Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Hallo, ik ben Jersey. Hoi, mijn naam is Shabi en we zijn beiden postdoctoral onderzoekers aan het Imperial College of London, waar we samenwerken met professor Andrew Di Melo en dr. Josh Del aan microfluïdische druppelplatforms. Druppelgebaseerde microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor experimenten met een hogere doorvoer, omdat ze kunnen worden gegenereerd in zeer hoge, nauwkeurig gedefinieerde volumes en hun generatiefrequentie kan oplopen tot meerdere kilo-hertz.

Bovendien kan, aangezien het interessegebied worden ingekapseld in compartimenten van slechts enkele liters, zowel crosstalk als dispersie worden geëlimineerd en kunnen analytische processen met grotere nauwkeurigheid worden getimed. Binnen onze groep hebben we microdruppelplatforms al succesvol geïmplementeerd voor talrijke toepassingen. Denk hierbij aan de polymerasekettingreactie, nanodeeltjessynthese en de single molecular cell assay.

De grote hoeveelheden informatie die binnen deze systemen worden gegenereerd, moeten efficiënt worden geëxtraheerd, benut en aangewend. In dit opzicht moet de gekozen detectiemethode geschikt zijn, een hoge gevoeligheid en lage detectielimieten bieden, toepasbaar zijn op een reeks moleculaire soorten, niet-destructief zijn en op een eenvoudige manier kunnen worden geïntegreerd met microfluïdische apparaten. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we een reeks experimentele instrumenten en protocollen ontwikkeld die de extractie van grote hoeveelheden fysieke informatie uit omgevingen met een klein volume mogelijk maken, en die toepasbaar zijn voor de analyse van een breed scala aan fysieke, chemische en biologische factoren.

In dit protocol presenteren wij twee methoden die worden toegepast voor de detectie van individuele cellen en het in kaart brengen van mengprocessen in Dropbox. Microfluïdische chips worden traditioneel gefabriceerd in polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van fotolithografische methoden. Dit proces dient te worden uitgevoerd in een cleanroomfaciliteit om microfluïdische kanalen te verkrijgen: spin SU-8 50 op een siliciumwafer, voer een soft bake uit op een hotplate bij 65 °C en 95 °C om het oplosmiddel te verdampen en de film te verdichten; na het afkoelen wordt de SU-8 resist blootgesteld aan UV-straling onder het juiste masker, waarna de wafer na afkoeling opnieuw wordt gebakken bij 65 °C en 95 °C.

Ontwikkel de niet-belichte gebieden met de geschikte ontwikkelaarsoplossing onder constant roeren. Gebruik vers EC-oplosmiddel om de wafer te spoelen en droog deze vervolgens met gas om een schoon oppervlak te verkrijgen. Behandel de wafer met wassingen van hexaan en methanol.

Om het fabricageproces van de estate master te voltooien, wordt er gedurende 40 minuten in een vacuümexsiccator een fixatiemiddel op het oppervlak geëvaporeerd. Om gestructureerde microfluïdische substraten te vormen, mengen we S guard 1 8 4 in een verhouding van 10:1 tussen hars en crosslinker en brengen we dit aan over de master. Ontgas dit in een vacuümexsiccator en cureer het device bij 65 °C.

Snijd de uitgeharde PDMS door en pel deze van de master af. Maak toegangsgaatjes voor de vloeistofslangen met een biopsietang. Hard een volgende laag PDMS 20 minuten lang uit bij 65 °C.

Plaats de voorbereide bovenlaag op de onderlaag en laat deze een nacht uitharden bij 65 °C. Pel de chips uit de Petrischaal en snijd ze in blokjes. Zodra de chips zijn gefabriceerd, zijn ze klaar voor gebruik door de gewenste oplossingen te infuseren.

Vul de spuiten met de benodigde oplossingen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in enig deel van de slang aanwezig zijn. Voor de generatie van druppels worden twee fasen gebruikt. De waterige gedispergeerde fase bevat de betreffende reagentia.

De oliefase fungeert als de continue fase; bevestig aan één uiteinde slangjes met dezelfde binnendiameter als de naalden van de spuiten aan de naalden. Monteer de spuiten op een spuitpomp en stel de gewenste infusiesnelheid in. Voor elke fase wordt een minimale verhouding tussen de olie- en waterstroomsnelheden van één aanbevolen om bevochtiging van het PDMS door de waterfase te voorkomen, wat zou leiden tot onstabiele druppelvorming. Verbind de andere uiteinden van de slangjes rechtstreeks met de gaten die in het PDMS-substraat zijn geponst.

Voor complexere oplossingen kunnen ook silica, capillaire poorten of connectoren worden geïmplementeerd. Verbind de uitlaatpoort van de chip met de slang en leid deze naar een opvangbak voor afvalverzameling of verdere analyseverwerking. Zodra dit is ingesteld, zijn er twee hoofdconfiguraties van microkanalen om druppels te genereren: flow focusing of een T-splitsing, als gevolg van de schuifkrachten die ontstaan door het gebruik van deze geometrieën om de twee toestane vloeistoffen samen te brengen en de daaropvolgende capillaire instabiliteiten die zich aan het grensvlak ontwikkelen.

Monodisperse druppels met een volume van slechts enkele femtoliters worden spontaan gegenereerd. Zodra de druppels worden gegenereerd, kunnen ze worden onderzocht met een optische opstelling. Het optische systeem wordt volgens het volgende protocol ingericht.

Gebruik een confocale microscoop met geautomatiseerde positioneringscapaciteit op submicronniveau en een laser die werkt op een golflengte die overeenkomt met de absorptie van de gebruikte fluoroforen. Gebruik voor fluorescentie-levensduurbeeldvorming (fluorescence lifetime imaging) een gepulste laser met herhalingssnelheden van enkele megahertz om deze te exciteren. Bij experimenten met slijm worden straalsturende spiegels en optica gebruikt om zowel de straalhoogte als de straalrichting te regelen.

Gebruik een dichroïsche spiegel om de laserstraal naar de objectieflens te reflecteren. Als er twee lasers gelijktijdig worden gebruikt, kan een dual-band dichroïsche spiegel worden geïnstalleerd. Om de reflectie van de twee laserstralen mogelijk te maken, dient een oneindig gecorrigeerde microscoopobjectief met een hoge numerieke apertuur (NA) te worden gebruikt om het laserlicht in een scherp brandpunt binnen een microfluïdisch kanaal te brengen.

Vang de door het monster in het microfluïdisch kanaal uitgezonden fluorescentie op, met gebruik van hetzelfde objectief met een hoge NA en transmissie via dezelfde dichroïsche spiegel. Verwijder eventueel resterend excitatielicht met een enkel- of dubbelbandig emissiefilter. Focus de fluorescentie-emissie op een pinhole van 75 micrometer.

Gebruik een plano-convexe lens. Positioneer het pinhole in het confocale vlak van het microscoopobjectief. Gebruik een tweede dichroïsche spiegel om het fluorescentiesignaal over twee detectoren te splitsen.

Filter de door de dichroïsche spiegel gereflecteerde fluorescentie met een emissiefilter en focus deze met een plano-convexe lens op de eerste detector. Voor experimenten met een secundaire rode fluor wordt de door de dichroïsche spiegel getransmitteerde fluorescentie gefilterd met een ander emissiefilter, waarna deze met een andere plano-convexe lens op de tweede detector wordt gefocust. Gebruik avalanche-fotodiodes voor de detectie van fluorescentiefotonen.

Koppel voor de acquisitie van fluorescentiedata het elektronische signaal van de avalanche-fotodiodedetector aan een multifunctioneel DAQ-apparaat voor datalogging op een pc. Gebruik voor experimenten met slijm een gepulste laser en sluit de detectoren aan op een TCSPC-kaart (time-correlated single photon counting) op een aparte pc. Met deze kaart kunnen gegevens over de fluorescentielevensduur worden verkregen.

Met behulp van een TCS PC-methodologie wordt elk gedetecteerd fluorescentiefoton gecorreleerd aan een invallende laserpuls, waardoor aan elk geëmitteerd fluorescentiefoton een vertragingstijd wordt toegewezen. Deze gegevens kunnen worden gefit aan een enkelvoudige of meervoudige exponentiële vervalcurve om een schatting van de radiatieve snelheid van de fluorofoor te verkrijgen.

We weten inmiddels dat cellen zeer heterogeen zijn vanuit zowel biologisch, fysisch als chemisch perspectief. Daarom zouden we idealiter elke cel afzonderlijk moeten analyseren. De assays moeten echter met een hogere doorvoersnelheid worden uitgevoerd, zodat we voldoende kwantitatieve informatie kunnen verzamelen om tot een betrouwbare en betekenisvolle conclusie te komen.

Hier is een voorbeeld van het inkapselen van E. coli-cellen in een enkele druppel, zodat dit kan worden uitgevoerd. Gebruik de E. coli top 10-stam die gedurende de nacht is gekweekt. Om de levensvatbaarheid van de cellen te detecteren, gebruikt u CytoNine en propidiumjodide.

Beide kleurstoffen zijn DNA-intercalerende kleurstoffen en hun fluorescentie-intensiteit neemt met meer dan 20-voudig toe. Na binding aan DNA is cyto nine een groen fluorescerende kleurstof die door het membraan kan dringen, en propidiumjodide is een rood fluorescerende kleurstof die niet door het membraan kan dringen.

Levende cellen fluoresceren dus groen, terwijl dode cellen zowel groene als rode emissies vertonen. Hier kunnen we de druppelgeneratie en de inkapseling van een enkele cel zien met een T-splitsing. Deze video is opgenomen met een hogesnelheidscamera, maar druppels kunnen met een snelheid van duizenden per seconde worden gegenereerd.

Bij het inkapselen van cellen moet men ervoor zorgen dat de celcultuur zodanig wordt verdund dat er minder cellen zijn dan gegenereerde druppels, en dat sedimentatie van de cellen wordt voorkomen, wat kan gebeuren in de spuit of de slang. Gebruik een magnetische roerstaaf in de spuit om de cellen gelijkmatig in de oplossing verdeeld te houden. Gebruik zeer dunne slang, 50 micrometers, om de spuit met de microchip te verbinden.

Dit zorgt voor een hoge stroomsnelheid in de slang en voorkomt zo dat de cellen bezinken. Hier zijn typische voorbeelden van fotonenaantallen als functie van de tijd voor de celgebaseerde experimenten. Om mengprocessen binnen druppels in kaart te brengen.

Druppels kunnen worden gegenereerd met behulp van twee verschillende fluoroforen met verschillende levensduren. Binnen een stromende druppel wordt een stromingsveld gegenereerd, dat uiteindelijk de twee oorspronkelijk gescheiden oplossingen mengt om het mengproces te verbeteren. De symmetrie van het stromingsveld kan worden gewijzigd door kronkelige kanalen te gebruiken.

Om de druppels te analyseren, richt u het volume van de optische probe op de helft van de hoogte van een microkanaal waarlangs druppels stromen, beginnend aan één zijde van het kanaal; voer elk experiment uit over de gehele breedte van het kanaal met intervallen van één micrometer. Implementeer een algoritme om individuele bursts die geassocieerd zijn met druppels te onderscheiden van de ruisachtergrond van de oliefase, en om de duur van elke burst vast te stellen.

Implementeer een tweede algoritme om de vertragingstijd- en intensiteitswaarden langs de lengte van elke druppel te extraheren op de specifieke breedte waarop het experiment is uitgevoerd. Gebruik vervolgens een maximum likelihood estimator (MLE) algoritme om de fluorescentieleftijd van elke druppel in het experiment te evalueren. Door de leeftijds-waarden voor alle druppels in het experiment te middelen, wordt de uiteindelijke fout van de MLE-berekening verminderd.

Hoe meer druppels er worden onderzocht, hoe kleiner de fout nadat een levensduurtraject is verkregen. Combineer voor elke breedte alle trajecten in een 2D-kaart. Aangezien elke levensduurwaarde geassocieerd is met een specifieke mengeling van de twee flora-vormen, kan op deze manier een concentratie- of mengkaart worden verkregen.

We hebben de vervaardiging van een micro-apparaat en de experimentele opstelling en bijbehorende protocollen voor de vorming van microdruppels, de inkapseling van regio's en de optische detectie van het proces, de druppels, beschreven. De twee gekozen voorbeelden zijn de detectie van enkelvoudige cellen in druppels en het in kaart brengen van mengprocessen. Binnen de stromende druppel vertegenwoordigen dit veelvoorkomende toepassingen die momenteel worden onderzocht met druppelmicrofluidica.

Zoals de gepresenteerde experimenten illustreren, vertoont het gebruik van druppel-microfluïdische platforms bepaalde aantrekkelijke kenmerken, zoals een hoge doorvoercapaciteit dankzij de perfecte opsluiting en een hogere reproduceerbaarheid. Vanwege de grote hoeveelheid geproduceerde informatie en de hoge snelheid waarmee deze informatie wordt gegenereerd, is het gebruik van snelle detectiemethoden met een zeer hoge ruimtelijk-temporele resolutie vereist om optimaal gebruik te maken van deze geminiaturiseerde platforms.

In dit geval tonen we aan dat dit mogelijk is met behulp van zeer precieze fluoreuze spectroscopische technieken.