Teeltmateriaal en Detecteren van een besmettelijke moleculaire kloon van Maedi-visna virus dat Green Fluorescent Protein geeft uiting aan

Het algemene doel van deze procedure is het voortplanten en detecteren van een infectieuze kloon van Mildy vs. No virus die groen fluorescent eiwit tot expressie brengt. Dit groen fluorescent eiwit is gekloond in het gen dat codeert voor D utp Ace in het genoom van het Myy Ner virus.

De infectieuze kloon is ondergebracht in twee plasmiden. Ten eerste worden de twee plasmiden die de myy Ner-sequenties bevatten gesneden met het restrictie-enzym xpa one en geligeerd. Ten tweede worden cellen van het plexus choroideus van schapen getransfecteerd met het construct.

Ten slotte worden cellen die geïnfecteerd zijn met het myy vino-virus gedetecteerd via fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie. Hallo, ik ben Stefano Neron van het TER Institute for Experimental Pathology aan de Universiteit van IJsland. Vandaag laten we u een procedure zien voor het propageren en detecteren van een infectieuze moleculaire kloon van het my vascular-virus die groen fluorescent proteïne tot expressie brengt.

De moleculaire kloon is opgenomen in de plasmiden P8XSP5EGFP en P67or van respectievelijk 12 kilobases en 4,5 kilobases. Knip equimolaire hoeveelheden van de twee plasmiden, namelijk 4,4 microgram P8XSP5EGFP en 1,6 microgram P67or met XPA1, en ligeer deze voorafgaand aan de transfectie. Wanneer de ligatie is voltooid, wordt het ligatiemengsel 15 minuten bij 65 °C geïncubeerd. Zaai twee dagen voor de transfectie 10⁶ SCP-cellen in een T25-kweekfles en kweek de cellen gedurende twee dagen in 5 milliliter DMEM aangevuld met 10% lamserum en 2 millimolar glutamine zonder antibiotica tot een monolaag met een confluentie van 90%.

Als de cellen na twee dagen nog geen 90%CO hebben bereikt, laat de cellen dan nog één extra dag groeien. Het lamsereum kan worden vervangen door foetaal runderserum FBS. Wij maken routinematig gebruik van lamsereum, aangezien sommige stammen van MVV worden geremd door FBS.

Deze MVV-stam wordt echter niet geremd door FBS. Wanneer de cellen klaar zijn voor transfectie, wordt het medium vervangen door DMEM met 1% lamserum of FBS zonder antibiotica. We gebruiken Lipofectamine 2000 voor transfectie; verdun het DNA in 500 µL Opti-MEM medium, verdun 20 µL Lipofectamine 2000 in 500 µL Opti-MEM medium en laat dit vijf minuten bij kamertemperatuur staan.

Combine na de incubatie van vijf minuten het verdunde DNA met de verdunde Lipofectamine 2000 tot een totaalvolume van 1000 µL. Meng voorzichtig en laat 20 tot 30 minuten incuberen. Voeg het transfectiemengsel bij kamertemperatuur toe aan de T 25-fles met SCP-cellen en mediummengsel door voorzichtig te schudden.

Incuberen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende de nacht. Vervang de volgende dag het medium door DMEM met 1% serum, 2 mM glutamine, 100 IU/mL penicilline en 100 IU/mL streptomycine. Controleer de productie van GFP in de SCP-cellen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

Een lage transfectie-efficiëntie kan worden verwacht bij deze primaire cellen, gewoonlijk tussen de 5% en 15%. Incubeer verder bij 37 °C, 5% CO2 gedurende enkele dagen om de verspreiding van het virus in de kolf mogelijk te maken. Voor een volledige infectie is gewoonlijk zeven tot 14 dagen nodig. Oogst het virus door het supernatant over te brengen naar Eppendorf-buisjes.

Centrifuge in een microcentrifuge bij 3000 rpm gedurende vijf minuten om celresten te verwijderen. Breng het supernatant dat het virus bevat over naar nieuwe buisjes.

Zaai 3 × 10⁴ SCP-cellen, bewaard bij -80 °C, in 100 µL DMEM-medium aangevuld met 10% serum, 2 mM glutamine, 100 IU/mL penicilline en 100 IU/mL streptomycine per well.

Incubeer in een 96-wells plaat bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Als de cellen de volgende dag confluent zijn, vervang dan het medium door DMEM met 1% serum. Verdun het virus als volgt, met 100 µL in elke well.

Voeg 180 µL DMEM met 1% serum per well toe aan vier keer 10 wells in een 96-well plaat met ronde of V-bodem voor seriële tienvoudige verdunningen in quadruplo. Voeg 20 µL virus toe aan elk van de vier wells in de eerste kolom van de plaat. Gebruik vervolgens een vierkanaalspipet om het monster meerdere keren op en neer te pipetteren om een grondige menging te garanderen.

Vervang de pipetpunten en breng 20 µL over naar de volgende vier wells, enzovoort. Laat de laatste wells zonder virus als negatieve controle. Voeg 100 µL van de virusverdunning toe aan de SEP-cellen en plaats deze in de incubator met medium.

37 °C en 5% koolstofdioxide. Observeer gedurende twee weken op GFP-fluorescentie en cytopathische effecten. Cytopathische effecten bestaan uit cellen die ronder en minder transparant worden dan normale cellen met uitlopers, eindigend met het verschijnen van multinucleaire cellen en celsterfte.

Bereken de virustiter met de Reid Munch-methode voor snelle monitoring van de virusreplicatie. Geïnfecteerde cellen kunnen worden onderzocht middels flowcytometrie trypsin. Er zijn ongeveer 10⁵ geïnfecteerde cellen.

Was één keer met PBS en resuspendeer in 500 µL PBS. Voeg 500 µL van een 4% paraformaldehyde-oplossing toe (2% eindconcentratie) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Pelleteer de cellen 5 minuten bij 3000 rpm.

Was twee keer gedurende vijf minuten met PBS en analyseer op een FACSScan-analyzer. Tel 10.000 events. De GFP-expresserende moleculaire kloon van mijn virus die hier wordt gepresenteerd, kan nuttig zijn voor het analyseren van virus-gastheerinteracties en de pathogeniciteit van mijn neurovirus, zowel in vivo als in vitro.

Hoewel nog niet is aangetoond dat mijn neurovirus menselijke cellen kan beïnvloeden, is het belangrijk om alle voorzorgsmaatregelen voor het biologische veiligheidsniveau in acht te nemen; zowel de cellen als het plasmide kunnen bij ons laboratorium worden verkregen. Veel succes met uw experimenten.