Name: Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Leer kwantitatieve live cell fluorescentie-microscopie voor subnucleaire organisatie in Schizosaccharomyces pombe. Deze methode meet chromatindynamiek onder verschillende groeiomstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Professor Hiraoka voor het sturen van stammen. Wij erkennen de steun van de Goran Gustafssons Foundation en de Zweedse Cancer Society (2008/939).

1. Fission gistcultuur <ol><li> Bereid Edinburgh Minimale Media (EMM) en EMM zonder ammoniumchloride (EMM-N) 8. Ter vermindering van autofluorescentie de glucose-oplossing mag niet worden geautoclaveerd, maar in plaats daarvan filter gesteriliseerd met behulp van een 0,2 um filter en vervolgens toegevoegd aan de geautoclaveerde media. </li><li> Inoculeren kernsplijting gistcellen vers gekweekt op een agar plaat met rich media, YEA 8, in 3 ml EMM vloeibare media met filter gesteriliseerd glucose. Gebruik 13ml buizen met een licht geduwd op de dop om een ​​goede ventilatie van de cellen te verzekeren. Laat de cellen groeien door schudden ze met 225 rpm in 30 ° C. Houd de cellen groeien in log-fase (1 x 10 6 - 2 X 10 7 cellen / ml) gedurende 2 dagen door te tellen ze met behulp van een Burker kamer gevolgd door passende verdunning, elke ochtend en avond. </li><li> Op de dag van het experiment zorg ervoor dat cellen in het begin van de log-fase, 5 x 10 6 - 1 x 10 7 cellen / ml. </li><li> Te verhongeren tHij cellen voor stikstof gedurende 20 minuten overschakelen van EMM media tot EMM-N media. Dit wordt gedaan door het oogsten van 3 ml van cellen in een 1,5 ml Eppendorf buis in een bench top centrifuge maximaal 1,5 RCF als centrifugeren bij een hogere snelheid kan leiden tot een stressrespons bij splitsing gist 9. Gebruik de dubbele spinning techniek, betekenis; eerste spin gedurende 2 minuten, draai dan de eppendorfbuisje 180 ° en de spin opnieuw voor 1,5 RCF 2 min 10. Dit helpt om alle cellen te verzamelen in een pellet op de bodem van de buis. Was eenmaal met EMM-N en vervolgens de pellet te lossen in EMM-N en incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 30 ° C schudden bij 225 toeren per minuut en ga dan verder naar punt 2. Monstervoorbereiding. </li></ol> 2. Monstervoorbereiding <ol><li> Oogst 1,5 ml van de cellen in een 1,5 ml Eppendorf buis in een bench top centrifuge maximaal 1,5 RCF als centrifugeren bij een hogere snelheid kan leiden tot een stressrespons bij splitsing gist 9. Gebruik de dubbele spinning techniek, meaning, eerste spin gedurende 2 minuten, draai dan de eppendorfbuisje 180 ° en de spin opnieuw voor 1,5 RCF gedurende 2 minuten 10. Dit helpt om alle cellen te verzamelen in een pellet op de bodem van de buis. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, maar laat 10-15 pi en resuspendeer de cellen in de overige media. Als alternatief toe te voegen 10 pi van verse media naar de cel pellet resuspenderen. </li><li> Zorg ervoor dat u helder glas dia's en glazen deksel (geen 1.5). Normaal gesproken hoeft u ze niet te schoon, maar zorg ervoor dat ze niet vol stof. </li><li> Haal uit de diepvries een hoeveelheid van een voorraad oplossing van 1mg/ml lectine dat filter gesteriliseerd. De lectine oplossing kan opnieuw worden ingevroren een paar keer. De lectine wordt gebruikt om de gistcellen op het dekglas op te lossen. </li><li> Plaats 5 pi van EMM met filter gesteriliseerd glucose op de doelstelling glas. </li><li> Plaats 5 pi van lectine-oplossing in de hoek van het deksel glas. Vervolgens plaats 5 pi van celkweek in dezelfde hoek, dwz in de lectine laten vallen. Meng door pipetteren een paar keer en vervolgens verspreiding van de celcultuur-lectine mix in de dekking van glas met behulp van de lange zijde van de pipet tip. Afhankelijk van de dichtheid van uw mobiele mengsel laat alles of tot overmaat vloeistof opzuigen in de tegenovergestelde hoek van het deksel glas. </li><li> Plaats het deksel glas, boven op, met een zijde over de doelstelling glas en aan de andere kant op de bank. Laat de dekking van glas droge een beetje voor een paar minuten. Het moet absoluut niet helemaal droog, maar het moet niet te veel vloeistof op het glas. </li><li> Plaats het deksel glas met een ongeveer 70 ° engel uit de doelstelling glas door de daling van EMM. Laat de dekking van glas, zodat het naar beneden vallen boven in de daling van EMM. </li><li> Voor afdichting van de randen met siliconen vet voor te bereiden een 2 ml spuit. Snijd de brede einde van een 200 ul tip en bevestig deze aan de spuit. Vul de spuit met ongeveer 1 mL van siliconenvet. Een fijne lijn van silicium wordt toegepast op de randen van de dekking van glas door zachtjes pusHing de zuiger van de spuit. Nu heb je een kleine groei kamer van S. pombe cellen. </li></ol> 3. Microscopie <ol><li> Initialiseer de fluorescentie microscopie door het aanzetten van de kwik / xenon lamp, de microscoop en de computer. Plaats de gist groei kamer in de fluorescentie microscoop. Gebruik een 63 X doelstelling of een 100 X objectief met NA = 1.3 of hoger. Indien een olie-objectief wordt gebruikt, voeg olie. </li><li> Gebruik de heldere veld om de cellen te vinden en een scherp beeld te krijgen. </li><li> De instellingen voor de fluorescentie microscopie variëren, afhankelijk van de fluorochromen wordt gebruikt om de gistcellen en de microscoop label. We maken gebruik van een confocale microscoop Zeiss LSM 700 laser scanning microscoop met Plan-Apochromat 63x olie objectief lens (NA = 1.4) met de 16-lijn gemiddelde vlak scan setting. De pinhole moet worden ingesteld op 1-1,1 Airy eenheden, die een optisch schijfje van 0,8 mm geeft. We ontdekken GFP in Spoor 1 met behulp van het filter voor Alexa 488 met een beam splitter bij 582 nm, waardoor detecting golflengten tussen 488 en 582 nm. In Spoor 2 gebruiken we een filter set optimaal voor mCherry het gebruik van een beam splitter bij 578 nm, dus het detecteren van golflengten tussen 578 en 600 nm. Dit betekent dat in Spoor 2 zowel de mRFP (SPB) en NG (mCherry) worden gedetecteerd. </li><li> Neem zo veel foto's nodig om te kunnen meten in 60 verschillende cellen voor elke stam. Meestal 15 foto's van onafhankelijke microscopie velden zijn genoeg. Het verdient aanbeveling dat een nieuwe groei kamer met verse cellen is gemaakt als uw microscopie tijd meer dan 60 minuten. </li></ol> 4. Kwantitatieve meting van subcellulaire afstanden <ol><li> Open de foto's in de Zeiss Zen-Light Edition programma. Met behulp van de metingen gereedschap meet de afstand in um tussen de verschillende fluorochromen in alle cellen waar alle signalen worden in hetzelfde brandvlak worden geplaatst. Stel de lichtintensiteit en het contrast naar het midden van het fluorescerende signaal te identificeren. Deze vereenvoudigde protocol maakt gebruik van slechts twee verschillende colours en dus de SPB en NM zijn in hetzelfde kanaal. De SPB is uitgekozen door de grote ronde structuur in de NM. Overdracht van de afstanden tot een kladblok blad. Maatregel ten minste 60 cellen. Andere programma's zoals ImageJ kunnen ook worden gebruikt om de afstand te meten, maar Zeiss Zen Light heeft de voorkeur vanwege de hogere resolutie van het beeld en het gemak om in te zoomen en met behulp van dat programma. Foto's in LSM-formaat geopend in ImageJ zal de twee kanalen op de top van elkaar. Om een ​​foto met beide kanalen, eerste splitsing van de twee kanalen en daarna samen te voegen. Daarna de line tool kan worden gebruikt om de afstanden zoals hierboven beschreven te meten. </li><li> Vergelijk de gemiddelde of de mediaan subcellulaire afstanden tussen de verschillende stammen en behandelingen met behulp van een statistisch programma, bijvoorbeeld t-test of Mann-Whitney Rank Sum Test, bijvoorbeeld door het gebruik van de SigmaStat-3.5-software. Vaak de gegevens niet normaal verdeeld, omdat er een selectie voor cellen met kortere wordenafstanden tussen de fluorescerende signalen, omdat alle signalen dienen te worden in hetzelfde focal plane te meten. Een t-test kan alleen worden gebruikt wanneer de data een normale verdeling, terwijl een Mann-Whitney Rank Sum Test maakt de vergelijking van gegevens sets die normale verdeling ontbreekt. In een t-test het gemiddelde van twee verschillende datasets worden vergeleken, terwijl in een Mann-Whitney Rank Sum Test de mediaan wordt vergeleken. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Strain PJ1185: (h + + his7:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 Laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18 Leu1-32 ade6-DN / N) werd gekweekt in EMM . Een monster werd ingetrokken en gemonteerd in een kleine groei kamer en foto's werden genomen (Fig. 1A + N). Vervolgens werd de groei van media werd vervangen door EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), en de cellen werden grown gedurende 15 minuten tijdens het schudden. De stikstof verhongerde cellen werden vervolgens gemonteerd in een groei kamer met EMM-N en de foto's zijn genomen (fig. 1A-N). Het meetinstrument werd gebruikt om de afstand tussen de locus (GFP) en het SPB (Fig. 1B en tabel 1) te meten. Daarnaast werd de afstand tussen de locus (GFP) en de NM gemeten (Fig. 1B en tabel 2). De mediane subcellulaire afstanden voor en na de stikstof uitputting werden vergeleken met behulp van de SigmaStat-3.5-software (tabel 3). Er was een statistisch significante verschuiving in de lokalisatie van het gen cluster af te stappen van de NM naar de SBP. De gegevens meten van de afstand tussen het GFP en de SBP had een normale verdeling en daarmee de gemiddelde afstanden (1.777 um + N en 1587 um-N) kan vergeleken worden met behulp van een t-test (tabel 1 en 3). Er was een significant verschil tussen de twee gemiddelde waarden (P = 0.008, t-test). De gegevens meten van de afstand tussen het GFP en NM niet over een normale distribution en dus ook de mediane afstanden (0 um + N en 0.390 um-N) werden vergeleken met behulp van een Mann-Whitney Rank Sum test (tabel 2 en 3). Er was een significant verschil tussen de twee mediane waarden (p &lt;0,001, Mann-Whitney Rank Sum test). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De lokalisatie van een cluster van genen genaamd Chr1, gekenmerkt door GFP, veranderde na de stikstof honger. (A) Linkerkolom, + N, een vertegenwoordiger celkern van een cel gegroeid in EMM rechter kolom,-N, een vertegenwoordiger celkern van een cel gegroeid in EMM-N. Groen is het GFP-signaal het labelen van de Chr1 cluster, rood is de mRFP en mCherry de etikettering van de SPB-en NM, respectievelijk. (B) Zelfde celkern als (A), maar nu met de gemeten subnucleaire afstanden, geel: de diameter van de celkern, blauw: de afstand tussen SPB en GFP signaal en roze: de afstand tussen de GFP-signaal en het nucleaire membraan. <pclass alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg"></pclass> <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabel 1"> <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabel 1"> Tabel 1. De gemeten subnucleaire afstanden in um van de PJ1185 stam gekweekt in EMM. Eerste rij, diameter van de cel (d), tweede rij, de afstand tussen het GFP en het SPB, derde rij, de afstand tussen het GFP en de NM. <img alt="Tabel 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabel 2"> <img alt="Tabel 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabel 2"> <img alt="Tabel 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabel 2"> Tabel 2. De gemeten subnucleaire afstanden in um van de PJ1185 stam gekweekt in EMM-N. Eerste rij, diameter van de cel (d), tweede rij, de afstand tussen het GFP en het SPB, derde rij, de afstand tussen het GFP en de NM. <imgalt src='"/' files></imgalt> Tabel 3. Beschrijvende statistiek van de waargenomen subnucleaire afstanden in stam PJ1185 voor (+ N) en na (-N) stikstof honger. Eerste rij: aantal cellen gemeten, tweede rij: gemiddelde diameter (d), derde rij: mediaan diameter (d), vierde rij: gemiddelde afstand tussen het GFP en SPB, vijfde rij: mediaan afstanden tussen de GFP en NM.

<ol><li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li>
<li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li>
<li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li>
<li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li>
<li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li>
<li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Res%22%5BJournal%5D)">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li>
<li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cut11%28%2B%29%3A+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li>
<li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li>
<li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li>
<li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li>
<li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+IM+%22Fluorescence+microscopy+in+yeast%22">Fluorescence microscopy in yeast</a>. Allan, V. J. , University Press. Oxford. (2000).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li>
<li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Tijdens de laatste tien jaar is het gebruik van live cell imaging aan cellulaire gebeurtenissen monitoren is steeds populairder geworden. Het begon met het gebruik van Green Fluorescence Protein van kwallen Aequorea victoria en nu veel verschillende fluorochromen zijn verkrijgbaar uitzenden fluorescentie via een breed spectra van cyaan (475 nm) te ver rood (648 nm) 11. Een van de grote voordelen van live cell imaging meer dan immunofluorescentie is dat de cellen niet worden vastgesteld door formaldehyde of ethanol / aceton behandeling voor microscopie, dus het vermijden van mogelijke voorwerpen uit de fixatie proces. Daarnaast, live cell imaging biedt de mogelijkheid om individuele cellen te volgen en foto&#39;s nemen met regelmatige tussenpozen gedurende uren of dagen van incubatie, waardoor het mogelijk is om films van de cellulaire gebeurtenissen 12 jaar krijgen. Cellen van zoogdieren hebben het voordeel van het hebben van een groter formaat, met een diameter van ongeveer 100 micrometer, in vergelijking met de kleinere gistcel met een diameter van ongeveer 3-4 &amp;mu; m. Aan de andere kant, het voordeel met gist is het gemakkelijk te manipuleren genoom. Homologe recombinatie gebeurt zeer efficiënt in gist en wordt gebruikt om eiwitten van belang zekering aan verschillende fluorochromen 3. Bovendien, met behulp van gerichte integratie van Laco sequenties en volgende expressie van LacR-GFP-eiwit maakt de detectie van een specifiek deel van het genoom in de celkern 2. Met behulp van S. pombe cellen in de microscopie heeft bijkomende voordelen, omdat ze natuurlijk eencellige organismen die groeien met een snelle generatie tijd in low-cost celcultuur condities. Bovendien, S. pombe is een uitstekend model eukaryotische organisme omdat het metazoïsche homologe genen. Een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is autofluorescentie in de gistcel verstoren van de detectie van het werkelijke signaal. Dit probleem kan worden ondervangen door met minimale groei van media met een filter gesteriliseerde glucose in plaats van geautoclaveerd. InDaarnaast heeft de gistcellen moeten worden gekweekt voor 2 dagen in log-fase voor het opspannen. Het protocol hier gepresenteerde biedt een relatief eenvoudige, maar toch kwantitatieve methode om de subcellulaire lokalisatie van eiwitten te bepalen binnen de gistcel. Bovendien is door het nemen van foto&#39;s op verschillende tijdstippen kunnen we volgen cellulaire gebeurtenissen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> Lectine </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Siliconenvet </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser scanning microscoop LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> Andere confocale microscoop kunnen worden gebruikt. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Alle software voor statistische analyse kunnen worden gebruikt. </td></tr></tbody></table>

kwantitatieve live cell fluorescentie-microscopie analyse van fission yeast

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Verschillende microscopie technieken beschikbaar vandaag dat een specifiek eiwit kan detecteren in de cel. Tijdens het laatste decennium live cell imaging met behulp van fluorochromen als Green Fluorescent Protein (GFP) direct aan het eiwit van belang is steeds populairder geworden: 1. Met behulp van GFP en soortgelijke fluorochromen de subcellulaire localisaties en bewegingen van eiwitten kan worden gedetecteerd in een fluorescentiemicroscoop. Bovendien, ook de subnucleaire lokalisatie van een bepaalde regio van een chromosoom kan worden bestudeerd met behulp van deze techniek. GFP is gefuseerd met de Lac-repressor eiwit (LacR) en ectopisch uitgedrukt in de cel waar tandem repeats van de LACO sequentie werd opgenomen in het gebied van de rente op het chromosoom 2. De LacR-GFP zal binden aan de Laco herhaalt en dat gebied van het genoom wordt zichtbaar als een groene stip in de fluorescentie microscoop. Gist is vooral geschikt voor dit type van manipulatie sinds homologerecombinatie is zeer efficiënt en op basis waarvan gerichte integratie van de Laco herhalingen en ontworpen fusie-eiwitten met GFP 3. Hier beschrijven we een kwantitatieve methode voor live cell analyse van de splitsing gist. Aanvullende protocollen voor live cell analyse van kernsplijting gist kan worden gevonden, bijvoorbeeld over hoe je een filmpje van de meiotische chromosomale gedrag van 4 te maken. In dit specifieke experiment richten we ons op subnucleaire organisatie en hoe het wordt aangetast tijdens geninductie. We hebben het label een gen cluster, genaamd Chr1, door de introductie van Laco bindingsplaatsen in de buurt van de genen. Het gen cluster is verrijkt voor de genen die vroege geïnduceerd worden tijdens de stikstof uithongering van kernsplijting gist 5. In de stam van de kernmembraan (NM) wordt aangeduid door de bevestiging van mCherry aan de NM eiwit Cut11 die aanleiding geven tot een rood fluorescerend signaal. De spindel Pole lichaam (SPB) verbinding Sid4 is gefuseerd met Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6 </sup&gt;. In vegetatief groeiende gistcellen de centromeren zijn altijd verbonden met de SPB, dat is ingebed in de NM 7. De SPB is geïdentificeerd als een grote ronde structuur in de NM. Door de beeldvorming vóór en 20 minuten na uitputting van de stikstofbron kunnen we bepalen de afstand tussen het gen cluster (GFP) en de NM / SPB. De gemiddelde of de mediaan afstanden voor en na uitputting stikstof worden vergeleken, en we kunnen dus kwantificeren of er is een verschuiving in de subcellulaire lokalisatie van het gen cluster na stikstof uitputting.

De splijting gist,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt;, Is een goed model systeem om elementaire cellulaire processen te bestuderen. Hier beschrijven we een methode om kwantitatieve live cell analyse van de splitsing gist uit te voeren. In dit specifieke experiment richten we ons op de organisatie van het genoom in de celkern, maar de methode kan ook gebruikt worden om cytosolische factoren te bestuderen.

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Tegenwoordig zijn er verschillende microscopietechnieken beschikbaar waarmee een specifiek eiwit in de cel kan worden gedetecteerd. Gedurende het afgelopen decennium is live-cell imaging met behulp van ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de subnucleaire organisatie in gistcellen kwantitatief te meten en te bepalen hoe deze wordt beïnvloed door veranderingen in groeicondities of mutaties. Dit wordt bereikt door gistcellen te kweken tot de log-fase onder condities die autofluorescentie minimaliseren. Vervolgens worden de cellen in een groeikamer geplaatst voor observatie onder de microscoop.Vervolgens worden afbeeldingen gemaakt om de afstand tussen verschillende fluorescentielabelstructuren in de cel te meten. De resultaten tonen verschillen in de niet-nucleaire organisatie aan, welke afhankelijk is van het wijzigen van de nutritionele omstandigheden tijdens de groei van de gistcultuur. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de epigenetica over de wisselwerking tussen subnucleaire organisatie van chromatine en genregulatie.Voor vis en gist wordt gestart met het bereiden van Edinburgh minimaal medium of EMM, en EMM met ammoniumchloride om autofluorescentie te verminderen, in plaats van te autoclaveren. Gebruik een 0,2 micron filter om de glucosoplossing te steriliseren en voeg deze toe aan de geautoclaveerde media. Inoculeer drie milliliter EMM in 30 milliliter buizen met vis- en gistcellen.Vers opgekweekt op een agarplaat in het rijke medium YEA, sluit de buizen lichtjes af met een dop en incubeer de cellen in een schudmachine bij 225 RPM en 30 graden Celsius. Houd de cellen gedurende twee dagen in de logfase door ze elke ochtend en avond te tellen met een birka-kamertje en ze te verdunnen tot de juiste dichtheid. Op de dag van het experiment.De cellen moeten zich in een vroege log-fase bevinden ten opzichte van de stikstofvoorraad. Volg de procedure beschreven in het schriftelijke protocol om de cellen als één pellet onderin een centrifugebuis te verzamelen; centrifugeer 1,5 milliliter cellen in een Eppendorf-buis bij maximaal 1,5 RCF door de buis eerst twee minuten te centrifugeren en deze vervolgens 180 graden te draaien voor een tweede spin van twee minuten. Verwijder alle supernatant behalve 10 tot 15 µL en resuspendeer de cellen in het resterende medium, waarna een aliquot van 1 mg/mL filtergestabiliseerde lectine wordt toegevoegd.Voeg vijf µL lectineoplossing toe aan de hoek van het dekglas en voeg vijf µL cultuur toe aan de lectinedruppel. Om een groeikamer van S pom basiscellen te creëren, pipetteer vijf µL EMM op een schoon objectglas en keer het dekglas met de cultuur in een hoek van 70 graden over het medium en laat het recht naar beneden op de EMM vallen om de randen met siliconenvet af te dichten. Knip het brede uiteinde van een 200 µL tip af en bevestig het smalle uiteinde aan een spuit van twee mL.Vul de spuit met ongeveer één milliliter siliconenvet. Breng een dunne lijn siliconen aan op de randen van het dekglas door de zuiger van de spuit voorzichtig in te drukken om de groeikamer af te dichten. Begin met het gebruik van Brightfield Imaging om de cellen te lokaliseren en uit te graven.Krijg een scherp beeld voor confocale microscopie. Wij maken gebruik van een Zeiss LSM 700 laser-scanning microscoop met een plan apoch chromat 63× olie-objectief en een instelling voor een gemiddelde vlakscan over 16 lijnen. Stel de area units in op 1 tot 1,1 om een optische doorsnede van 0,8 microns te verkrijgen.Scan de cellen met lasers die Alexa 488 en mCherry of GFP detecteren. Neem voldoende beelden op om metingen te verrichten in 60 cellen per drain. Schakel over naar een nieuwe groeikamer met verse cellen.Open na 60 minuten beeldvorming een afbeelding in het programma Zeen Light Edition om de afstand tussen signalen van verschillende fluoroforen in hetzelfde brandvlak te meten. Open de meettool en pas de lichtintensiteit en het contrast aan om het centrum van elk fluorescent signaal te identificeren, bijvoorbeeld het spoelpoollichaam en het kernmembraan, en meet de afstand tussen deze twee. Draag de gegevens over naar een notitieblok.Vergelijk de gemiddelde of mediane subcellulaire afstanden tussen verschillende stammen en behandelingen met behulp van statistische software of toetsen zoals de T-toets of de Mann-Whitney U-toets. In dit voorbeeld werd stam PJ 1 18 5 gekweekt in EMM en werd een monster in een groeikamer geplaatst voor beeldvorming. Vervolgens werd een aliquot van PJ 1 18 5.De cultuur werd overgebracht naar EMMN en 15 minuten geïncubeerd voordat een monster in een groeikamer werd geplaatst voor beeldvorming. Het meetinstrument werd gebruikt om de afstand tussen de locus en het spoelpoollichaam, evenals tussen de locus en het kernmembraan, te meten. Zoals hier wordt getoond, was er een statistisch significant verschil in de afstand waarbij het gencluster zich verwijderde van het kernmembraan richting het spoelpoollichaam in de stikstofarme cellen vergeleken met cellen die in stikstof waren gekweekt.De gegevens voor de afstand tussen het GFP en het SBP vertoonden een normale verdeling, waardoor de gemiddelde afstanden konden worden vergeleken met behulp van een T-test. Er was een significant verschil tussen de twee gemiddelde waarden. De gegevens voor de afstand tussen het GFP en NM vertoonden geen normale verdeling, waardoor de mediaanafstanden werden vergeleken met behulp van een Mann-Whitney U-test.Er was een significant verschil tussen de twee mediaanwaarden na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals real-time PCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe het genexpressieniveau correleert met de veranderingen in de subnucleaire organisatie.

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

We bieden een reproduceerbare basismethode voor de langetermijnmicroscopie van de seksuele levenscyclus van splijtingsgist. Met kleine aanpassingen zoals beschreven, stelt het gepresenteerde protocol onderzoekers in staat zich te concentreren op verschillende stappen van het reproductieproces.

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe is een uitstekend modelsysteem om cytokinese te studeren, het laatste stadium van de celdeling. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic gebeurtenissen in levende splijtingsproducten gistcellen te analyseren.

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer kwantitatieve live cell fluorescentie-microscopie voor subnucleaire organisatie in Schizosaccharomyces pombe. Deze methode meet chromatindynamiek onder verschillende groeiomstandigheden.

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Meer video's verkennen