Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast
23 januari 2012
De splijting gist, Schizosaccharomyces pombe, Is een goed model systeem om elementaire cellulaire processen te bestuderen. Hier beschrijven we een methode om kwantitatieve live cell analyse van de splitsing gist uit te voeren. In dit specifieke experiment richten we ons op de organisatie van het genoom in de celkern, maar de methode kan ook gebruikt worden om cytosolische factoren te bestuderen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de subnucleaire organisatie in gistcellen kwantitatief te meten en hoe deze wordt beïnvloed door veranderingen in groeiomstandigheden of mutaties. Dit wordt bereikt door gistcellen te laten groeien tot log fase in omstandigheden die de autofluorescentie minimaliseren. Vervolgens worden de cellen in een groeikamer geplaatst voor bekijking onder de microscoop.
Vervolgens worden afbeeldingen gemaakt om de afstand tussen verschillende fluorescerend gelabelde structuren in de cel te meten. Er worden resultaten verkregen die verschillen in niet-nucleaire organisatie laten zien, die afhankelijk zijn van het veranderen van de voedingsomstandigheden tijdens de groei van de gistcultuur. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het epie-veld over de wisselwerking tussen subar-organisatie of chromatine en genexpressieregulatie.
Toul-vis en gist beginnen met het bereiden van Edinburgh minimaal medium of EMM en EMM met ook ammoniumchloride om autofluorescentie te verminderen in plaats van autoclaven. Gebruik een 0.2 micron filter om de glucoseoplossing te steriliseren en voeg deze toe aan de autoclaafmedia. Inoculeer drie milliliter EMM in 30 milliliter buisjes met vis- en gistcellen.
Pas gekweekt op een agarplaat in het rijke medium, YEA, dek de buisjes lichtjes af en incubeer de cellen in een shaker bij 225 RPM en 30 graden Celsius. Houd de cellen twee dagen in log-fase door ze elke ochtend en avond te tellen met een birka-kamer en ze te verdunnen tot de juiste dichtheid. Op de dag van het experiment.
De cellen zouden zich in een vroege log-fase moeten bevinden om stikstof te krijgen. De cellen verwijzen naar de procedure in het geschreven protocol om de cellen in één pellet op de bodem van een centrifugebuis te verzamelen, 1,5 milliliter cellen in een eend of orph-buis bij een maximum van 1,5 RCF door de buis eerst twee minuten te laten draaien, vervolgens 180 graden te draaien voor een extra twee minuten draaien. Verwijder alles behalve 10 tot 15 microliters van het supernatant en resuspendeer de cellen in het resterende medium, tho een aliquot van één milligram per milliliter filter gesteriliseerde lectine.
Voeg vijf microliters lectine-oplossing toe aan de hoek van het dekglas en voeg vijf microliters van de cultuur toe aan de lectine-druppel. Om een groeikamer van S pom-basiscellen te maken, pipet vijf microliters EMM op een schone schuif en draai het dekglas met de cultuur in een hoek van 70 graden over het medium en laat het van boven naar beneden vallen op de EMM om de randen met siliconenvet af te dichten. Snijd het brede uiteinde van een 200 microliter tip af en bevestig het smalle uiteinde aan een twee milliliter spuit.
Vul de spuit met ongeveer één milliliter siliconenvet. Breng een dunne lijn siliconen aan op de randen van het dekglas door voorzichtig de zuiger van de spuit in te drukken om de groeikamer te beeldvormen. Begin met het gebruik van Brightfield Imaging om de cellen te lokaliseren en te graven.
Maak een scherpe foto voor confocale microscopie. We gebruiken een Zeiss LSM 700 laserscanningmicroscoop met een plan apoch chromat 63 keer olieobjectieflens en een 16 lijnengemiddelde vlakscan-instelling. Stel de gebiedseenheden in op één tot 1,1 om een optisch segment van 0,8 micron te verkrijgen.
Scan de cellen met lasers die Alexa 4 88 en mCherry of GFP detecteren. Neem voldoende afbeeldingen op om metingen te doen in 60 cellen voor elke afvoer. Schakel over naar een nieuwe groeikamer met verse cellen.
Na 60 minuten beeldvorming, opent u een afbeelding in het Zeen Light Edition-programma om de afstand tussen signalen van verschillende fluorforen in hetzelfde brandpunt te meten. Open het meetgereedschap en pas de lichtintensiteit en het contrast aan om het centrum van elk fluorescerend signaal te identificeren, bijvoorbeeld het spindelpoollichaam en de kernmembraan, en meet de afstand tussen hen. Breng de gegevens over naar een notitieblok.
Vergelijk de gemiddelde of mediaan subcellulaire afstanden tussen verschillende stammen en behandelingen met behulp van statistische software of tests zoals de T-test of de Man Whitney Rank sum test. In dit voorbeeld werd stam PJ 1 18 5 gekweekt in EMM en werd een monster in een groeikamer geplaatst voor beeldvorming. Vervolgens werd een aliquot van PJ 1 18 5.
Cultuur werd overgebracht in EMMN en gedurende 15 minuten geïncubeerd voordat een monster in een groeikamer werd geplaatst voor beeldvorming. Het meetgereedschap werd gebruikt om de afstand tussen het locus en het spindelpoollichaam te meten, evenals tussen het locus en de kernmembraan. Zoals hier getoond, was er een statistisch significant verschil in de afstand van de gencluster die zich van de kernmembraan verwijdert richting het spindelpoollichaam in de stikstof-uitgehongerde cellen in vergelijking met cellen gekweekt in stikstof.
De gegevens die de afstand tussen de GFP en de SBP meten, hadden een normale verdeling, en daarom konden de gemiddelde afstanden worden vergeleken met behulp van een T-test. Er was een significant verschil tussen de twee gemiddelde waarden. De gegevens die de afstand tussen de GFP en NM meten, hadden geen normale verdeling, en daarom werden de mediaanwaarden vergeleken met behulp van een man Whitney gerangschikte somtest.
Er was een significant verschil tussen de twee mediaanwaarden na dit proces. Andere methoden, zoals real-time PCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe het genexpressieniveau correleert met de veranderingen in subnucleaire organisatie.
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor kwantitatieve live celanalyse van de delingschimmel, Schizosaccharomyces pombe, met focus op de organisatie van het genoom binnen de celkern. De methode stelt onderzoekers in staat om te onderzoeken hoe subnucleaire organisatie wordt beïnvloed door groeicondities en mutaties.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Genetica
- Microbiologie
Achtergrond
- Schizosaccharomyces pombe dient als modelorganisme voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Het begrijpen van genoomorganisatie is cruciaal voor inzichten in genregulatie.
- Live celbeeldtechnieken kunnen dynamische cellulaire structuren onthullen.
- Veranderingen in groeicondities kunnen de cellulaire organisatie beïnvloeden.
Doel van Studie
- Om subnucleaire organisatie in gistcellen kwantitatief te meten.
- Om de impact van voedingscondities en mutaties op genoomorganisatie te beoordelen.
- Om een methode te bieden voor het bestuderen van chromatinedynamiek en genregulatie.
Gebruikte Methoden
- Gistcellen worden gekweekt in minimaal medium tot logfase.
- Cellen worden voorbereid voor beeldvorming met behulp van een groeikam en confocale microscopie.
- Fluorescentie-gelabelde structuren worden geïmager om afstanden tussen hen te meten.
- Statistische analyse wordt uitgevoerd om afstanden onder verschillende condities te vergelijken.
Belangrijkste Resultaten
- Aanzienlijke verschillen in subnucleaire organisatie werden waargenomen onder verschillende groeicondities.
- Afstandsmetingen tussen fluorescente signalen gaven veranderingen in chromatinepositionering aan.
- Statistische tests bevestigden de significantie van de waargenomen verschillen.
- De methode biedt inzichten in de relatie tussen subnucleaire organisatie en genregulatie.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van genoomorganisatie in delingschimmel.
- Resultaten benadrukken de invloed van omgevingsfactoren op chromatinedynamiek.
- Deze aanpak kan worden toegepast om verder genregulatiemechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative live cell fluorescence microscopy in fission yeast enables precise measurement of subnuclear organization and its dynamic response to environmental changes. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses about chromatin architecture and gene regulation. The method supports predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions at the intersection of cell biology and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin organization and its impact on gene regulation under defined conditions.
- Supports functional target validation by quantifying spatial genome dynamics in response to perturbations.
- Provides mechanistic de-risking for hypotheses linking nuclear architecture to gene expression changes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell imaging systems for reproducible measurement of subcellular distances.
- Facilitates assay standardization through quantitative, statistically analyzable outputs.
- Enables screening of genetic or environmental modifiers affecting nuclear organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subnuclear localization changes with gene induction events relevant to disease models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking chromatin dynamics to functional readouts.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker development when chromatin positioning is implicated.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative imaging method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on chromatin organization and gene regulation relationships.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing genetic or environmental conditions.
- Analytics: Delivers statistically robust measurements (mean, median distances) for cross-condition analysis.
- Translational Research: Connects nuclear architecture changes to gene induction relevant for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for live cell imaging and quantitative analysis across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows and ensures reproducibility of quantitative outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust data on chromatin dynamics and gene expression relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and pathways based on quantitative nuclear organization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical software for distance measurements.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and statistical analysis methods.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or model systems with varying genetic backgrounds.
- Practical limitations include autofluorescence management and ensuring sufficient sample size for statistical power.
