Name: MALDI massaspectrometrie Imaging van neuropeptiden bij de ziekte van Parkinson (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: Ontdek MALDI massaspectrometrie imaging om neuropeptiden in rattenhersenen te analyseren bij de ziekte van Parkinson. Deze methode onthult ruimtelijke verdeling van behandelingsgerelateerde veranderingen met hoge moleculaire specificiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Hanna Warner om bij te dragen de gegevens voor figuur 3 en prof. Jonas Bergquist voor waardevolle input. De Zweedse Research Council (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA); De Åke Wiberg&#39;s Foundation (MA, JH), De Koninklijke Zweedse Academie van Wetenschappen (MA, JH), en de Zweedse Chemische Society (JH) worden bedankt voor financiële steun.

Het protocol wordt aangepast ten behoeve van statistische analyse van MALDI IMS gegevens uit meerdere hersenen van de rat secties, meestal 20 tot 30 delen, en bestaat uit vijf verschillende stappen bestaande uit het prepareren van weefsels, matrix toepassing, MALDI-TOF MS-analyse, data-analyse, en neuropeptide identificatie. De procedures zijn beschreven en beschreven in meer gedetailleerde hieronder: 1. Tissue voorbereiding Deze procedure omvat de verzameling van de respectieve weefsel alsmede weefsel snijden voor IMS analyse. Een bijzonder doel eiwitten en peptiden analyse te voorkomen proteolytische afbraak. Daarom is het essentieel om snel en zorgvuldig te werken tijdens weefsel dissectie. <ol><li> Offer ratten (250-300 g typisch) werden onthoofd verwijderen rattenhersenen binnen maximaal postmortale van &lt;30 en bevriezen poedervormig droog ijs alvorens tot -80 ° C diepvriezer. Sneller vriezen met vloeibare stikstofverhogen het risico van microtears in het hersenweefsel, die negatief zal beïnvloeden matrix kristallisatie en daardoor niet MS kwaliteit (fig. 2D). Hele hersenen kunnen worden opgeslagen voor een aantal jaren voordat het snijden zonder verlies van MS kwaliteit van het signaal. </li><li> Snijd bevroren weefsel op een cryostaat microtoom tot 12 micrometer plakjes en dooi-mount weefselcoupes op een geleidende MALDI glazen dia's (indium tin oxide coating dia's, Bruker Daltonics) of MALDI doel (afb. 2A-C). </li><li> Droog secties 15 min onder vacuüm en opslaan dia bij -80 ° C tot verder gebruik. Weefselsecties worden geanalyseerd in de kortst mogelijke tijd na snijden, zelfs indien bewaard bij -80 ° C. We vinden dat MS kwaliteit van het signaal zal merkbaar worden verminderd na een jaar in opslag. Om oxidatie van eiwitten en peptiden verminderen, kan de lucht in opslagvat worden vervangen door een inert gas (bijv. argon of stikstof). </li></ol> 2. Matrix toepassing De matrix applicatiestap heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit spectrum en vereist optimalisatie van verschillende parameters afhankelijk van het soort weefsel en de analyt van belang. Deze factoren omvatten chemische parameters zoals de aard van de matrix, matrix concentratie, pH, weefsel wassen en organische modificatoren en instrumentele instellingen met borg volume laterale resolutie en het aantal van afzettingen 10 (Fig. 2D). Voor grote schaal experimenten is het van groot belang variantie verminderen, bijvoorbeeld door toepassing van de matrix voor alle lagen binnen een dag door dezelfde. Hoewel er vele strategieën matrix oplossing te brengen zoals door sublimatie of spray, het automatisch aanbrengen van reeksen van kleine druppeltjes matrix, ongeveer 100-150 picoliter groot is met succes gebruikt voor de analyse van kleine eiwitten en peptiden in verschillende weefsels , waaronder hersensecties 9, 10,11, 12, 13. <ol><li> Ontdooi de secties in een exsiccator gedurende 1 uuronze. </li><li> Zorg ervoor dat het experiment wordt verblind door een andere persoon dan de exploitant. Re-label alle monsters. </li><li> Was secties 1x in 70% ethanol (EtOH, bij kamertemperatuur, RT) 10 sec en tweemaal in 95% EtOH (RT) 10 sec. Voor grote experimenten, voer dan de wassen voor alle glas schuift samen met een cuvet om variatie te minimaliseren. </li><li> Droog de secties in een exsiccator gedurende 10 minuten. </li><li> Evalueer weefselcoupes onder een microscoop en controleer weefsels vervorming, microtears en kleine scheuren die zal schaden MALDI MS kwaliteit (fig. 2D). </li><li> Bereid matrix oplossing bestaande uit 50 mg / ml DHB in 50% methanol, 10% 150 ammoniumacetaat (Amac) en 0,3% trifluorazijnzuur (TFA) in water. </li><li> Matrix toepassing door discrete druppels afzetting in een rechthoekig patroon met een chemisch inkjetprinter (CHIP, Shimadzu). De eerste stap is om de experimentele parameters van matrix toepassing te optimaliseren voor het neuropeptide analyse including van het aantal druppels per pas, aantal passages. Dit experiment wordt uitgevoerd door het toepassen van meerdere matrix arrays van verschillende toepassingen met parameters op dezelfde weefselsectie, terwijl het ervoor zorgen dat elke array soortgelijke gebieden van de hersenen, zoals corpus callosum, cortex en het striatum bekleding. Hetzelfde experiment wordt uitgevoerd telkens parameters worden gewijzigd, met inbegrip van verschillende hersenstructuren verschillende matrices voor specifieke analyten, en indien verschillende matrix oplosmiddelen nodig zijn voor winning van specifieke analyten. </li><li> Scan het glaasje houder met de weefselsectie en lijn de houder. Definieer uw array voor matrix toepassing op de weefselsectie en geef de ruimtelijke resolutie dat wil zeggen plek om afstand te spotten. Breng matrix met behulp van de geoptimaliseerde protocol over de chemische inkjet printer. Voor dit experiment hebben we een geoptimaliseerd protocol voor peptide beeldvorming met de volgende drukkerij parameters gebruikt: 10 druppels (100 PL / drop), 10 toepassing passeert en een plek om te zien distance van 300 urn. </li><li> Scan laatste matrix gespot secties en de afbeelding opslaan voor registratie voorafgaand aan de MALDI data-acquisitie (stap 3.4). </li><li> Bewaar de profielen tot gebruik in een exsiccator onder vacuüm. </li></ol> 3. MALDI MS data-acquisitie en-verwerking MS analyse van neuropeptiden wordt uitgevoerd op een MALDI time of flight instrument (Ultraflex II, Bruker Daltonics, Duitsland) die actief zijn in reflector-modus, met behulp van software ondersteunde data-acquisitie van elke matrix plek 14. Daarom is nauwkeurige ruimtelijke onderwijs is noodzakelijk. Het is essentieel dat de MALDI optimalisatie verkrijging vooral het doel registratie experimenten uitgevoerd door dezelfde die bij voorkeur worden blind de experimentele groepen. In een grootschalig experiment met meerdere glazen dia's, kan de MALDI experimenten worden uitgevoerd door een operator, terwijl een andere persoon is het gebruik van de chemische inkjet printer. <ol><li> Laad glazen dia's in de massaspectrometer. </li><li> Controleer de ijking van de MALDI overnamemethode met een laag molecuulgewicht standaardijking mix (Bruker Daltonics). </li><li> Optimaliseer acquisitie parameters. <ol><li> Om MS signaal te optimaliseren en voorkomen wegnemen matrix van naburige matrix afzettingen, moet de grootte van de laser en de optimale aandacht weefsel te bepalen. </li><li> De laser-energie is ingesteld op de maximale MS kwaliteit te waarborgen van zoveel matrix deposito's mogelijk zonder het heffen van de baseline, waardoor de piek resolutie of het verzadigen van de detector. </li><li> Beoordeel het maximum aantal opnamen per matrix plek tot er alleen nog geluid wordt gedetecteerd, vaak 1000-2000 schoten. Schat het aantal opnamen die moeten worden verzameld en het aantal foto's die vóór de laser positie binnen een plek zou moeten veranderen. Om elke matrix plaats gelijkmatig proeven, verzamelen we 600 opnamen in 25 shot stappen een totaal aantal van 24 stappen met een random bewegingspatroon van elke matrix depositie. </li></ol></li><li> Registreer de scan van alle gevlekte onderdelen van de motor coördinaten van de MALDI stadium met behulp van de FlexImaging (v.2.0) 10 en het uitvoeren van data-acquisitie in batch modus door AutoXexuteBatchRunner.exe software. </li><li> Verwerk elke afzonderlijke spectra door middel van baseline aftrekken (convex omhulsel V3), smoothing en externe kalibratie (optioneel), gevolgd door export als een ASCII-bestand (*. Dat, *. Txt of *. Csv-formaat). 15 </li></ol> 4. Evaluatie van de gegevens Definitieve data evaluatie bevat gegevens na verwerking en data reductie door richten zich uitsluitend op piek informatie, gevolgd door een statistische analyse. <ol><li> In een eerste stap werden de MALDI IMS secties geëvalueerd overnormalization effecten. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het gebruik van data visualisatie tools zoals FlexImaging (Bruker Daltonics) of BioMap (Novartis). In een eerste fase de totale ionen beelden zijn evaluated voordat de totale ion huidige (TIC) normalisatie, gevolgd door handmatige inspectie van enkele ionen distributie afbeeldingen van diverse prominente peptide pieken. Kijk voor karakteristieke piek intensiteit distributies en als ze gerelateerd zijn aan weefsel kenmerken (schade), het spotten van de kwaliteit of de normalisering effecten (afb. 3). </li><li> Af te bakenen regio's van belang (bijvoorbeeld het striatum) op basis van histologische kenmerken en exporteren van de bijbehorende spectra in ASCII-formaat. Bij voorkeur kunnen de normalisatie van spectra van de totale ionenstroom (TIC) omvat in dit stadium. </li><li> ASCII-bestanden in een data-handling software zoals Origin (v.8.1, Originlab), MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Verenigde Staten) of R 16. Peak detectie kan worden uitgevoerd met behulp van peak het vinden van tools in de software, bijvoorbeeld "piek-analyse" in Origin of "mspeaks" in Matlab. Exporteer de peaklists van alle spectra als een enkele tab gescheiden tekstbestand. </li><li> Met het oog op bin grenzen te bepalen voor gedetecteerd peptidepieken, wordt binning analyse uitgevoerd met de juiste software tools (bijvoorbeeld pbin 17) of in-house geschreven scripts voor MATLAB of R. Hier is de tekst bestand met alle piek geplukt data wordt geladen in de software en de parameters voor piek-grens bepaling worden gespecificeerd zoals hoe vaak een piek moet in spectra om relevant zijn voor de proef. Bijvoorbeeld, de experiment bevat twee groepen dieren, 5 dieren in elke groep en 100 spectra worden verzameld per dier en omgeving van belang. Neem aan dat een piek is in potentie interessant als het aanwezig is in ten minste de meerderheid van de dieren in een groep (3/5) en in ten minste de helft van de spectra van deze dieren (3x50 = 150 spectra), zal dit een totaal percentage van 15% voor de 150 positieve spectra van de in totaal 1000 (2x5x100) spectra. Met behulp van de pbin tool, deze stap levert een binrange bestand met alle bin breedtes bepaald op basis van de verkregen gegevens. Om te voorkomen dat bin de grenzen te controlerengeschikt is eenvoudig samen te visualiseren van de bakken in oorsprong het oorspronkelijke spectra sporen. </li><li> Peak-area integratie kan verminderen variantie die van belang is voor statistische analyse. We maken gebruik van een eigen geschreven script voor R om de oppervlakte te berekenen onder de curve tussen piek-grenzen bepaald in stap 4. Geïntegreerde piekoppervlakken worden geïmporteerd in MS Excel (v.2007) en statistische analyse door middel van niet-parametrische ongepaarde testen met behulp van de SAM-programma wordt uitgevoerd 18. </li></ol> 5. Peptide identificatie Volgorde verificatie van de waargenomen peptide identiteiten is van essentieel belang om biologische relevantie te sluiten. De meest nauwkeurige methode is onder andere echte top-down bepaling direct van weefsel met behulp van peptide fragmentatie door middel van tandem massaspectrometrie (MS / MS), hoewel de hoge peptide concentraties nodig zijn voor dit soort analyses 12,13. Voor lage overvloedige peptiden of meerdere peptiden met closem / z-waarden (± 0,5%), wordt op weefsel analyse aangetast en uit weefsel analyse met behulp van een peptidomic strategie wordt gebruikt, dat omvat de extractie, scheidings-en MS-gebaseerde identificatie van endogene neuropeptiden. Voor experiment hier gepresenteerde centraal was opioïde peptide detectie is een bijzondere uitdaging omdat deze peptiden zeer laag vergeleken met andere overvloedig neuropeptiden in de spectra. Bovendien zijn deze peptiden vrij polaire waardoor ze relatief hydrofiele en moeilijk te handhaven met gemeenschappelijke peptide extractie en scheidingstechnieken .. Daarom hebben wij gebruik gemaakt van een eerder gemeld protocol voor weefsel-extractie en opioïde peptide voorfractionering in combinatie met standaard LC-MS/MS gebaseerd peptide identificatie 9,19. <ol><li> Verzamel coronale secties van target structuren van belang (nucleus accumbens, NAC, nucleus caudatus putamen, CPU). Monteer bevroren hersenen van de rat in een cryostaat microtoom en verwijder omliggende hersenmateriaal (cortex, septum, corpus callosum) met een scalpel. Verzamel secties (30 micrometer; n = 50) van de ontleed NAC en CPU en dooi monteer de NAC-en CPU-delen van de onderwerpen op verschillende glazen dia's. </li><li> Extract peptiden uit weefsel door toevoeging van 100 ul 5% ACN/0.1% TFA, incubeer gedurende twee minuten en verzamel in Eppendorf lage eiwitbinding buizen. Herhaal deze stap twee keer. </li><li> Voer peptide voorfractionering met sterke kationenuitwisselingschromatografie met stapsgewijze (n = 4) elutie verhoogd ionensterkte 19. Droog naar beneden monsters onder vacuüm met behulp van een speedvac concentrator. </li><li> Analyseer de peptide fracties door middel van nanoflow C18 reversed phase vloeistofchromatografie (1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) gekoppeld aan electrospray tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). De MS experimenten werden uitgevoerd op een hybride lineaire iontrap / Fourier transform ion cyclotron resonantie (FTICR) instrument (LTQ FT 7T, Thermo Scientific, Waltham, MA,) Peptide fulscan spectra (m / z 150-2.000) Werden verworven met de FTICR analyser met hoge massa resolutie (100.000), gevolgd door verdere versnippering van de 5 meest intense peptide pieken in de iontrap door middel van botsing geïnduceerde dissociatie (CID) 9. </li><li> Peptidensequentie identificatie wordt uitgevoerd door database-matching en kan worden aangevuld met de-novo sequentie-analyse. Voor de database, worden in de handel verkrijgbare zoekmachines (Mascot, XTandem of Protein goudzoeker) in dienst 20. De zoekopdrachten worden meestal uitgevoerd tegen de databases met sequenties van bekende of voorspelde neuropeptiden en sequenties van neuropeptide precursor eiwitten 21. </li></ol> 6. Representatieve resultaten MALDI beeldvorming massaspectrometrie van striatale weefselcoupes zoals bereid volgens het protocol beschreven resulteerde in de van meer dan 1000 pieken overeenkomt met ongeveer 300 mono-isotopische moleculaire (gemiddelde spectra weergegevenin Fig. 1). Data visualisatie voor prominente moleculaire ion piek werd bereikt met behulp van de Flex Imaging software en toonde karakteristieke piek intensiteit distributies die goed in lijn zijn met anatomische kenmerken (fig. 3). Een ander kenmerk van MALDI IMS is de relatieve goede reproduceerbaarheid. In dit experiment de totale variatiecoëfficiënt de piekintensiteiten van alle gedetecteerde moleculaire was 30%, maar veel pieken weergegeven zeer geringe variatie hoge reproduceerbaarheid binnen behandelde groepen (Fig. 4). De relatieve piek van de lichtsterkte afhankelijk van vier verschillende regio's van belang, met inbegrip van de dorsolaterale en dorsomediale deel uit van zowel de gelaedeerde en intact striata werden onderworpen aan statistische analyses. Om te corrigeren voor verschillende vergelijkingen simultaan werd de statistische analyse door middel van parametrische getest volgens de SAM gereedschap 18. De meest prominente veranderingen werden gevonden in de dorsolaterale deel van de dopamine-gedenerveerde, Parkinson striatum. Hier si lijke veranderingen teweegbrengen veranderingen in tussen de verschillende behandelingsgroepen werden waargenomen voor twee prodynorfine peptiden; prodynorfine B en alfa-neoendorphin (figuur 5). In detail, een relatieve toename van zowel prodynorfine intensiteit van de piek met 50-60% werd waargenomen bij hoge dyskinetische dieren in vergelijking met lage dyskinetische dieren en laesie controles (p &lt;0,05, F (2, 15) = 12,8 DynB, F = 5,7 aNeo; Fig. 5). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> . Figuur 1 Gemiddelde MS traceert verkregen uit twee nauw met elkaar verbonden regio's van het striatum, caudate putamen (CPU) en de nucleus accumbens (NAC). De twee regio's weer te geven verschillende MS-profielen met een aantal moleculen op unieke uitgedrukt in een regio, of op verschillende piekintensiteit niveaus (insert, m / z 2028). De ruimtelijke verdeling patroon van elke piek kan worden gevisualiseerd met behulp van gespecialiseerde beeldbewerkingssoftware (onderste paneel). 2.jpg "/&gt; Figuur 2 (A) De hersenen gemonteerd op een cryostaat boorkop met een verankering media (OTC, pijl). Wordt gezorgd dat de OTC niet het gebied van hersenen doorsnede zijn omdat de OTC oorzaak ion onderdrukking van peptiden besmetten. (B, C) Slijpplaten (≈ 12 micrometer dikte) zijn ontdooien gemonteerd op MALDI compatibel glasplaatjes en gedroogd enkele seconden vorstschade vermijden gezien C. (D) Microtears kan moeilijk te detecteren met het blote oog , maar aantasting MALDI matrix kristallisatie en vernietigen MALDI MS signaal. Hetzelfde deel gekleurd met cresyl violet onthult microtears en scheuren (rechtsonder microfoto). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. De eerste stap in de evaluatie van gegevens is een aantal verschillende pieken te visualiseren over de massabereik geanalyseerd (AI). Hier werden striatale secties van 9 muizen afgebeeld met MALDI MS. Visualisatie van de gemiddelde totale iop de huidige zal onthullen gebieden met opvallend hoge of lage ionenintensiteiten (pijlen). Deze gebieden kunnen worden beïnvloed door over-of onder-normalisatie-effecten en verstoren data-analyse te doen aan de resultaten. Slechte anatomische definitie van piek-distributies laten zien secties met over het algemeen lage piek signaal-ruis, bijvoorbeeld delen 3 en 9, pieken F tot en met I. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. MS reproduceerbaarheid tussen de groepen, kan worden beoordeeld door berekening van de gemiddelde MS-trace en de standaardfout voor iedere m / z-waarde (inserts, m / z 722 en 1749). Goede reproduceerbaarheid zorgt geldige statistische analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3445/3445fig5_lg.jpg"><img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"></a> Figuur 5. Prodynorfine B en alfa-neoendorphin piek intensiteiten zijn sterk toegenomen in de 6-OHDA-Gelaedeerde, Parkinson, striatum van high-dyskinetische dieren (HD; pijlen) in vergelijking met de lage-dyskinetische (LD) en laesie controle groep (LC). Peptide piek intensiteiten uitgedrukt als gemiddelde fold-verandering van de intacte kant ± SEM (laesie / intacte zijde). * P &lt;0,05; cx cortex; cc corpus callosum. Schaal bar 5 mm.

<ol><li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levodopa+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22MALDI-TOF+MS.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li>
<li>O, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster%2C+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department%2C+Ageing+and+Life+Course%5BTitle%5D)+AND+%22Active+Ageing%3A+A+Policy+framework%22%5BJournal%5D)">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course.</a> Active Ageing: A Policy framework. , (2002).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+disorders%3A+advances+in+cause+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. , 6-7 (2010).</li>
<li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson%27s+disease%3A+problems+with+the+current+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, S22-S32 (2000).</li>
<li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li>
<li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li>
<li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).</li>
<li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+molecular+snapshots+of+biochemical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li>
<li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653(2011).</li>
<li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+directly+from+tissue%3A+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li>
<li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides%3A+3D+volume+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li>
<li>Deininger, S. -O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeininger%2C+S-O+%22Imaging+Mass+Spectrometry%22">Imaging Mass Spectrometry</a>. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).</li>
<li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li>
<li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+and+Graphical+Statistics%22%5BJournal%5D)">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li>
<li>Mass Spectrometry Binning Software GAB. , Vanderbilt Center for Quantitative Sciences. Nashville, TN. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> (2012).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwePep%2C+a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SwePep, a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende voordelen van de tewerkstelling van MALDI imaging massaspectrometrie in de studie van neuropeptiden. Een zuivere analyse van MS gegevens blijkt dat slechts bepaalde hersenkernen, of in de hier gepresenteerde resultaten waarin alleen de dorsolaterale deel van het striatum verbonden met een bepaalde pathofysiologische toestand. Door het behoud van de ruimtelijke informatie is het dan mogelijk om gebieden die van belang te herdefiniëren om statistische analyses uit te voeren met een hogere gevoeligheid en een lagere variabiliteit in vergelijking met de analyse van het hele brein secties of met behulp van traditionele peptidomics studies over peptide extracten. Bovendien is het belangrijk om te realiseren MALDI IMS gemakkelijk kan onbekende post-translationele modificaties detecteren, maar structurele analyse moet volgen om het exacte aminozuurposities die worden gewijzigd bepalen. Voorkomende valkuilen in het visualiseren van de MALDI IMS gegevens op te nemen in kaart brengen van de maximale piek intensiteit naar een lineaire optische schaal van black (0%) de kleur (100%) voor elke sectie in de reeks experimenten (figuur 3), in plaats van in kaart brengen alle secties een gemeenschappelijke absolute schaal waarbij 100% van de maximale piek-intensiteit van alle secties (figuur 5) . Deze laatste methode maakt het mogelijk de vergelijking van de groep de gegevens en visualisatie van de verschillen tussen de behandelingsgroepen. Een belangrijk obstakel in de MALDI IMS analyse is de toewijzing van peptiden aan soortelijke massa pieken. On-weefsel tandem-massaspectrometrie is het soms mogelijk, maar vaak blijkt heel moeilijk 13,14. We merken dat een meer traditionele benadering met een preparatieve fractionering op sterk kationenuitwisselingschromatografie, gevolgd door reversed phase LC-MS/MS kan worden met succes sequentie vele neuropeptiden en vooral opioïde peptiden. Het is nog steeds niet ongewoon om het verkrijgen van goede kwaliteit MS / MS-spectra die niet overeenkomen met een database gegevens het gebruik van gemeenschappelijke zoekmachines als mascotte. In deze gevallen de novo-sequencing hand de only optie. Het ultieme bewijs van de piek identiteit kan worden verkregen door MALDI IMS van weefselcoupes van de juiste knockout muis, maar dit is niet altijd beschikbaar of mogelijk is. Een alternatief is het valideren met een diametraal andere methode, bijvoorbeeld door Western immunoblotting of immunohistochemie. Dit kan bevatten vaak opwekken van antilichamen en veel werk valideren nieuwe antilichamen. De algemene strategie die in dit protocol is geoptimaliseerd voor grootschalige neuropeptide MALDI IMS-experimenten, inclusief een aantal secties en experimentele omstandigheden. Het protocol is speciaal geoptimaliseerd voor de opioïde peptiden en zal grote impact hebben in toekomstige studies, zoals toegepast in diverse gebieden van onderzoek met inbegrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan pijn en de endogene reactie op drugs verslaving.

1.1 Monsterneming en voorbereiding <ol><li> Isofluraan (Apoteksbolaget AB, Zweden) </li><li> Chirurgische instrumenten, twee scharen, een rongeur, spatel </li><li> Fijngemalen droog ijs </li><li> Aluminium folie en plastic zakken voor de opslag </li><li> Cryostaat (Microm, Heidelberg, Duitsland) </li><li> Indium-tin oxide (ITO) bekleed MALDI dia (Bruker Daltonics, Duitsland) </li><li> optimale snijtemperatuur medium (LGO) (Sakura Finetek Europa, Nederland) </li><li> vacuumexsiccator </li></ol> 1.2 Matrix toepassing <ol><li> Acetonitril (ACN), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) pro-analyse kwaliteit (Merck, Duitsland). </li><li> Trifluorazijnzuur (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> Water werd gezuiverd met Milli-Q zuivering systeem (Millipore, Bedford, MA). </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japan) of Portret 630 spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1,3 Massaspectrometrie <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> FlexImaging software (v 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> Peptide of eiwit-standaardoplossingen (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 Gegevensverwerking <ol><li> Oorsprong v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab versie 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1,5 neuropeptide identificatie <ol><li> Echografie ultrasoonapparaat </li><li> 10 kDa molecular weight cut-off filter (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 gel (Sigma, Duitsland) </li><li> Hypersil kolom (ThermoFisher) </li><li> Pyridine, mierenzuur (FA) acetonitril (ACN), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) pro-analyse kwaliteit (Merck, Duitsland). </li><li> Trifluorazijnzuur (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). </li><li> Agilent 1100 nanoflow LC, microWPS, C18 kolom (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Micro-fractioncollector, Prespotted anchorchip richtplaat (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio Works software (V.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Mascot software (v 2.2 MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep database ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

maldi massaspectrometrie imaging van neuropeptiden bij de ziekte van parkinson

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging massaspectrometrie (IMS) is een krachtige aanpak die de ruimtelijke analyse van moleculen in biologisch weefsel monsters 2 (fig. 1) vergemakkelijkt. Een 12 pm dunne weefselsectie is bedekt met een MALDI-matrix, die desorptie en ionisatie van intacte peptiden en eiwitten die gedetecteerd kan worden met een massa analysator, typisch met een MALDI TOF / TOF massaspectrometer vergemakkelijkt. Over het algemeen honderden pieken kan worden beoordeeld in een enkele rat hersenweefsel sectie. In tegenstelling tot de veelgebruikte beeldvormende technieken, is deze aanpak geen voorafgaande kennis van de moleculen van belang en maakt het mogelijk voor gebruik zonder toezicht en uitgebreide analyse van veelvoudige moleculaire species met behoud van een hoog moleculair specificiteit en sensitiviteit 2. Hier beschrijven we een MALDI IMS-gebaseerde aanpak voor het ophelderen van regio-specifieke verdeling profielen van neuropeptiden in de hersenen van de rat van de ziekte van een diermodel van Parkinson (PD). PD is een veel voorkomende neurodegeneratieve ziekte met een prevalentie van 1% voor mensen ouder dan 65 en ouder 3,4. De meest voorkomende symptomatische behandeling op dopamine vervanging met L-DOPA 5. Maar dit gaat gepaard met ernstige bijwerkingen waaronder onvrijwillige abnormale bewegingen, genaamd L-DOPA-geïnduceerde dyskinesieën (LID) 1,3,6. Een van de belangrijkste moleculaire verandering in deksel een opregulatie van het opioïde precursor prodynorphin mRNA 7. De prodynorfine peptiden moduleren neurotransmissie in hersengebieden die voornamelijk betrokken zijn bij de beheersing van de bewegingen 7,8. Echter, om de exacte opioïde peptiden die afkomstig zijn van verwerking van de neuropeptide voorloper op heden niet bepaald. Daarom hebben we gebruikt MALDI IMS in een diermodel van de ziekte van Parkinson experimentele en L-dopa geïnduceerde dyskinesie. MALDI imaging massaspectrometrie bleek bijzonder gunstig met betrekking tot neuropeptide karakteriseringTIE, omdat veel gebruikte antilichamen gebaseerde aanpak richt zich op bekende peptide sequenties en eerder waargenomen post-translationele modificaties. In tegenstelling MALDI IMS kan ontrafelen nieuwe peptide verwerking van producten en dus onthullen nieuwe moleculaire mechanismen van neuropeptide modulatie van neuronale transmissie. Hoewel het absolute bedrag van neuropeptiden niet kan worden bepaald door middel van MALDI IMS, de relatieve overvloed van peptide-ionen kan worden afgebakend van de massa spectra, het geven van inzicht over het wijzigen van het niveau bij gezondheid en ziekte. In de voorbeelden hier gepresenteerd, werden de piek intensiteiten van prodynorfine B, alfa-neoendorphin en substance P gevonden aanzienlijk worden verhoogd in de dorsolaterale, maar niet de dorsomediale, striatum van de dieren met ernstige dyskinesie met gezicht, romp en orolingual spieren (afb. 5). Bovendien, MALDI IMS bleek een correlatie tussen dyskinesie ernst en de mate van des-tyrosine alfa-neoendorphin, wat neerkomt op een voorheen onbekend mechanisme van functionele inactitie van dynorphins in het striatum het verwijderen van N-terminale tyrosine vermindert de prodynorfine de opioïde-receptor bindende capaciteit 9. Dit is de eerste studie over neuropeptide een karakterisering van het deksel met MALDI IMS en de resultaten benadrukken de mogelijkheden van de techniek voor toepassing in alle gebieden van het biomedisch onderzoek.

Dopamine vervanging farmacotherapie met L-dopa is de meest gebruikte symptomatische behandeling van Parkinson, maar gaat gepaard met bijwerkingen zoals onwillekeurige abnormale bewegingen, genoemd dyskinesie<sup&gt; 1</sup&gt;. Hier wordt een protocol voor MALDI imaging massaspectrometrie gepresenteerd die detecteert veranderingen in de hersenen van de rat neuropeptide niveaus met betrekking tot dyskinesie.

MALDI massaspectrometrie Imaging van neuropeptiden bij de ziekte van Parkinson

MALDI imaging massaspectrometrie (IMS) is een krachtige methode die de ruimtelijke analyse van moleculaire soorten in biologische weefselmonsters faciliteert2 ...

Het hoofddoel van deze procedure is om de ruimtelijke distributie van neuropeptiden, specifiek opioïde peptiden, direct in dunne hersensecties te verduidelijken met behulp van MALDI-imaging massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst weefselsecties van 12 µm dikte te verzamelen uit een snap-gefroren rattenbrein en deze vervolgens te monteren op geleidende glasplaatjes. De tweede stap is het aanbrengen van MALDI-matrix in arrays over de secties met een chemische inkjetprinter, om vervolgens één massaspectrum van elke matrixspot te verkrijgen.Vervolgens worden de volgende peptidepieken gevisualiseerd om het algemene succes van het experiment te waarborgen. Dit wordt gevolgd door inspectie en verwerking van de export van de massaspectra, post-processing van de peptidedata en statistische evaluatie. De laatste stap is het analyseren en valideren van de peptidedata verkregen via moldy imaging mass spectrometry.Uiteindelijk tonen de resultaten significante verschillen aan in de relatieve opioïde peptide-niveaus in verschillende hersengebieden tussen de verschillende behandelingsgroepen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals radio-immuno SAO gel-gebaseerde benaderingen, is dat multi-imaging lokalisatie van behandelingsgeïnduceerde veranderingen mogelijk maakt met behoud van een hoge moleculaire specificiteit. Dit biedt ons op zijn beurt de mogelijkheid om truncatie van post-translationele modificaties te detecteren die voorheen niet werden waargenomen.Personen die nieuw zijn met deze methode zullen in het begin moeite hebben, omdat de techniek een grondige monstervoorbereiding en gegevensverwerking vereist. Hier zal de focus liggen op de kwaliteit van het weefsel, de matrix, het applicatieprotocol, de gegegevensevaluatie en de daaropvolgende validatie-experimenten. Het is essentieel om tijdens de weefseldissectie snel en zorgvuldig te werken om proteolytische degradatie te voorkomen.Na het opofferen van de rat volgens goedgekeurde protocollen, dient de hersenen onmiddellijk te worden verwijderd, overgebracht naar gepoederde droogijs en relatief langzaam te laten bevriezen; bewaar de hersenen vervolgens in een vriezer van -80 °C. Hele hersenen kunnen gedurende meerdere jaren worden bewaard voordat ze worden gesneden, zonder verlies van MS-signaalkwaliteit. Wanneer u klaar bent om met de procedure te beginnen, monteert u de hersenen op de houder met behulp van tissue tech-inbeddingsmedium; voorkom contaminatie van het deel van de hersenen dat gesneden moet worden, aangezien het inbeddingsmedium de ionisatie en desorptie van peptiden verstoort.Snijd bevroren weefsel op een cryostaatmicrotoom in coupes van 12 micron en monteer de weefselcoupes op geleidende MALDI-glasplaatjes. De kleuring van de weefselcoupes kan op dit punt worden uitgevoerd en de kwaliteit van het weefsel kan worden geïnspecteerd. Deze afbeelding toont kristalvioletkleuring van hersenweefsel dat snel is ingevroren in vloeibare stikstof, wat heeft geleid tot scheuren en verscheuringen in het weefsel.Dit weefsel zou niet geschikt zijn voor MALDI-imaging massaspectrometrie met een hoge resolutie, omdat de matrix zal verspreiden en niet gelijkmatig zal kristalliseren. Droog de coupes gedurende 15 minuten onder vacuüm en bewaar de slides bij -80 °C tot verder gebruik. Weefselcoupes moeten zo kort mogelijk na het snijden worden geanalyseerd, zelfs als ze bij -80 °C zijn bewaard. Ontdooi eerst de coupes gedurende één uur in een desiccator, was vervolgens de slides met de coupes in 70% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 10 seconden, gevolgd door twee wasbeurten in 95% ethanol bij kamertemperatuur van telkens 10 seconden. Droog de slides na het wassen gedurende 10 minuten in een desiccator.Inspecteer de coupes onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de weefselcoupes van goede kwaliteit zijn, zonder weefselvervorming, microscheuren of kleine barstjes die de kwaliteit van de EMS-mallen kunnen beïnvloeden. Bereid vervolgens een verse matrixoplossing voor bestaande uit 50 mg/mL DHB en 50% methanol, 10% 150 mM ammoniumacetaat en 0,3% trifluorazijnzuur in water. Scan de glashouder met de weefselcoupe en richt de houder uit op de respectievelijke referentiepunten met behulp van de beeldanalysefunctie in de chipsoftware.Select vervolgens de passende parameters voor de matrixapplicatie voor zowel het hersengebied als de gerichte analyten. Specificeer daarna de ruimtelijke resolutie. Pas nu de matrix toe met behulp van het geoptimaliseerde protocol op de chemical link Jett-printer.Scan de secties met de uiteindelijke matrix-spots en sla de afbeelding op vóór de aanvraag van meerdere gegevens. Dit zal later worden gebruikt om de matrix-deposities te kruisrefereren met de motorcoördinaten van de MALDI-stage. Indien niet onmiddellijk gebruikt, kunnen de secties met matrix-spots worden bewaard in een droogmiddel onder vacuüm tot ze nodig zijn.Voor de meeste experimenten worden meerdere secties tegelijkertijd geanalyseerd, zoals hier te zien is. Elke objectglashouder is geschikt voor twee glasplaatjes, waardoor voor alle houders meerdere sets van twee geanalyseerd moeten worden. De acquisitiemethoden en -parameters van de MALDI-TOF moeten gelijk blijven, maar de peptide-massakalibraties moeten voor elk plaatje worden gecontroleerd.Optimaliseer vervolgens de acquisitieparameters op het weefselmonster, inclusief de laserfocus en de laserintensiteit. Voer daarna het aantal shots in dat nodig is om een optimaal MS-signaal te verkrijgen zonder de basislijn te verhogen, de piekresolutie te verminderen, de detector te verzadigen of matrix van naburige matrixdeposities te ablateren, en selecteer de laserbeweging.Schat het maximale aantal shots dat per matrixspot kan worden genomen totdat er alleen nog ruis wordt gedetecteerd. Er worden 600 shots verzameld van elke matrixdepositie in stappen van 25 shots, voor een totaal van 24 stappen met een willekeurig bewegingspatroon. Vergelijk de scans van alle gespotte secties met de motorcoördinaten van de MALDI-stage met behulp van de flex-imagingsoftware.Voer vervolgens met behulp van software voor het automatisch uitvoeren van batches de gegevensverwerving uit in batchmodus. Gebruik datavisualisatie-instrumenten zoals Flex imaging om de Maori IMS-beelden visueel te inspecteren om de distributies van de piekintensiteit te evalueren en te bepalen of deze distributies gerelateerd zijn aan weefselkenmerken, de kwaliteit van de spots of normalisatie-effecten. Dit voorbeeld toont de distributie van 10 verschillende peptidepieken in negen verschillende dieren.De totale ionenstroom of TIC die wordt gebruikt voor normalisatie is in het wit weergegeven. De TIC is de som van elke intensiteitswaarde in een massaspectrum. De TIC-waarde is zeer laag bij dier drie, en de peptidebeelden vertonen meer ruis dan specifieke informatie.Het brein van dier nummer zes vertoont onderaan de sectie een gebied met zeer hoge TIC-waarden. Dit is terug te zien als abnormaal hoge intensiteiten in dat gebied van de peptidebeelden, C en D. Dit is een potentieel effect van overnormalisatie dat de data-analyse kan beïnvloeden. Overnormalisatie-effecten kunnen leiden tot onnauwkeurige resultaten als ze specifiek slechts in één behandelgroep aanwezig zijn.In dit voorbeeld is de TIC significant hoger voor groep C, wat de individuele piekintensiteiten abnormaal kan beïnvloeden. Bijvoorbeeld: in de ruwe gegevens is de gemiddelde piekintensiteit voor cytochroom C hoger voor groep C dan voor groep B, maar na normalisatie is de piekintensiteit nu lager. Voor groep C kan dit leiden tot ernstige misinterpretaties van de resultaten.Het is belangrijk om altijd de gemiddelde TIC voor elke behandelgroep te berekenen voordat men overgaat tot uitgebreide gegevensvalidatie. Vervolgens, om het interessegebied te definiëren, is het belangrijk om te beseffen dat het pro-dynorfine-messenger-RNA wordt vertaald in het 14 kilodalton pro-dynorfine-propeptide. In striatale neuronen wordt het pro-dynorfine verpakt in blaasjes die via dendrieten naar andere striatale neuronen worden getransporteerd, en via axonen naar de substantia nigra, enkele millimeters van het cellichaam verwijderd.De blaasjes bevatten enzymen die het propeptide verder verwerken tot dinorfine-peptiden, zoals alpha-neo-endorfine dinorfine A of dinorfine B. Elk hiervan kan verschillende opiaatreceptoren activeren na het vrijkomen in de doelstructuur, de substantia nigra; de dinorfines worden vervolgens verder verwerkt en afgebroken door endo- en exopeptidasen. Sommige van deze peptiden kunnen alleen via massaspectrometrie worden gedetecteerd, aangezien bestaande antilichamen enkel zich richten op het C-terminale uiteinde van de peptiden en niet op het N-terminale uiteinde. De Y-G-G-F-L sequentie is verantwoordelijk voor de activatie van de opioïdreceptor; de dinorfine-producerende cellen bevinden zich in de AUM en projecteren naar de substantia nigra.Daarom werden in het volgende experiment zowel het striaum als de substantia nigra geanalyseerd met MALDI-IMS, waarbij de spectra van elk interessegebied werden bekeken. Het dorsomediale en dorsolaterale striaum en de mediale en laterale substantia nigra werden gedefinieerd in de Flex-analysesoftware en geëxporteerd voor data-analyse. Voor datareductie werd piekdetectie uitgevoerd met behulp van piekzoektools die in verschillende softwarepakketten zijn opgenomen.Gebruik bijvoorbeeld piekanalyse in Origin of MS Peaks in Matlab. Exporteer de pieklijst van alle spectra als één enkel tab-gescheiden tekstbestand, bepaal de start- en stopgrenzen van de pieken met behulp van software zoals de Freeway P bin, bereken de oppervlakte onder de curve tussen de piekgrenzen en gebruik deze voor statistische analyse. De reproduceerbaarheid van MS tussen behandelingsgroepen kan worden beoordeeld door de gemiddelde MS-trace en de standaardfout voor elke massawaarde te berekenen.In dit voorbeeld worden de gemiddelde spectra van de intacte controle nigra gebruikt om de variabiliteit over het geanalyseerde massabereik te beoordelen. Een goede reproduceerbaarheid is zichtbaar aangezien de piekintensiteiten in beide controlegroepen gelijk zijn en de standaarddeviatie laag is. Dit waarborgt een geldige statistische analyse.Als de datasets een hoge mate van variatie vertonen, is het bijna altijd noodzakelijk om het Maori IMS-experiment te herhalen, waarbij experimentele variatiebronnen zoveel mogelijk worden beperkt. Gewoonlijk verwerken we zoveel mogelijk secties en dieren in één enkele sessie, waarbij soms meerdere personen in ploegendiensten werken. In sommige gevallen is dit echter nog steeds onvoldoende en kunnen andere strategieën worden toegepast.Wanneer bepaalde spectra bijvoorbeeld uit ruis bestaan, kan dit worden vastgesteld door de frequentieverdeling van de TIC uit te zetten, waarna een drempelwaarde kan worden gebruikt om suboptimale gegevens te elimineren. Een andere manier om gegevens te evalueren is door alle pieken van twee dieren binnen dezelfde groep tegen elkaar uit te zetten. Als de piekintensiteiten in beide dieren gelijk zijn, vertoont de intensiteitsplot een rechte, smalle lijn.Als één dier spectrale gegevens van lage kwaliteit bevat, vertoont de grafiek doorgaans asymmetrische verschuivingen ten opzichte van de rechte lijn, zoals rechts te zien is. Voor de identificatie van de peptidevolgorde wordt een peptid Dominic-analyse uitgevoerd op extracten van rattenbreinweefsel met behulp van multidimensionale vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie met hoge resolutie. Kort samengevat worden neuropeptiden geëxtraheerd uit secties van het rattenbrein en vooraf gefractioneerd middels sterke kationuitwisselingschromatografie.De verschillende fracties worden vervolgens verder gescheiden met behulp van nanoflow reverse phase HPLC. Vervolgens worden de neuropeptiden gekarakteriseerd middels electrospray tandem massaspectrometrie met behulp van hybride lineaire ionenvanger Fourier-transform ionencyclotronresonantie-instrumenten; ten slotte wordt de peptidevolgorde geïdentificeerd via database-matching. Voor sommige neuropeptiden zijn specifieke antilichamen beschikbaar en immunohistochemische experimenten kunnen zowel de peptide-identificatie als de experimentele resultaten valideren. De resolutie is hoger dan bij MALDI-imaging massaspectrometrie en er kan aanvullende informatie worden verkregen.In dit voorbeeld zijn immunoreactieve zenuwvezels in de hippocampus (linksboven) en de substantia nigra (linksonder) zichtbaar, terwijl de Maori IMS-afbeelding rechtsonder de lokalisatie op het niveau van verschillende hersengebieden onthult. Het ultieme bewijs dat een piek-massa ondubbelzinnig aan een specifiek peptide kan worden toegewezen, wordt geleverd door moldy IMS uit te voeren op peptide-knockout-dieren in de pronin-knockout-muis. Verschillende pieken, aangegeven door de pijlen, ontbreken in de knockout, maar niet in de wildtype-controle.Niet-gerelateerde peptidepieken, zoals substantie P en P ink, vertonen geen verschil tussen knockout- en controledieren. De piekintensiteiten van dinorfine B en alfa-neo-endorfine zijn significant verhoogd in de zes-hydroxydopamine-laesie. Parkinsoniaanse stri AUM van sterk dyskinesische dieren, zoals aangegeven door de pijlen, vergeleken met de groep met lage dyskinesie en de laesiecontrolegroep.Statistische analyse onthulde ook een significante toename van een peptide-massa die overeenkomt met getrunceerd alfa-neo-endorfine waarbij de terminale tyrosine aan het uiteinde was verwijderd. Bij visuele inspectie tonen de imaging-resultaten een hoge colokalisatie van de ouder-di-norphine-peptiden, weergegeven in het groen, en de bijbehorende DES-tyrosine-metabolieten, weergegeven in het rood; geel duidt op regionale overlap in het overlay-paneel rechts. Het grote potentieel van deze techniek wordt benadrukt door de bevindingen met betrekking tot selectieve peptideverwerking in verschillende hersenstructuren die met andere methoden niet kunnen worden gedetecteerd.Hier zijn specifieke DES-tyrosinemetabolieten, weergegeven in het rood, gecolokaliseerd met het ouderpeptide, weergegeven in het groen, en werden deze alleen waargenomen in het striatum, maar niet in de substantia nigra van dyskinetische ratten. In de afbeelding van de substantia nigra onthulde de beeldanalyse dat het degradatieproduct lu en kelin arch, weergegeven in het rood, invers gelokaliseerd was ten opzichte van di norphine B, weergegeven in het groen, wat aangeeft dat di norphine B tijdens dyskinesie lokaal werd afgegeven in de laterale substantia nigra en vervolgens werd gemetaboliseerd tot lu en careful in AR One set-up. Een enkel experiment met MALDI-imaging kan in één of twee dagen worden uitgevoerd voor monsterbereiding en data-acquisitie.Hierna volgt nog een dag of twee voor de evaluatie van de gegevens. Afhankelijk van de steekproefomvang zouden de validatie-experimenten, mits correct uitgevoerd, nog een dag of twee aan praktijkexperimenten in het laboratorium vereisen. Het is belangrijk om in de volgende stappen bijzondere zorgvuldigheid in acht te nemen.De dissectie en het invriezen van weefsel moeten snel gebeuren om degradatie van pep te voorkomen; het wasprotocol en het protocol voor de matrixapplicatie moeten voor elk experiment worden geoptimaliseerd. De data-evaluatie en statistische analyse moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om fout-positieven als gevolg van overnormalisatie-effecten of gebrekkige piekdetectie te vermijden.

maldi-imaging-mass-spectrometry-neuropeptides-parkinson-s

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Een ELISA die een nieuwe kwantitatieve aanpak biedt, wordt beschreven. Het detecteert specifiek ziekte-geassocieerd α-synucleïne (αSD) in een transgenisch muismodel (M83) van synucleïnopathie door gebruik te maken van verschillende antilichamen tegen ofwel de Ser129 gefosforyleerde αS-vorm of het C-terminale deel van het eiwit.

Opsporing van de ziekte-geassocieerde α-synucleïne door Enhanced ELISA in de hersenen van transgene muizen door overexpressie van Human A53T Gemuteerde α-synucleïne

Mutaties in het leucine rijke reinase 2 gen (LRRK2) veroorzaken erfelijke de ziekte van Parkinson. We hebben een eenvoudige en robuuste methode ontwikkeld voor het beoordelen van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van Rab10 bij menselijke perifere bloedneutrofielen. Dit kan helpen bij het identificeren van personen met een verhoogde LRRK2 kinase traject activiteit.

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.

Semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neurondichtheid in de substantia Nigra van knaagdiermodellen met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse

Dit protocol laat zien hoe neuromelanine-gevoelige magnetische resonantie beeldvormingsgegevens van de substantia nigra kunnen worden verkregen.

Gestandaardiseerde data-acquisitie voor neuromelanine-gevoelige magnetische resonantie beeldvorming van de Substantia Nigra

Hier wordt een robuust protocol gepresenteerd voor het isoleren van neuromelaninekorrels uit menselijk post-mortem substantia nigra pars compacta weefsel via lasermicrodissectie. Dit herziene en geoptimaliseerde protocol minimaliseert massaal de vereiste tijd voor monsterverzameling, vermindert de vereiste monsterhoeveelheid en verbetert de identificatie en kwantificering van eiwitten door LC-MS / MS-analyse.

Laser Microdissection-Based Protocol voor de LC-MS/MS analyse van het proteomische profiel van Neuromelanine Granules

Massaspectrometrische karakterisering van neuropeptiden biedt sequentie-, kwantificerings- en lokalisatie-informatie. Deze geoptimaliseerde workflow is niet alleen nuttig voor neuropeptidestudies, maar ook voor andere endogene peptiden. De protocollen die hier worden verstrekt, beschrijven monstervoorbereiding, MS-acquisitie, MS-analyse en databasegeneratie van neuropeptiden met behulp van LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting en MALDI-MS-beeldvorming.

Veelzijdig massaspectrometrisch onderzoek van neuropeptiden in Callinectes sapidus

Een handige zwaartekracht-gevoede perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis wordt gepresenteerd. Immunofluorescentie detectie van gefosforyleerd α-synucleïne wordt aangetoond in een muismodel van de ziekte van Parkinson. Dit werk beschrijft ook uitgebreid de transcardiale perfusie, dissectie, weefselbevriezing / inbedding en bevroren sectiestappen.

Een zwaartekracht-gevoede transcardiale perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis

Deze studie presenteert een methode om de morfologie van mitochondriën te analyseren op basis van immunokleuring en beeldanalyse in hersenweefsel van muizen in situ. Het beschrijft ook hoe dit het mogelijk maakt om veranderingen in de mitochondriale morfologie te detecteren die worden veroorzaakt door eiwitaggregatie in modellen voor de ziekte van Parkinson.

Histologisch onderzoek van mitochondriale morfologie in een model voor de ziekte van Parkinson

Een protocol voor het uitvoeren van unilaterale 6-OHDA letsels van de mediale voorhersenen bundel bij muizen wordt beschreven. Deze methode heeft een laag sterftecijfer (13,3%) met 89% van de overlevende dieren die&gt; 95% verlies van striatale dopamine en 90,63 ± -4,02% ipsiversive rotatie voorkeur voor de kant van de laesie.

Ontwikkeling van een eenzijdig-gelaedeerde 6-OHDA muismodel van de ziekte van Parkinson

Ontdek MALDI massaspectrometrie imaging om neuropeptiden in rattenhersenen te analyseren bij de ziekte van Parkinson. Deze methode onthult ruimtelijke verdeling van behandelingsgerelateerde veranderingen met hoge moleculaire specificiteit.

MALDI massaspectrometrie Imaging van neuropeptiden bij de ziekte van Parkinson

Meer video's verkennen