Name: Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer groeitesten om polyglutamine-toxiciteit in gist te beoordelen met behulp van Saccharomyces cerevisiae. Deze methoden helpen onderzoekers bij het bestuderen van eiwitmisfolding en neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk in de Duennwald laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de Amerikaanse Federatie voor Aging Research (Afar), de erfelijke ziekte Foundation (HDF) en de William Wood Foundation.

1. Expressie van Toxic polyQ-uitbreiding eiwitten in gist Een systematische analyse heeft het de precieze aminozuursequentie van een polyQ-expansie eiwit dat moet toxiciteit bij gist 7. Dit toxische polyQ-expansie eiwit bevat een amino-terminale FLAG-tag gevolgd door 17 aminozuren van de originele sequentie van het eiwit huntingtin een polyQ regio en een carboxy-terminale fusie met een fluorescent protein (GFP een of CFP, zie figuur 1 a). De expressie van eiwitten met polyQ uitbreidingen van 46 glutamines of meer (bijvoorbeeld 72 en 103 glutamines) produceert toxiciteit in gist uitgedrukt onder de controle van de induceerbare en relatief sterke promoter GAL1 7, 9. Zoals eerder beschreven polyQ toxiciteit gist alleen zichtbaar in cellen die het eiwit Rnq1p voeren in de prion conformatie [RNQ +], bijvoorbeeld de giststam W303 9. De toxische polyQ-uitbreiding eiwit recapitulates centrale aspecten van polyQ-biologie in gist, zoals polyQ lengte-afhankelijke toxiciteit (zie hieronder) en aggregatie (figuur 1 b). Met name niet giftig polyQ-uitbreiding eiwitten niet onmiddellijk te doden gistcellen, ze eerder schaden of de aanhouding van de celcyclus en mobiele divisie, waardoor vertragen of het remmen van de groei van gist kolonies op platen of vloeibare culturen (onze niet-gepubliceerde gegevens). 2. Mogelijke problemen met gist-cellen die Toxic polyQ-expansie Eiwitten Gist cellen die de anders giftige polyQ uitbreiding eiwitten kunnen geen enkele groei gebrek 9. De aard van deze genetische onderdrukkers van polyQ toxiciteit lijkt niet gebaseerd op eenvoudige Mendeliaanse mutaties en kan dus optreden bij relatief hoge frequentie (onze gepubliceerde resultaten). We veronderstellen dat deze spontaan onderdrukkers worden veroorzaakt door het uitharden van onbekende prions die functioneren op dezelfde wijze [RNQ +] te bepalen polyQ toxicity.These spontane onderdrukkers van polyQ toxiciteit kan afbreuk doen aan de succesvolle uitkomst van een experiment dat tot doel heeft polyQ toxiciteit te karakteriseren of het identificeren en karakteriseren van modifiers polyQ toxiciteit. Met het oog op het veelvuldig voorkomen van deze spontane onderdrukkers te vermijden, volg dan de voorzorgsmaatregelen hieronder geschetste maatregelen, die hebben bewezen zeer effectief te zijn: <ol><li> Gebruik verse gist cellen voor toxiciteit experimenten. Bewaar geen gist voor langere tijd. Vaak halen verse gist kolonies van bevroren voorraden. </li><li> Vaak volgen de expressie en aggregatie van giftige polyQ-uitbreiding eiwitten met behulp van fluorescentie microscopie. </li><li> Houd de gistcellen in de media dat de expressie van de toxische polyQ toxiciteit te allen tijde (dus in selectieve media met glucose als enige koolstofbron) te onderdrukken voordat u begint met een toxiciteit metingen. </li><li> Gebruik ten minste drie onafhankelijke transformanten voor elke polyQ-toxiciteit experiment. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 3. Groei Assays <ol><li> Voor elke experimentele conditie inoculeren een kolonie elk van drie onafhankelijke transformanten gist cellen die het giftige polyQ-expansie eiwit in 3 ml selectieve gist media met glucose als enige koolstofbron. </li><li> 'S nachts Incubeer deze culturen bij 30 ° C. Onder deze omstandigheden worden de cellen niet de uiting van de polyQ-uitbreiding eiwit, omdat de glucose in het medium verdringt hun expressie. Laat deze culturen overwoekeren, houden de OD 600 (absorptie van het licht van 600 nm golflengte) van het 's nachts culturen onder 1. </li><li> We routinematig gebruik van drie verschillende tests om de groei gebreken van gist cellen die de giftige polyQ-expansie eiwit te bewaken: </li></ol> 3,1 Groei op platen <ol><li> Verdun de nacht gistculturen (gegroeid met 220 toeren per minuut schudden) om een OD 600 van 0,0005 (dwz een 1:1000 verdunning van een OD600 = 0,5 cultuur) in selectieve media 7 bevattende glucose. </li><li> Gespreid 50 ul (gevolg ca. 700 kolonies per plaat) van elke verdunde cultuur op een plaat (10 cm diameter) met selectief medium dat glucose als enige koolstofbron en een plaat met selectief medium met galactose als enige koolstofbron. </li><li> Incubeer de platen gedurende drie tot vier dagen bij 30 ° C. Na de incubatie, fotograferen van elke plaat en tellen van het aantal kolonies op de glucose en het aantal kolonies op de galactose platen. Onder ideale omstandigheden, moet er geen of slechts zeer weinig kolonies op de galactose plaat bij het gebruik van gist-cellen die een zeer giftig polyQ-expansie eiwit (103 octodecies, figuur 2a). </li></ol> 3,2 Spotting assays Deze test is kwantitatief dan de beplating assay beschreven en dus licht zelfs kleine verschillen in polyQ toxiciteit hetzelfde experiment op dezelfde plaat. <ol><li> Verdun de overnechts culturen gekweekt in medium met glucose een OD 600 van 0,1. </li><li> Pipetteer 200 ul van deze verdunde culturen in steriele 96-wells platen en bereiden vijf vijfvoudige seriële verdunningen in steriel water en een multi-kanaal pipet. </li><li> Een frogger (ook wel spotter met 8 x 6 kunnen voor de overdracht van celsuspensies) overdragen van de celsuspensies op platen die selectieve media met glucose als enige koolstofbron en platen die selectieve media met galactose als enige koolstofbron. </li><li> Dat de platen drogen voordat ze incuberen bij 30 ° C gedurende drie tot vier dagen. </li><li> Na de incubatie, fotograferen van elke plaat (figuur 2b). </li></ol> 3.3. Monitoring polyQ toxiciteit in gist door de groei van vloeibare culturen Dit protocol is de kwantitatieve (OD600 aantal) van de drie technieken beschreven en kunnen zelfs detecteren zeer kleine verschillen in polyQ toxiciteit. De genoemde ocCurrence van spontane onderdrukkers, maar kan mogelijk misleidende resultaten opleveren. I bevelen daarom combineren assay met ten minste een van de twee platen assays zoals hierboven beschreven. Wij stellen voor om de BioscreenC instrument te gebruiken voor deze experimenten. De BioscreenC is een instrument dat automatisch meet de optische dichtheid van gistculturen in 100-well platen, terwijl geïncubeerd bij bepaalde temperaturen met gedefinieerde agitatie. Andere methoden voor het kweken gistcellen en meten van de optische dichtheid kan eveneens. <ol><li> Was de gistcellen van minimaal medium met glucose als enige koolstofbron driemaal in 3 ml steriel water. </li><li> Verdun de nacht culturen gekweekt in medium met galactose tot een OD 600 van 0,1. </li><li> Vul elk putje van de 100-goed BioscreenC plaat met 300 ul van de gist culturen. </li><li> Open de Easy Bioscreen Experiment programma. Bepaal het aantal monsters dat u wilt controleren (inclusief spaties en middelgrote alleencontroles), stelt u de temperatuur tot 30 ° C, de lengte van de experimenten tot 3 dagen, de meetintervallen ingesteld op 15 minuten, stelt u de filter tot 600 nm / Brown, en stel het schudden mode tot 15 seconden voor elke meting op gemiddelde sterkte. </li><li> De BioscreenC instrument en de meegeleverde software zal produceren Excel-spreadsheets van elk gegevenspunt genomen tijdens het experiment. </li><li> Bereid groeicurven met Excel voor elk monster en vergelijken groei van verschillende monsters (figuur 2c). Een gedetailleerde beschrijving van de analyse van gegevens van BioscreenC experimenten is voorzien voor 10. </li></ol> 4. Representatieve resultaten <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De gist polyQ model. a) Schematische weergave van de toxische polyQ-expansie eiwit. b) Fluorescentiemicroscopie met gist-cellen die een korte niet-toxische polyQuitbreiding van eiwit (25Q, linker paneel) en gist cellen die een lange, giftige polyQ-expansie eiwit (103 octodecies, rechter paneel). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve resultaten van de groei assays van gistcellen expressie polyQ-expansie eiwitten. a) Plating assay. Ongeveer 700 gistcellen werden uitgespreid op platen en gedurende drie dagen bij 30 ° C. Het bovenste paneel toont een plaat met glucose medium, namelijk de expressie van de toxische polyQ-expansie eiwit (103 octodecies) niet geïnduceerd. Het onderste paneel toont een gist plaat met galactose-medium, dat wil zeggen de uitdrukking van de toxische polyQ-expansie eiwit wordt opgewekt. Merk op dat in het experiment hier geen spontane suppressor plaatsgevonden. B) signaleren assay. Vijf achtereenvolgende vijf-voudige verdunningen van gistcellen herbergen hetzij een niet-toxisch polyQ eiwit (25Q) of een toxische polyQ-expansie protein (103 octodecies) werden gespot op glucose platen dat de expressie van de eiwitten (linker paneel) of op galactose platen die hun expressie te induceren te onderdrukken. De platen werden vervolgens geïncubeerd gedurende drie dagen bij 30 ° C. c) BioscreenC experiment. De groei van kweken van gisten cellen die ofwel niet-giftige polyQ eiwit (25Q) of een toxische polyQ-expansie eiwit (103 octodecies) werden gecontroleerd door de BioscreenC instrument. De experimentele omstandigheden en de analyse van de BioscreenC experimenten beschreven in de tekst.

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+repeats+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li>
<li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li>
<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit manuscript beschrijft drie complementaire experimentele benaderingen van polyQ-toxiciteit te meten in het modelorganisme gist op basis van verminderde groei van de gist-cellen die giftige polyQ-expansie eiwitten. Werk in gist heeft aangeboden diepgaande inzichten in de fundamentele cellulaire en moleculaire mechanismen van eiwitten verkeerd vouwen en de daaruit voortvloeiende toxiciteit, met inbegrip van het verkeerd vouwen en de toxiciteit van polyQ-expansie eiwitten 9,11,12. Experimenten op basis van de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het instrument </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 pins) </td><td> V &amp; P Scientific, San Diego </td><td> VP 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves USA </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100-en Honeycomb platen </td><td> Growthcurves USA </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

groei testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Eiwit misfolding gaat gepaard met veel ziekten, in het bijzonder neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en Huntington 1. Ziekte van Huntington (HD) wordt veroorzaakt door de abnormale groei van een polyglutamine (polyQ) regio van het eiwit huntingtin. De polyQ-uitgebreide huntingtine eiwit bereikt een afwijkende conformatie (dat wil zeggen dat misfolds) en veroorzaakt cellulaire toxiciteit 2. Minstens acht andere neurodegeneratieve ziekten worden veroorzaakt door polyQ-uitbreidingen, waaronder de spinocerebellaire ataxieën en Kennedy de ziekte van 3. Het modelorganisme gist heeft vergemakkelijkt belangrijke inzichten in de cellulaire en moleculaire basis van polyQ-toxiciteit, met inbegrip van het effect van de intra-en inter-moleculaire factoren van polyQ-toxiciteit, en de identificatie van cellulaire mechanismen die worden geremd in cellen die polyQ-expansie eiwitten 3-8. Belangrijkly, werden vele aspecten van polyQ-toxiciteit die werden gevonden in gist gereproduceerd in andere experimentele systemen en tot op zekere hoogte in monsters van HD-patiënten, waaruit blijkt het belang van het gist-model voor de ontdekking van fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen polyQ-toxiciteit. Een directe en relatief eenvoudige manier om polyQ-toxiciteit te bepalen in gist is het meten van groeistoornissen van de gist-cellen die polyQ-expansie eiwitten. Dit manuscript beschrijft drie complementaire experimentele benaderingen van polyQ-toxiciteit vast te stellen in gist door het meten van de groei van gist-cellen die polyQ-expansie eiwitten. De eerste twee experimentele benaderingen volgen gistgroei op de borden, de derde benadering houdt toezicht op de groei van de vloeibare gist culturen met behulp van de BioscreenC instrument. Bovendien, dit manuscript beschrijft experimentele moeilijkheden die zich kunnen voordoen bij het hanteren van gist polyQ modellen en schetst de strategieën die zullen helpen om of te vermijdenminimaliseren van deze problemen. De hier beschreven protocollen kunnen worden gebruikt om vast te stellen en genetische routes en kleine moleculen die polyQ toxiciteit moduleren karakteriseren. Bovendien kan de beschreven assays als sjablonen voor nauwkeurige analyse van de toxiciteit die door andere ziekte-gerelateerde gevouwen eiwitten in gist modellen.

Dit manuscript beschrijft drie aanvullende protocollen voor de beoordeling van de toxiciteit van polyglutamine (polyQ)-uitbreiding van eiwitten in de gist<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast om de toxiciteit van andere verkeerd gevouwen eiwitten in gist te controleren.

Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

Eiwitmisvouwing is geassocieerd met vele menselijke ziekten, in het bijzonder neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson...

Het algemene doel van deze procedure is om gist te gebruiken als experimenteel platform om de toxiciteit geassocieerd met polyglutamine-expansie-eiwitten te beoordelen en te analyseren na de groei van gist onder condities die de expressie van polyglutamine onderdrukken. Er worden drie complementaire groeianalyses uitgevoerd op gistcellen die een toxisch polyglutamine-expansie-eiwit tot expressie brengen om de toxiciteit betrouwbaar te beoordelen in de eerste gedemonstreerde groeianalyse.Hier wordt polyglutamine-toxiciteit gemonitord via een plating-assay. Als tweede aanvullende groeianalyse wordt een spotting-assay gebruikt om zelfs subtiele verschillen in celgroei te detecteren. De meest kwantitatieve aanpak wordt getoond in de derde assay, waarbij gistcellen in vloeibare culturen worden gekweekt en de toxiciteit wordt gemonitord door observatie van de optische dichtheid bij 600 nanometer, waardoor uiteindelijk reproduceerbare en kwantitatieve resultaten kunnen worden verkregen.Dit document beschrijft polyglutamine-toxiciteit in gistcellen door middel van een zorgvuldige analyse van hun groei op platen en in vloeibare culturen. Deze methode kan kernvragen over eiwitvouwingsstoornissen beantwoorden, zoals het ontcijferen van de genetische en cellulaire basis van de toxiciteit die geassocieerd is met verkeerd gevouwen eiwitten, waaronder polyglutamine-eiwitten. Een systematische analyse heeft de precieze aminozuurvolgorde van een poly Q-expansie-eiwit vastgesteld die nodig is om toxiciteit in gist teweeg te brengen.Dit toxische poly Q-expansie-eiwit bevat een amino-terminaal flag-tag, gevolgd door 17 aminozuren uit de oorspronkelijke sequentie van het Huntington-eiwit, een poly Q-regio en een carboxy-terminale fusie met een fluorescent eiwit. Gistcellen die anders toxische poly Q-expansie-eiwitten tot expressie brengen, vertonen mogelijk geen groeistoring vanwege spontane suppressoren van poly Q-toxiciteit, wat de succesvolle uitkomst van elk experiment dat tot doel heeft de poly Q-toxiciteit of de modifiers daarvan te karakteriseren, in gevaar kan brengen. Om het frequente voorkomen van deze spontane suppressoren te vermijden, dient u voorzorgsmaatregelen te nemen, waaronder het gebruik van verse gistcellen voor toxiciteitsexperimenten. Vermijd het langdurig bewaren van gist en haal regelmatig verse gistkolonies uit bevroren voorraden.Controleer regelmatig de expressie en aggregatie van toxische poly Q-expansie-eiwitten via fluorescentiemicroscopie. Houd de gistcellen te allen tijde in medium dat de expressie van de toxische eiwitten onderdrukt. Doe dit voordat u begint met enige toxiciteitsmetingen.Als laatste preventieve maatregel moeten meerdere onafhankelijke transformanten per experiment worden gebruikt. Om te beginnen, worden voor de in dit protocol gedemonstreerde groeianalyses gistcellen verkregen die coderen voor de expressie van poly Q-expansie-eiwitten, gebruikmakend van drie milliliter selectief gistmedium met glucose. Inoculeer drie culturen van drie onafhankelijke transformanten met glucose als enige koolstofbron en incubeer de culturen gedurende de nacht bij 30 °C.Onder deze omstandigheden brengen de cellen het poly Q-expansie-eiwit niet tot expressie vanwege repressie door glucose. Voorkom dat de overnight-culturen overgroeien door de optische dichtheid bij 600 nanometer onder één te houden om defecten via groei op platen te kunnen monitoren. Voer eerst een 1:1000 verdunning uit van een overnight-gistcultuur met een OD 600 van 0,5 in selectief medium met glucose; verspreid vervolgens 50 µL van elke verdunde cultuur gelijkmatig over één plaat met selectief medium waarin glucose de enige koolstofbron is, om ongeveer 700 kolonies per plaat te verkrijgen voor elke verdunde cultuur.Zaai daarnaast uit op selectief medium met galactose als enige koolstofbron. Incubeer de platen gedurende drie tot vier dagen bij 30 °C. Maak na de incubatie foto's van elke plaat en tel het aantal kolonies op de glucose- en galactoseplaten.Onder ideale omstandigheden zouden er geen of zeer weinig kolonies op de galactoseplaat aanwezig moeten zijn bij gebruik van gistcellen die een zeer toxisch poly Q expansie-eiwit tot expressie brengen. De spotting assay is kwantitatiever dan de plating assay en kan daarom zelfs subtiele verschillen in poly Q toxiciteit onthullen. Om binnen hetzelfde experiment op dezelfde plaat spotting assays in medium met glucose te starten, moeten de overnight culturen worden verdund tot een OD 600 van 0,1; pipetteer 200 µL van elke verdunde cultuur in steriele 96-well platen en bereid vijf vijfvoudige seriële verdunningen in steriel water met een multichannel pipet met behulp van een frogger transfer.Breng de celsuspensies aan op platen met selectieve media met glucose als enige koolstofbron. Daarnaast worden de cellen overgebracht naar platen met selectieve media met galactose als enige koolstofbron; nadat de platen zijn opgedroogd, worden ze drie tot vier dagen geïncubeerd bij 30 °C voordat er foto's van elke plaat worden gemaakt. De assay voor vloeibare groei is de meest kwantitatieve van de drie hier beschreven assays om poly Q-toxiciteit in gist te monitoren.De bio screen C is een instrument dat automatisch de optische dichtheid van gistculturen in 100-wells platen meet, terwijl deze worden geïncubeerd bij gedefinieerde temperaturen met een gedefinieerde agitatie. Andere methoden voor het kweken van gistcellen en het meten van hun optische dichtheid kunnen ook worden gebruikt om te beginnen met het centrifugeren van de gistcellen die overnight zijn gekweekt in minimaal medium met glucose als enige koolstofbron. Was de cellen na centrifugatie in drie milliliters steriel water.Herhaal de wasstap twee keer, waarbij de cellen na elke wasbeurt worden neergesponnen met behulp van medium met galactose. Verdun de gewassen cellen tot een OD 600 van 0,1. Vul vervolgens elke put van de 100-wells bio screen C-plaat met 300 microliter van de verdunde gistculturen en plaats de plaat in het instrument.Open het experimentprogramma van de easy bio screen. Bepaal het aantal monsters dat gemonitord moet worden. Stel de temperatuur in op 30 °C.Stel de duur van de experimenten in op drie dagen en stel de meetintervallen in op 15 minuten. Stel daarnaast het filter in op 600 nanometers bruin en de schudmodus op 15 seconden vóór elke meting met een gemiddelde sterkte. Start het experiment nadat de parameters zijn ingesteld.Het bio screen, zie instrument, en de bijbehorende software genereren Excel-spreadsheets van elk datapunt dat tijdens het experiment is gemeten. Met behulp van Excel kunnen groeicurves voor elk monster worden opgesteld, waardoor de groei van verschillende monsters met elkaar vergeleken kan worden. Hier worden de resultaten van de plating-assay getoond.Ongeveer 700 gistcellen werden op platen uitgeplaat en drie dagen gedurende 30 °C geïncubeerd op de plaat die glucosemedium bevatte. De expressie van het toxische poly Q-expansie-eiwit wordt niet geïnduceerd. Omgekeerd wordt, wanneer de gistcellen op galactosemedium worden geplaat, de expressie van het toxische poly Q-expansie-eiwit wel geïnduceerd.Let op dat er in het hier getoonde experiment geen spontane suppressie optrad. Op dezelfde wijze is in de spotting-assay de expressie van het toxische Poly Q-expansie-eiwit waarneembaar op galactose en niet op glucose. Medium vijf, seriële vijfvoudige verdunning van gistcellen die ofwel een niet-toxisch poly Q-eiwit of een toxisch poly Q-expansie-eiwit bevatten, zijn gespot op glucoseplaten die de expressie van de eiwitten onderdrukken of op galactoseplaten die hun expressie induceren in het bio screen C-experiment.De groei van gistcelculturen die ofwel een niet-toxisch poly Q-eiwit of een toxisch poly Q-expansie-eiwit tot expressie brachten, werd gemonitord met het Bio Screen C-instrument zoals beschreven in deze video; het effect van de expressie van het toxische poly Q-expansie-eiwit op de celgroei is hier duidelijk zichtbaar. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de toxiciteit van polyglutamine-eiwitten in gist gemonitord kan worden. De vloeibare groeianalyse is de meest kwantitatieve van de drie analyses, aangezien deze zelfs subtiele verschillen in polyglutamine-toxiciteit kan detecteren.Houd er echter rekening mee dat dit gecombineerd moet worden met ten minste één van de twee plating-assays om problemen met spontane suppressie van polyglutamine-toxiciteit te voorkomen.

growth-assays-to-assess-polyglutamine-toxicity-in-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

In this video, we describe a method to evaluate the neuroprotective effect of a test compound, astragalan, on neuronal survival in Caenorhabditis elegans from polyQ-mediated neurotoxicity. The assay uses Caenorhabditis elegans expressing the abnormally expanded polyQ repeats fused to GFP in their ASH neurons to measure neuronal survival following test compound treatment.

An Assay to Study Effect of Test Compound against PolyQ-Mediated Neurotoxicity in Worms

Gist-eiwitopathiemodellen zijn waardevolle instrumenten om de toxiciteit en aggregatie van eiwitten die betrokken zijn bij ziekten te beoordelen. Hier presenteren we methoden voor het screenen van Hsp104 variantenbibliotheken op toxiciteitsonderdrukkers. Dit protocol kan worden aangepast om elke eiwitbibliotheek te screenen op toxiciteitsonderdrukkers van elk eiwit dat toxisch is in gist.

Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.

Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.

Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel

Leer groeitesten om polyglutamine-toxiciteit in gist te beoordelen met behulp van Saccharomyces cerevisiae. Deze methoden helpen onderzoekers bij het bestuderen van eiwitmisfolding en neurodegeneratieve ziekten.

Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

Meer video's verkennen