Name: Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer immunokleuring van perifere zenuwvezels in muishuid en botweefsel. Deze methode toont eiwitexpressie en innervatiepatronen voor inzicht in sensorische mechanismen van het perifere zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. M. Yuriy Usachev voor zijn hulp bij de eerste standaardisatie van confocale microscopie / beeldvorming van de muis plantaire punch biopsie immunokleuring, en Dr Donna L. Hammond voor haar voortdurende hulp en opbouwende kritiek in dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het NINDS / NIH (NS069898), en een idee-ontwikkeling Grant Award van het ministerie van Defensie Prostaatkanker Research Program (DoD-PCRP-101096) om DPM

1. Animal Perfusie Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa, en volg de NIH richtlijnen voor het gebruik van dieren in het onderzoek. <ol><li> Op de dag voor perfusie, bereiden een L van fosfaatbuffer (0,2 M PB in dubbel gedistilleerd H 2 O, pH 7,4), en bewaar bij 4 ° C. Deze zal worden gebruikt voor perfusie en post-fixatie processen. </li><li> Op de dag van perfusie, voor te bereiden 500 ml van 4,0% paraformaldehyde in 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) fixatief oplossing, een volume voldoende voor de doorbloeding van twee muizen: magnetron 200 ml van DDH 2 O in een bekerglas gedurende 30 sec of totdat nadert koken. Voeg 20 g van granulaire paraformaldehyde (PFA) in het bekerglas onder voortdurend roeren in een zuurkast. Voeg 5 ml 5 N NaOH druppelsgewijs en roer tot de oplossing wist. Wanneer de PFA helemaal is opgelost, koel de oplossing op kamertemperatuur (RT). Slowly voeg 250 ml van 0,2 M PB onder voortdurend roeren. Met behulp van steeds zwakker HCl oplossingen (6 N tot en met 1 N tot 0,1 N), breng de pH op 7,4. Stel het uiteindelijke volume tot 500 ml en chillen op het ijs. Ook voorbereiden 400 ml van 0,1 M PB van 0,2 M voorraad door verdunning van 1:1 in DDH 2 O en chillen op het ijs. </li><li> Verdoven de muis door intraperitonial injectie van een overdosis verdovingsmiddel (natrium-pentobarbital, 80 mg / kg, toegediend met een 27G naald). </li><li> Tijdens de perfusie, wordt 50 ml van 0,1 M PB (verdunnen 0,2 M PB voorraad 1:1 met DDH 2 O) en 150 ml van de PFA sequentieel worden doorberekend in de muis circulatie. Stel de peristaltische pomp door het vullen van de buis met PB en de vaststelling van een 23 1 / 2 G vlindernaald aan de ene kant. Dompel het andere uiteinde van de slang in het bekerglas met 0,1 M PB. De snelheid van de peristaltische pomp tot 10 ml / min, en de pomp door middel van een voldoende hoeveelheid van de oplossing om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de slang. </li><li> Wacht tot de eennesthetized muis niet meer vertoont enige reflex activiteit, zoals het toe / staart knijpen en knipperen reflex. Leg het dier op een dissectie lade ventrale zijde naar boven in een afzuigkap en zet de poten met tape. Spray de vacht met 70% ethanol. Maak een incisie door de huid over de middellijn aan de ribbenkast en het bovenste kwart van de buikwand bloot te leggen. Dan, dwars door de buikwand aan de onderkant van de ribbenkast. Na het maken van deze incisie, moet het membraan en de onderkant van het borstbeen zichtbaar zijn. Knip voorzichtig van links naar rechts door de marge van het middenrif, en langs de volle lengte van het borstbeen, zorg ervoor dat u de longen beschadigen. Enkele kleine bloeden van het borstbeen in deze fase is normaal en zal geen compromissen perfusie. Zodra de incisie langs het borstbeen is gemaakt en het middenrif snijden, moet het mogelijk zijn om elk de helft van de ribbenkast naar boven en naar buiten, zodat het hart wordt blootgesteld lift. Opzij de longen indien nodig. Beide helften van de ribbenkast kanworden gehouden in deze positie met het gebruik van hemostatische klemmen. Steek de naald vlinder (23 1 / 2 G), verbonden aan de peristaltische pomp 3-4 mm in de linker ventrikel, parallel aan de lange as van het dier. Deze plaatsing minimaliseert het risico van de naald te worden verdreven. Maak een kleine incisie in de rechterboezem, zodat de terugkeer circulatie te stromen van het hart. </li><li> Begin perfusie met 0,1 M PB op 10 ml / min voor 4-5 minuten. Als er nog steeds een aanzienlijke hoeveelheid bloed afkomstig van de rechterboezem op dit punt, doorgaan tot de stroom is duidelijk. </li><li> Stop de stroom van PB en schakel de inlaat van de peristaltische pomp om de 4% PFA-oplossing. Verminder het debiet tot 5 ml / min en weer pompen PFA-oplossing gedurende 20-25 minuten. Als de PFA komt in de bloedsomloop, de spieren gaan in spasme, en na een paar minuten, moet het dier letterlijk "vast" in positie. Deze stijfheid kan worden getest door zachtjes te duwen tegen de hindpaws, zorg ervoor dat u het dier te verplaatsen eennd los van de canule. Een goede doorbloeding wordt voorkomen dat de ledematen van buigen in reactie. Eenmaal perfusie met PFA is voltooid, kan de canule en hemostatische klemmen worden losgekoppeld en het kadaver voorbereid op weefsel dissectie. De gebruikte dissectie aanpak is afhankelijk van het specifieke weefsel. </li><li> Bereid 4% PFA / 5% (v / v) picrinezuur (PA; voor de inzameling en post-fixatie van plantar punch alleen) door toevoeging van verzadigde picrinezuur oplossing tot 4% PFA. Opname van PA verbetert aanzienlijk antigeen detecteerbaarheid in perifere neurale weefsels een </li><li> Bereid bot / kraakbeen ontkalking / cryoprotectant oplossing - 10% EDTA in 0,1 M PB met 0,07% glycerol en 15% sucrose. EDTA-gebaseerde oplossingen te ontkalken weefsel met behoud van epitopen 2. </li><li> Bereid de cryoprotectant oplossing - 30% sucrose in 0,1 M PB. </li></ol> 2. Tissue Dissection / verwijderen, Post-fixatie en snijden <ol><li> Plantaire Punch Plaats de perfused dier ventrale zijde naar beneden op een snijmat of een ander stevig oppervlak. Houd de voet voetzool-up, druk deze stevig aan met de punch biopsie gereedschap (3 mm diameter; Harris micro-punch, Ted Pella Inc) in het midden van de voet. Draai de biopsie gereedschap heen en weer door 180 graden te bevestigen dat de biopsie gereedschap heeft gesneden door de totaliteit van de achterpoot. Verwijder voorzichtig de biopsie tool van de voet en werpen het weefsel in steriele 2 ml buis met dop, die 1 ml van 4% PFA / 5% PA-oplossing. </li><li> Limb Bone (ex. femur) Maak een laterale incisie langs de achterkant van het dier op het niveau van het bekken, verder naar beneden langs beide achterpoten. Snijd in het bekken en de omringende spieren aan het dijbeen te scheiden van het bekken, terwijl het verlaten van de proximale kop van het dijbeen intact. Snijd in de tibia / fibula om te vertrekken van de distale kop intact, het verwijderen van de omliggende spieren / periost van het bot as. Plaats het dijbeen in een 2 ml buisje met 1 ml van 4% PFA /5% PA-oplossing. </li><li> De weefselmonsters Post-fix in 4% PFA / 5% PA-oplossing, met zachte mixen op een rocker voor 16-18 uur bij 4 ° C </li><li> Ontkalken het weefsel als volgt: Voor plantar punch (de kleine botten van de voet ontkalken) plaats het weefsel punch in een steriele 2 ml buis met dop, met 1,5 ml van 10% EDTA-oplossing in 0,1 M PB met 0,07% glycerol en 15 % sucrose. Plaats de buis op een rocker met een lichte mengen voor 16-18 uur bij 4 ° C. Voor ledematen botten plaats het weefsel in een steriel 2 ml buis met dop, met 1,5 ml van 10% EDTA-oplossing in 0,1 M PB met 0,07% glycerol en 15% sucrose. Plaats de buis op een rocker met een lichte mengen 6-7 dagen bij 4 ° C. De ontkalking oplossing moet worden veranderd elke 24 uur en het weefsel gecontroleerd voor het verlies van stijfheid met een pincet. </li><li> Overdracht van het weefsel in een steriel 2 ml buis met cap met 1,5 ml van cryoprotectant oplossing (30% sucrose in 0,1 M PB), en plaats de buis op een rocker wet mild voor het mengen van 16-18 uur bij 4 ° C. </li><li> Bereid weefsel voor het snijden: plaats een bed volume van een optimale snij-temperatuur (LGO) verbinding (Sakura Finetek USA Inc) op een cryostaat weefsel montageblok en laat bevriezen in de cryostaat kamer (meestal gehouden bij -20 ° C). Een cryogene aerosol (Cyto-vries, Control Co USA) kan ook worden gespoten op de LGO op de bevriezing proces te versnellen. Plaats weefselmonster op dit bed van de LGO en afdekken met een extra dunne laag van oktober Voorzichtig spuiten deze LGO met cryogene aerosol tot het is uitgehard en het weefsel binnen heeft bevroren. Plaats exemplaar op de snijkop in de cryostaat kamer en laat de weefselmonster blok in evenwicht op het uitsnijden temperatuur - ten minste 1 uur. Proberen om sectie wanneer de inbedding compound nog te koud resulteert in broos secties en weefselbeschadiging. </li><li> Zodra het weefsel heeft een optimale snij-temperatuur heeft bereikt, beginnen met het snijden van het monster en het genereren van 40 um secties. </li><li>Voor plantar stoot het verzamelen van de vriescoupes in 12-well weefselkweek platen die 0,1 M PB met 10 mM natriumazide. Zorg ervoor dat de secties blijven ondergedompeld in deze oplossing bij 4 ° C. Secties kunnen worden opgeslagen op deze manier voor maximaal 4-6 maanden voor immunokleuring doeleinden. Als alternatief kunnen vrij zwevende delen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen in cryoprotectant oplossing bij -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g sucrose, 10 g PVP40, 300 ml ethyleenglycol). Pas uiteindelijke volume te 1L met gedestilleerd water) 3. Voor de ledematen botten verzamelen van de vriescoupes direct op gelatine pre-gecoate glaasjes (of Superfrost Plus dia's, Fisher Scientific) en laat aan de lucht drogen gedurende 1 uur, voordat u bij -20 ° C. Bone secties op dia's worden opgeslagen op deze manier kan worden gebruikt voor immunokleuring doeleinden binnen 2-3 maanden. </li></ol> 3. Immunokleuring van weefselcoupes voor sensorische zenuwvezels 3.1. Plantaire punchsecties - drijvende gedeelte vlekken <ol><li> Met behulp van een scheermesje, knippen 6-7 mm van het einde van een 1 ml micropipet tip. Voorwaarde de binnenkant van de tip met aspireren 1% foetaal bovine serum (FBS) in 0,1 M PB meerdere malen (dit remt kleven van het weefsel secties om de muren van de tip). Transfer plantar punch secties te worden gemerkt met een 24-well weefselkweek plaat. Normaal 80 tot 10 secties moeten worden gekleurd per goed om ervoor te zorgen verschillende kwalitatief hoogwaardige onderdelen worden gegenereerd per immunokleuring. </li><li> Was plantar punch secties met 500 pi van 0,1 M PB per goed voor 5 min met krachtig mixen op een rocker bij RT. Herhaal dit twee keer. </li><li> Gooi de wasoplossing en incubeer de plantaire punch secties in het blokkeren oplossing, bestaande uit 10% geit serum en 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB (500 pi van het blokkeren oplossing per well), met zachte mixen op een rocker gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Gooi het blokkeren oplossing en incubeer het weefsel secties in het lager antibody / antilichamen verdund in 250 ul het blokkeren oplossing voor 18-24 uur met zachte mixen op een rocker bij 4 ° C. Gebaseerd op experimentele eisen onderzoeker, single immunokleuring (met een primair antilichaam tegen een specifiek eiwit of een zenuwvezel marker), of dubbele immunokleuring (met twee primaire antilichamen tegen twee eiwitten of zenuwvezel markers) kan worden uitgevoerd op dezelfde afdeling. Tijdens het uitvoeren van dubbele immunokleuring is het belangrijk om te controleren dat de twee gebruikte primaire antilichamen worden opgewekt in verschillende gastheersoorten (bijv. een getogen in muis en een getogen in konijn), of als alternatief, gezuiverde monoklonale antilichamen van verschillende immunoglobuline G (IgG) isotypen (bv een IgG1 en een IgG2a) kunnen gebruikt worden. Het is raadzaam om de plaat afdichting met Parafilm voor overnachting incubaties te grote verdamping te voorkomen. Met het oog op de perifere sensorische zenuwvezels vlek, kan een aantal specifieke antilichamen worden gebruikt. Antistoffen tegen het eiwit neurofilament 200 (NF200, Sigma) label large-diameter vezels, terwijl calcitonine gene-related peptide (CGRP, Sigma) en transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1, Neuromics) label peptiderge, kleine diameter perifere sensorische vezels. Alle perifere zenuwvezels kan ook worden gekleurd met antilichamen tegen β3-tubuline. In de huid, wordt collageen IV (Abcam) gebruikt om het basaal membraan, dat de opperhuid scheidt van de dermis af te bakenen. Als algemene regel geldt, antilichamen moeten worden 5-10 keer meer geconcentreerd dan voor gekweekte cel-gebaseerde immunofluorescentie testen, meestal op een werkende concentratie van 5-10 ug / ml. </li><li> Was de weefselcoupes met 500 ul van het blokkeren oplossing (met Triton X-100) per goed voor 5 min met krachtig mixen op een rocker bij RT. Herhaal dit 3 keer. </li><li> Gooi de wasoplossing en incubeer weefselcoupes in de juiste fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen (meestal verdund in het blokkeren van 1:1000 oplossing, 500 pl) met voorzichtig mengen op een rocker bij 4 ° C. De plaat must worden verpakt in aluminiumfolie om te voorkomen dat fotobleken van fluoroforen. </li><li> Was de weefselcoupes met 500 ul van het blokkeren oplossing per goed voor 10 minuten met krachtig mixen op een rocker bij RT. Daarna wassen met 500 pi van 0,1 M PB met een krachtig mengen gedurende 10 minuten bij RT. Tot slot, wassen met 500 pi van 0,05 M PB met een krachtig mengen gedurende 10 minuten bij RT. </li><li> Met behulp van een 1 ml micropipet met een FBS behandeld tip (gesneden 6-7 mm van het einde), zuigen de secties van de weefselkweek plaat en overzetten naar SuperFrost Plus microscoop dia's. Schik de secties en absorberen overtollig wasbuffer met een fijn penseel. Vermijd langdurige blootstelling aan licht. Incubeer de glaasjes op RT, zodat secties secties op dia (5-30 min) droog. </li><li> Verschillende druppels montage medium (ProLongGold, Vectashield of iets dergelijks), langzaam plaats een glazen dekglaasje op secties. Laat de dia's in het donker te zitten gedurende 5 minuten, en dan de dekglaasje randen afdichting met transparante nagelpolish. Laat drogen aan de lucht voor 15-20 minuten. De dia's kunnen nu gevisualiseerd of bewaard bij -20 ° C te zijn voor een aantal jaren zonder noemenswaardige verlies van fluorescentie. </li></ol> 3.2. Limb bot secties - on-slide vlekken <ol><li> Laat de dia's om naar terug te keren RT van -20 ° C opslag. Met behulp van een hydrofobe barrière pen (Super Pap Liquid blokkeren Pen, Ted Pella Inc) omschrijven de regio op de dia met het bot secties te worden gemerkt met een royale laag van de oplossing. Laat droge lucht gedurende 10-15 minuten. </li><li> Was het bot secties met 250 pi 0,1 M PB per glijbaan voor 5 minuten en herhaal voor twee keer. </li><li> Gooi de wasoplossing en incubeer het bot secties in het blokkeren oplossing, bestaande uit 10% geit serum en 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB (250 ul van het blokkeren oplossing per slide) gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Gooi het blokkeren oplossing en incubeer het bot secties in het primaire antilichaam (of een combinatie van primaire antilichamen, in het gevalvan dubbele immunokleuring zoals vermeld onder 3.1.4) verdund in 250 ul het blokkeren oplossing voor 18-24 uur bij 4 ° C. Het is erg belangrijk op te merken dat de dia's moet worden geplaatst in een vochtige kamer met een gesloten deksel, om te voorkomen dat ze uitdrogen van de primaire antistof oplossing. Met het oog op de perifere sensorische zenuwvezels vlek, de hierboven genoemde set van antilichamen (zie paragraaf 3.1.4) kan worden gebruikt met vergelijkbare werkomgeving concentraties. </li><li> Was de weefselcoupes met 250 ul van het blokkeren oplossing (met Triton X-100) per slide gedurende 15 minuten bij RT en herhaal voor de 3 keer. </li><li> Gooi de wasoplossing en incubeer het bot in de juiste secties fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen (meestal verdund in het blokkeren van 1:1000 oplossing, 250 pl) bij 4 ° C. De kleuring kamer moet worden verpakt in aluminiumfolie om te voorkomen dat fotobleken van fluoroforen. Voor het gemak is het raadzaam om donker gekleurde vlekken kamers (bijv. Dia incubatie tray / doos, RPI Corp) te gebruiken. </li><li> Was op het bot secties met 250 ul van het blokkeren oplossing per dia gedurende 15 min bij RT. Daarna wassen met 500 pi van 0,1 M PB gedurende 15 min bij RT. Tot slot, wassen met 500 pi van 0,05 M PB gedurende 15 min bij RT. Dip kort in DDH 2 O om dia's te spoelen en vervolgens incubeer bij kamertemperatuur, om het bot secties laten drogen aan de lucht (5-30 min). Vermijd langdurige blootstelling aan licht. </li><li> Verschillende druppels montage medium (ProLongGold of vergelijkbaar) en langzaam een ​​glazen dekglaasje plaatsen op secties. Laat de dia's staan ​​in het donker gedurende 5 minuten, en dan sluit de dekglaasje randen met transparante nagellak. Laat drogen voor 15-20 minuten. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende enkele jaren zonder verlies van fluorescentie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten 4.1. Plantaire punch secties Plantaire punch weefselcoupes kunnen worden gevisualiseerd onder epifluorescentiemicroscoop of onder een confocale microscoop met een 10x, 40x of 63x objectief. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. AD tonen kleuring met collageen IV antilichaam (groen) in de kelder van membranen, op de epidermale-dermale kruising en in kraakbeen en spieren. Talrijke CGRP-(AB, rood) en NF200-positieve vezels (CD, rood) zijn verdeeld over de muis huid in de plantaire regio (pijlen). β3-tubuline is een pan-neuronale marker (E, rood), terwijl TRPV1 vlekken (F, red) is voornamelijk beperkt tot een kleine diameter vezels die ook CGRP-positief (groen, pijlpunten). A en C zijn epifluorescentie beelden die met een 10X objectief (schaal bar -500 micrometer), B, D, E en F zijn confocale beelden composieten gegenereerd op basis van een 11-image z-stack die op twee stappen van um onder een 60X objectief (schaal bar - 50 pm). 4.2. Limb bot secties Limb botweefsel secties kunnen ook gevisualiseerd worden onder epifluorescentiemicroscoop of onder een confocale microscoope met een 10x, 40x of 63x objectief. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> . Figuur 2 toont immunokleuring met anti-CGRP (AB, rood; pijlen), anti-NF200 (CD, rood; pijlen), anti-β3-tubuline (E, rood) en anti-TRPV1 (F, rood) co-gekleurde met anti-CGRP antilichaam (groen; pijlen). Deze beelden tonen subtypes van sensorische zenuwvezels verspreid over het hele bot matrix in het sponsachtige hoofd regio van muis dijbeen. A en C zijn epifluorescentie beelden die met een 10X objectief (schaal bar -500 micrometer), B, D, E en F zijn confocale beelden composieten gegenereerd op basis van een 11-image z-stack die op twee stappen van um onder een 60X objectief (schaal bar - 50 pm).

<ol><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixative+Composition+Alters+Distributions+of+Immunoreactivity+for+Glutaminase+and+Two+Markers+of+Nociceptive+Neurons%2C+Nav+1.8+and+TRPV1%2C+in+the+Rat+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).</li>
<li>Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+decalcifying+agents+on+EGF+and+EGFR+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining.</a> Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7, 155-159 (1986).</li>
<li>Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+sprouting+and+changes+in+nociceptive+sensory+innervation+in+the+glabrous+skin+of+the+rat+hind+paw+following+partial+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury.</a> The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).</li>
<li>Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+loss+corresponds+to+the+development+of+Taxol-induced+hyperalgesia+and+can+be+prevented+by+treatment+with+minocycline%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline.</a> Pain. 152, 308-313 (2011).</li>
<li>Bloom, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer-Induced+Bone+Remodeling%2C+Skeletal+Pain%2C+and+Sprouting+of+Sensory+Nerve+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers.</a> The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).</li>
<li>Constantin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Tumor+Necrosis+Factor+%CE%B1+%28TNF%CE%B1%29+Requires+TNF+Receptor+Type+2+to+Generate+Heat+Hyperalgesia+in+a+Mouse+Cancer+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model.</a> J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).</li>
<li>Jankowski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+Cutaneous+Nociceptors+after+Nerve+Transection+and+Regeneration%3A+Possible+Role+of+Target-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).</li>
<li>Jimenez-Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+Sprouting+of+Adult+Nociceptors+in+Chronic+Prostate+Cancer-Induced+Bone+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain.</a> J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).</li>
<li>Persson, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium-calcium+exchanger+and+multiple+sodium+channel+isoforms+in+intra-epidermal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals.</a> Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).</li>
<li>Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+Enterotoxin+B+Causes+Proliferation+of+Sensory+C-Fibers+and+Subsequent+Enhancement+of+Neurogenic+Inflammation+in+Rat+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin.</a> Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).</li>
<li>Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+loss+of+peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+an+STZ-induced+mouse+model+of+insensate+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy.</a> Pain. 140, 35-47 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hier hebben we gedetailleerd de methodes voor de voorbereiding van de huid van muizen en botweefsel secties voor immunokleuring en detectie van perifere sensorische zenuwvezels. De secties uit plantaire stansbiopsieën bevatten zowel kaal en behaarde huid, wat betekent dat het protocol dat gebruikt kan worden op elk huidtype. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om andere soorten cellen vlek in deze weefsels (bijv. leukocyten, vasculaire endotheel, glad spierweefsel onder andere). Deze methoden zorgen voor een uits...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal Naam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nee. </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> 3mm Harris Micro-Punch </td><td> Materiaal </td><td> Ted Pella </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusie pomp </td><td> Materiaal </td><td> VWR International </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Pikrinezuur </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> Oktober Embedding compound </td><td> Reagens </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cyto-Freeze cryogene spuitbus </td><td>Materiaal </td><td> Controle Bedrijf </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> Geit Serum </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatie tray en deksel voor Immunokleuring (Large) </td><td> Materiaal </td><td> RPI Corp </td><td> 248270 (lade) 248270-A (deksel) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge hydrofobe barrière pen </td><td> Materiaal </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Camel&#39;s Hair Borstels (# 1 dikte) </td><td> Materiaal </td><td> Ted Pella </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Long Gold Montage medium </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

tissue voorbereiding en immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen bones

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detectie en de primaire verwerking van fysische, chemische en thermische zintuiglijke prikkels door perifere sensorische zenuwvezels is de sleutel tot zintuiglijke waarneming bij dieren en mensen. Deze perifere sensorische zenuwvezels drukken een overvloed aan receptoren en ionkanaal eiwitten die op te sporen en aanzet geven tot specifieke zintuiglijke prikkels. Methoden beschikbaar om de elektrische eigenschappen van perifere sensorische zenuwvezels innerveren de huid, die ook kan worden gebruikt om de functionele expressie van specifieke ion kanaal eiwitten in deze vezels te identificeren karakteriseren. Echter, soortgelijke elektrofysiologische methoden zijn niet beschikbaar (en zijn ook moeilijk te ontwikkelen) voor de detectie van de functionele expressie van receptoren en ionkanaal eiwitten in de perifere sensorische zenuwvezels innerveren andere inwendige organen, inclusief de meest uitdagende weefsels, zoals bot. Bovendien kan een dergelijke elektrofysiologische methoden niet worden gebruikt om de expressie van niet-opgewonden eiwit te bepalens in de perifere sensorische zenuwvezels. Daarom, immunokleuring van perifere / viscerale weefselmonsters voor sensorische zenuw fivers biedt de best mogelijke manier om de expressie van specifieke eiwitten van belang in deze zenuwvezels te bepalen. Tot nu toe hebben de meeste van de eiwitexpressie studies in sensorische neuronen gebruikt immunokleuring procedures in sensorische ganglia, waar de informatie wordt beperkt tot de expressie van specifieke eiwitten in de cel lichaam van specifieke soorten of subsets van sensorische neuronen. Hier hebben we rapport gedetailleerde methoden / protocollen voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. We specifiek detail methoden voor de voorbereiding van de huid of plantaire punch biopsie en been (femur) secties van muizen voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. Deze methoden zijn niet alleen essentieel voor de kwalitatieve bepaling van eiwitexpressie in de perifere sensorische neuronen, maar bieden ook een kwantitatieve bepalingsmethode voor dehet bepalen van veranderingen in eiwit expressie niveaus in bepaalde soorten of subsets van sensorische vezels, alsmede voor het bepalen van de morfologische en / of anatomische veranderingen in het aantal en de dichtheid van sensorische vezels tijdens verschillende pathologische toestanden. Verder zijn deze methoden niet beperkt tot de kleuring van enige zintuiglijke zenuwvezels, maar kan ook worden gebruikt voor het kleuren alle soorten zenuwvezels in de huid, botten en andere viscerale weefsel.

Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

De detectie en primaire verwerking van fysieke, chemische en thermische sensorische stimuli door perifere sensorische zenuwvezels zijn essentieel voor de sensorische perceptie in ...

Het algemene doel van deze procedure is om inzicht te verkrijgen in de anatomische organisatie, evenals de expressie- en lokalisatieprofielen van specifieke eiwitten in perifere zenuwvezels die weefsels zoals huid en bot innerveren. Dit wordt bereikt door eerst een volledige perfusie van het dier met fixatief uit te voeren, gevolgd door dissectie of verwijdering van het betreffende weefsel. Vervolgens worden de geïsoleerde weefsels gepostgefixeerd en worden de botten gedecalcificeerd; met behulp van een cryostaat worden fijne coupes van huid- en botweefsel gemaakt en op objectglazen gemonteerd.De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van enkelvoudige of meervoudige label-immunokleuring van deze weefselcoupes met antilichamen tegen eiwitten die specifiek tot expressie zijn gekomen en gelokaliseerd zijn op perifere zenuwvezels. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het distributiepatroon van specifieke typen perifere zenuwvezels tonen, evenals het expressie- en/of lokalisatiepatroon van specifieke eiwitten in perifere zenuwvezels via immunofluorescentiemicroscopie met gebruik van een epifluorescentie- of confocale microscoop. Deze aanpak kan worden gebruikt om

tissue-preparation-immunostaining-mouse-sensory-nerve-fibers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the immunohistochemical staining of cholinergic fibers in the nucleus basalis of the Meynert region of mouse brain sections. Sections are blocked and treated with primary against choline acetyltransferase, followed by biotinylated secondary antibodies. Avidin-biotin-peroxidase complexes are added, which bind to secondary antibodies, followed by the chromogenic substrate. Sections are then dehydrated and mounted before visualizing under the microscope.

Immunohistochemical Staining of Nerve Fibers in the Nucleus Basalis of Meyner of the Mouse Brain

Source: Boyer, N. P. et. al., Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates the fluorescence photoactivation method to analyze neurofilament transport in myelinated axons of peripheral nerves. By tracking photoactivated green fluorophore-tagged neurofilaments, the technique provides insights into axonal transport in neurodegenerative diseases.

Fluorescence Photoactivation Imaging of Neurofilament Transport in Myelinated Mouse Axons 

Het protocol voor dynamische longitudinale beeldvorming en selectieve laser laesie van zenuwuiteinden in reporter transgene muizen wordt gepresenteerd.

In vivo twee-foton microscopie van de Single zenuwuiteinden in de huid

Muscle sensorische neuronen betrokken zijn bij proprioceptor signaleren en rapporteren over metabole toestand en verwondingen gerelateerde gebeurtenissen. We beschrijven een volwassen muis in vitro spier-zenuw voorbereiding op studies over-stretch geactiveerde spieren afferenten.

Een In Vitro Adult Mouse spier-zenuw Voorbereiding voor het bestuderen van de Firing Eigenschappen van Muscle afferenten

Hier beschrijven we een nieuwe voorbereiding voor het beeldvormen van levende lancetvormige sensorische terminalen van palissade-uiteinden die tijdens kleuring en ontkleur met styryl pyridinium kleurstoffen de haarzakjes van de muizenoorhuid innerveren.

Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear Skin

Dit artikel bevat gedetailleerde protocollen voor genetische markering van muizenhuid, chirurgische denervatie, huidbiopsie en visualisering van gelabelde epitheel door gehele-mount β-galactosidase kleuring. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de vereiste voor zenuwen in muismodellen van normale en pathologische huid te testen.

Cutane Chirurgische denervatie: een methode voor de Eis Testen op Zenuwen in muismodellen van huidziekte

Deze studie stelt een experimenteel model van pure kleine vezel neuropathie met resiniferatoxin (RTX). Een unieke dosis RTX (50 µg/kg) is optimaal voor het ontwikkelen van een kleine vezel neuropathie model dat bootst de kenmerken van de patiënt en kan helpen bij het onderzoeken van de Nociceptieve moleculaire betekenis onderliggende neuropatische pijn.

Tot vaststelling van een muismodel van een zuivere kleine vezel neuropathie met de Ultrapotent Agonist van voorbijgaande Receptor potentiële Vanilloid Type 1

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van fijne structuren van perifere zenuwen door verkrijgen en 1-2 µm secties met toluïdine blauwe...

Toluïdine blauwe verkleuring van de hars-ingebedde secties voor evaluatie van de morfologie van de perifere zenuwen

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.

Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Dit manuscript presenteert een protocol voor het chirurgisch verwijderen van de postganglionische lumbale sympathische neuronen van een muis. Deze procedure zal een groot aantal onderzoeken mogelijk maken die gericht zijn op het onderzoeken van de rol van sympathische innervatie in distale weefseldoelen.

Chirurgische lumbale sympathectomie bij muizen

Leer immunokleuring van perifere zenuwvezels in muishuid en botweefsel. Deze methode toont eiwitexpressie en innervatiepatronen voor inzicht in sensorische mechanismen van het perifere zenuwstelsel.

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

Meer video's verkennen