Name: Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer de propagatie en detectie van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus met GFP-expressie in schapenchoroïd plexuscellen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van virale replicatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de IJslandse Research Fund en de Universiteit van IJsland Research Fund.

1. Transfectie De moleculaire kloon is opgenomen in twee plasmiden, p8XSp5-EGFP en p67r van 12 kb en 4,5 kb respectievelijk. 9,10 <ol><li> Snijd equimolaire hoeveelheden van de twee plasmiden, dat wil zeggen 4,4 ug van p8XSp5-EGFP en 1,6 ug van p67r met Xbal en afbinden voor transfectie. </li><li> Voor ligatie, gebruik 1 Weiss eenheid van ligase in een 50 ul reactie en incubeer bij 16 ° C gedurende de nacht. </li><li> Wanneer ligatie is voltooid, incubeer de ligatie mix bij 65 ° C gedurende 15 minuten voor inactivatie van de ligase. Deze stap kan worden overgeslagen. </li><li> Twee dagen voor transfectie, zaad 10 6 SCP cellen in een T25 weefselkweek fles, en te groeien cellen voor twee dagen in 5 ml DMEM + 10% lam serum en 2 mM glutamine, zonder antibiotica om een monolaag van 90% confluentie. Als de cellen nog niet hebben bereikt 90% confluentie na twee dagen, laat de cellen om een ​​extra dag te groeien. </li></ol> Opmerking: Het lam serum kan worden vervangen door foetale bovine serum (FBS). We routinematig gebruik van lamsvlees serum, omdat sommige stammen van MVV worden geremd door FBS, dit MVV stam wordt niet geremd door FBS, echter. <ol start="5"><li> Wanneer de cellen klaar zijn voor transfectie, verandering middellange tot DMEM met 1% serum (lam serum of FBS) zonder antibiotica. Wij gebruiken Lipofectamin 2000 (Invitrogen) voor transfectie. </li><li> Verdun het DNA in 500μl Opti-MEM medium. </li><li> Verdunnen 20μl Lipofectamin 2000 in 500μl Opti-MEM medium en laat op kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten. </li><li> Na de 5 min incubatie, combineren de verdund DNA met verdunde Lipofectamine 2000 (totaal volume = 1000 pi). Meng voorzichtig en incubeer 20-30 minuten bij RT. </li><li> Voeg de transfectie mix (1 ml) om de T25 fles met SCP cellen en het medium (5 ml). Meng door zachtjes wiegen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 's nachts (18 - 24 uur). </li><li> Wijzig medium de volgende dag om DMEM met 1% serum, 2mm glutamine, 100IU penicilline en streptomycine 100IU. </li><li> Bewaken van de productie van GFP in het SCP-cellen door omgekeerde fluorescentie microscopie. Lage transfectie-efficiëntie kan worden verwacht met deze primaire cellen, meestal 5 - 15%. </li><li> Incubeer verder bij 37 ° C, 5% CO 2 voor een aantal dagen om verspreiding van het virus in de kolf. Het duurt meestal 7-14 dagen voor de volledige infectie. </li><li> Verzamel dan het virus door aliquoting de supernatant in Eppendorf buizen. Spin in een microcentrifuge bij 3000 rpm gedurende 5 minuten naar cel vuil te verwijderen. Breng de bovenstaande met het virus om nieuwe buizen. Bewaren bij -80 ° C. </li></ol> 2. Titratie van virus <ol><li> Zaad 3x10 4 SCP cellen in 100 ul DMEM-medium aangevuld met 10% serum, 2mm glutamine, 100IU/ml penicilline en streptomycine 100IU/ml, per putje in een 96 wells plaat. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Als de cellen confluent de volgende dag, verander middellange tot DMEM met 1% serum, 2mm glutamine, 100IU/ml penicilline en streptomycine 100IU/ml, 100 pl in elk putje. </li><li> Verdun het virus op de volgende manier: <ol><li> Voeg 180 ul DMEM met 1% serum, 2mm glutamine, 100IU/ml penicilline en streptomycine per 100IU/ml goed voor 4 x 10 putten in een 96 goed met ronde bodem of V-bodemplaat. </li><li> Voor seriële tienvoudige verdunningen in viervoud, voeg 20 ul van het virus aan elk van 4wells in de eerste kolom van de plaat, en het gebruik van een vier-kanaals pipet, pipet op en neer om ervoor te zorgen dat de monsters goed gemengd zijn. Verandering pipetpunten en overdracht 20 ui naar de volgende vier putten en ga zo maar door. Laat de laatste putten zonder virus voor een negatieve controle. </li></ol></li><li> Voeg 100 ul van het virus verdunningen het SCP cellen en medium. </li><li> Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2. Let op voor GFP fluorescentie en cytopathische effecten voor twee weken. Cytopathische effecten bestaan ​​uit cellen worden afgerond en minder transparant dan normale cellen met processen uit te rekken, eindigend met multinucleaire cellen verschijnen en celdood. </li><li> Bereken virus titer (TCID50) met behulp van de Reed Muench methode 11. </li></ol> 3. FACS-analyse van de geïnfecteerde cellen Opmerking: Voor een snelle controle van de replicatie van het virus, geïnfecteerde cellen kunnen worden onderzocht door middel van flowcytometrie. <ol><li> Trypsinize geïnfecteerde cellen (ca 10 5), was 1x met PBS en resuspendeer in 500μl PBS. </li><li> Voeg 500 ul 4% paraformaldehyde-oplossing (2% eindconcentratie), incubeer bij RT gedurende 30 minuten. </li><li> Pellet-cellen in een microcentrifuge bij 3000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Was met PBS 2x5 min en analyseren op een FACScan analyzer. Tellen 10.000 evenementen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Dit virus moeten volledig besmettelijk en repliceren naar een titer van 10 juni-10 juli TCID 50 / ml. Geïnfecteerde cellen fluorescerende en kunnen worden detected door flowcytometrie en fluorescentie microscopie. Meestal kan GFP opgespoord worden in meer dan 60% van de cellen in de geïnfecteerde cel kweken met behulp van flowcytometrie (afb. 1). Ook wanneer gevisualiseerd door fluorescentie microscopie, een meerderheid van de cellen fluorescent (Fig. 2A en B). <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. FACScan analyse van de SCP-cellen geïnfecteerd met KV1772-EGFP virus na 7 dagen van de infectie. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Fase contrast microscopie van SCP-cellen geïnfecteerd met KV1772-EGFP na 7 dagen incubatie (A). Dezelfde cellen gevisualiseerd door fluorescentie microscopie (B).

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De GFP uitdrukken moleculaire kloon van MVV hier gepresenteerde moet nuttig zijn voor het analyseren van de gastheer-cel interacties en pathogeniteit van de MVV zowel in vitro als in vivo. Het virus verkregen na 7-14 dagen van replicatie heeft ongetwijfeld verworven sommige mutaties als gevolg van de onnauwkeurigheid van reverse transcriptase. Er zijn echter beperkingen aan het gebruik van deze kloon als een enkele cyclus vector. Een daarvan is dat het gebruik van de kloon is beperkt tot cellen van schapen en geiten oor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

teeltmateriaal en detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van maedi-visna virus dat green fluorescent protein geeft uiting aan

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna virus (MVV) is een lentivirus van schapen, waardoor langzaam progressieve interstitiële pneumonie en encefalitis 1. Het primaire doel cellen van MVV in vivo worden beschouwd als van de monocyten Lineage 2. Bepaalde stammen van MVV kunnen repliceren in andere celtypen, maar 3,4. De groen fluorescerend eiwit is een veelgebruikte marker voor het bestuderen van lentivirussen in levende cellen. Wij hebben geplaatst het EGFP-gen in het gen voor dUTPase van MVV. De dUTPase gen is goed geconserveerd in de meeste lentivirus stammen van schapen en geiten en is aangetoond dat het belang in de replicatie van CAEV 5. Er is echter dUTPase aangetoond dat misbaar voor replicatie van de moleculaire kloon van MVV die in deze studie zowel in vitro als in vivo 6. MVV-replicatie is strikt beperkt tot cellen van schapen of geiten herkomst. We maken gebruik van een primaire cel lijn van de plexus choroideus van schapen (SCP cellen) voor transfectie en vermeerdering van het virus 7. De fluorescerende MVV is volledig aanstekelijk en EGFP expressie is stabiel gedurende tenminste zes passages 8. Er is een goede correlatie tussen de metingen van TCID 50 en EGFP. Dit virus zou dan ook handig zijn voor snelle detectie van geïnfecteerde cellen in studies van celtropisme en pathogeniciteit in vitro en in vivo 8.

Beschrijven we een moleculaire kloon van maedi-visna virus dat GFP tot uitdrukking en is volledig besmettelijk. Replicatie van dit virus kan worden gedetecteerd door gebruik te maken van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.

Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan

Het Maedi-visna virus (MVV) is een lentivirus bij schapen dat langzaam progressieve interstitiële pneumonie en encefalitis veroorzaakt1. De primaire doelcellen van MVV in ...

Het algemene doel van deze procedure is het voortplanten en detecteren van een infectieuze kloon van Mildy vs. No virus die groen fluorescent eiwit tot expressie brengt. Dit groen fluorescent eiwit is gekloond in het gen dat codeert voor D utp Ace in het genoom van het Myy Ner virus.De infectieuze kloon is ondergebracht in twee plasmiden. Ten eerste worden de twee plasmiden die de myy Ner-sequenties bevatten gesneden met het restrictie-enzym xpa one en geligeerd. Ten tweede worden cellen van het plexus choroideus van schapen getransfecteerd met het construct.Ten slotte worden cellen die geïnfecteerd zijn met het myy vino-virus gedetecteerd via fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie. Hallo, ik ben Stefano Neron van het TER Institute for Experimental Pathology aan de Universiteit van IJsland. Vandaag laten we u een procedure zien voor het propageren en detecteren van een infectieuze moleculaire kloon van het my vascular-virus die groen fluorescent proteïne tot expressie brengt.De moleculaire kloon is opgenomen in de plasmiden P8XSP5EGFP en P67or van respectievelijk 12 kilobases en 4,5 kilobases. Knip equimolaire hoeveelheden van de twee plasmiden, namelijk 4,4 microgram P8XSP5EGF

propagating-detecting-an-infectious-molecular-clone-maedi-visna-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

We hebben een lentivirale vector die, bezit naast de Tat-responsieve LTR, de Rev-respons element (RRE) die reporter genexpressie kan reguleren in een HIV-1-Tat en Rev-afhankelijke manier. De vector maakt de specifieke detectie van HIV-replicatie in levende cellen via de expressie van GFP.

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor intracerebroventriculaire en intravasculaire injectie van virale deeltjes of fluorescente microbeads in de neonatale muizenhersenen. Het lokalisatiepatroon van het virus en de nanodeeltjes kan worden gedetecteerd door microscopische evaluatie of door in situ hybridisatie.

Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain

Influenza A virussen (IAVs) zijn besmettelijke respiratoire pathogenen die jaarlijkse epidemieën en occasionele pandemie veroorzaken. Hier beschrijven we een protocol voor het opsporen van virale infecties in vivo met behulp van een roman recombinant plaats en fluorescentie-uitdrukken van bi-reporter iav (birflu). Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekend hulpmiddel om IAV in vivo te bestuderen.

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Dit protocol beschrijft de dynamiek van virale infecties met behulp van luciferase- en fluorescentie-expresserende recombinant (r)SARS-CoV-2 en een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) in K18 hACE2 transgene muizen om de behoefte aan secundaire benaderingen te overwinnen die nodig zijn om SARS-CoV-2-infecties in vivo te bestuderen.

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

Pseudogetypeerde virussen (PV's) zijn replicatie-defecte virionen die worden gebruikt om gastheer-virusinteracties te bestuderen onder veiligere omstandigheden dan het hanteren van authentieke virussen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat laat zien hoe SARS-CoV-2 PV's kunnen worden gebruikt om het neutraliserende vermogen van het serum van patiënten na COVID-19-vaccinatie te testen.

Gepseudotypeerde virussen als moleculair hulpmiddel om humorale immuunresponsen tegen SARS-CoV-2 te volgen via neutralisatietest

Leer de propagatie en detectie van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus met GFP-expressie in schapenchoroïd plexuscellen. Deze methode maakt kwantitatieve analyse van virale replicatie mogelijk.

Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan (Video) | JoVE Journal

Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan

Meer video's verkennen