de vereiste oplossingen, ervoor zorgen dat er geen luchtbellen achterblijven in enig deel van de slangen. Voor druppelgeneratie worden twee fasen gebruikt. De aqueuze gedispergeerde fase bevat de reagentia van belang.
De oliefase fungeert als de continue fase past slangen van dezelfde interne diameter als de naaldpunten van de spuit op het ene uiteinde naar de naalden bevestig de spuiten op een spuitpomp en definieer de gewenste infusiesnelheid. Voor elke fase wordt een minimale verhouding van olie aqueuze stromingssnelheden van één aanbevolen om natte van de PDMS door de aqueuze fase te voorkomen, wat zou leiden tot onstabiele druppelvorming. Verbind de andere uiteinden van de slangen rechtstreeks met de gaten die in de PDMS-substraat zijn geboord.
Voor meer complexe oplossingen kunnen ook silica, capillaire poorten of connectoren worden geïmplementeerd. Verbind de uitlaatpoort van de chip met de slangen en leid rechtstreeks naar een verzamelaar voor afvalverzameling of verdere analyseverwerking. Zodra dit is ingesteld, zijn er twee hoofdconfiguraties van microkanalen om druppels te genereren door stromingsfocussering of een T-splitsingsformaat als resultaat van de schuine krachten die ontstaan bij het gebruik van deze geometrieën om de twee toelaatbare vloeistoffen samen te brengen en de daaropvolgende capillaire ins die zich in het grensvlak ontwikkelen.
Een oh verspreidt druppels zo klein als enkele femtoliters zich spontane. Zodra de druppels worden gegenereerd, kunnen ze worden onderzocht met behulp van een optisch opzet. Het optische systeem is ingesteld in het volgende protocol.
Gebruik een confocale microscoop met geautomatiseerde submicron-positioneringscapaciteit en een laser die werkt op een golflengte die overeenkomt met de absorptie van de Fluor valt betrokken. Om ze te exciteren, gebruik een pulslaser die werkt op herhalingssnelheden van enkele megahertz voor levensduurbeeldvorming van fluorescentie. Slijmexperimenten gebruiken spiegels en optiek voor straalbesturing om de straalhoogte en de straalrichting te regelen.
Gebruik een dichroische spiegel om de laserstraal in de objectieflens te reflecteren. Als twee lasers gelijktijdig worden gebruikt, kan een dubbelband dichroische spiegel worden geïnstalleerd. Om reflectie van de twee laserstralen mogelijk te maken, gebruikt u een oneindig gecorrigeerde hoge numerieke apertuur NA microscoopobjectief om het laserlicht tot een strakke focus binnen een microfluïdisch kanaal te brengen.
Verzamel fluorescentie die door het monster wordt uitgezonden binnen het microfluïdische kanaal, met behulp van dezelfde hoge NA objectief en getransporteerd door dezelfde dichroische spiegel. Verwijder eventueel resterend excitatielicht met behulp van een enkele of dubbele bandemissiefilter. Focus de fluorescentie-emissie op een 75 micrometer pinhole.
Met behulp van een plano convexe lens. Plaats het pinhole in het confocale
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van druppel-gebaseerde microfluïdische platformen voor hoogdoorvoer experimenten. Deze platformen kunnen picolitaire, zelf-gecompartimenteerde vaten genereren met hoge frequenties, waardoor efficiënte gegevensextractie en analyse mogelijk wordt.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidics
- Hoogdoorvoer experimenten
- Fluorescentie spectroscopie
Achtergrond
- Druppel microfluidics staat nauwkeurige controle van kleine volumes toe.
- Eliminatie van crosstalk en dispersie verbetert de analytische nauwkeurigheid.
- Toepassingen omvatten PCR, nanodeeltje synthese, en single-cell assays.
- Integratie met gevoelige detectiemethoden is cruciaal voor gegevensextractie.
Doel van Studie
- Om gereedschappen te ontwikkelen voor het extraheren van grote hoeveelheden informatie uit microfluïdische systemen.
- Om methoden te presenteren voor het detecteren van enkele cellen en het in kaart brengen van mengprocessen.
- Om de gevoeligheid en toepasbaarheid van detectiemethoden te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Fabricage van microfluïdische chips met behulp van fotolithografie.
- Druppel generatie met behulp van flow focusing en T-kruising geometrieën.
- Optische opstelling voor het onderzoeken van druppels met confocale microscopie.
- Gebruik van lasers voor fluorescentie levensduur beeldvorming.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle generatie van druppels zo klein als enkele femtoliters.
- Hoge gevoeligheid detectiemethoden werden ontwikkeld.
- Methoden demonstreerden effectieve incapsulatie en analyse van monsters.
- Protocollen vastgesteld voor verschillende toepassingen in microfluidics.
Conclusies
- Druppel-gebaseerde platformen zijn effectief voor hoogdoorvoer analyse.
- Integratie van detectiemethoden verbetert gegevensextractie capaciteiten.
- Deze platformen kunnen worden aangepast voor een breed scala aan wetenschappelijke toepassingen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Microfluidic droplet platforms enable high-throughput screening by generating picoliter-volume compartments that eliminate cross-talk and dispersion, supporting precise analytical timing. This capability enhances predictive confidence in early discovery by allowing rapid, quantitative assessment of biological and chemical parameters at scale. Integration with sensitive fluorescence detection methods provides the spatial and temporal resolution needed to leverage miniaturization for de-risking target validation and lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through single-cell encapsulation and viability assessment using DNA-intercalating dyes.
- Operational Value: Facilitates high-frequency droplet generation (kHz range) for scalable screening of heterogeneous cell populations.
- Predictive Value: Supports functional target validation by isolating cellular responses in confined volumes, reducing mechanistic ambiguity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative fluorescence lifetime and intensity readouts for mapping molecular mixing and reaction kinetics within droplets.
- Operational Value: Enables standardization of assay conditions via precise volumetric control and elimination of wall adsorption losses.
- Platform Reuse: Supports multiplexed detection through dual-laser excitation and spectral splitting for concurrent parameter measurement.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase phenotypic screening to preclinical validation through reproducible, droplet-based encapsulation of biological systems.
- Risk Mitigation: Enhances confidence in lead selection by enabling time-resolved analysis of mixing processes that influence reaction efficiency and product consistency.
- Continuity: Facilitates transfer of optimized droplet protocols from early discovery to preclinical models via standardized chip fabrication and optical detection.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself in the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, where quantitative droplet-based outputs inform go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling single-cell analysis and mixing kinetics mapping in isolated compartments.
- Screening: Delivers assay readiness through high-sensitivity, non-destructive fluorescence detection compatible with frequent droplet generation.
- Analytics: Provides fluorescence lifetime and intensity measurements that allow teams to compare reaction progress and molecular interactions under controlled conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating reproducible, quantifiable data from encapsulated biological samples applicable to dose-response and toxicity profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform capability where standardized microfluidic chips and optical setups can be applied across multiple projects in chemistry, biology, and materials science.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through single-cell resolution and elimination of cross-talk in high-throughput formats.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via precise droplet generation and integrated optical detection.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through quantitative, kinetically resolved data from picoliter reactors.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by mechanistic de-risking of lead candidates through mixing and viability profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic chip fabrication, fluorescence spectroscopy, and confocal microscopy alignment.
- Needs instrumentation including pulsed lasers, high-NA objectives, dichroic mirrors, emission filters, and time-correlated single-photon counting detectors.
- Demands cross-team standardization of droplet generation parameters and optical probe positioning for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols across different cell types, reagents, or channel geometries.
- Practical limitations include the need for cleanroom access for master fabrication and careful optimization of flow rates to prevent aqueous phase wetting of PDMS channels.
