Name: Voorbereiding van de Intact Bovine Tail tussenwervelschijven voor orgel Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Leer hoe u intacte tussenwervelschijven uit runderstaarten prepareert voor orgaan-cultuur. Deze methode omvat desinfectie, spierverwijdering, snijden met een aangepast gereedschap en reiniging met een jet-lavage-systeem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNF # 310030-127586/1).

1. Tussenwervelschijf Oogsten <ol><li> Gehele lengte van runderen staart is verkregen uit een lokaal slachthuis, indien mogelijk, zonder huid, omdat de aanwezigheid van de huid verhoogt de kans op besmetting (figuur 2). </li><li> Bereid grote snijplank en voor te bereiden steriele werkplek en instrumenten op de top van een snijplank (fig. 2). </li><li> Voor te bereiden onder de steriele laminaire stroming kap steriel gaas bevochtigd met 0,9% natriumchloride bevat 55mm natriumcitraat en in elke well van de 6-wells plaat. </li><li> Bereid een wastafel en verdun 1:100 Betadine-oplossing met kraanwater. </li><li> Dompel de hele runderen staart in een bassin met 1% Betadine-oplossing gedurende 5 minuten. </li><li> Kort droog staart met steriel gaas en plaats het op steriele werkplek. </li><li> Verwijder voorzichtig de spieren rond de staart met een scalpel # 22. </li><li> Hak weg de delen van de staart, die niet nodig zijn, meestal beide uiteinden van de staart, bevatten relatief grote en zeer kleineIVD's (afb. 3). </li><li> Trim verder de spieren en pezen rond de IVD met behulp van scalpel # 10. Pas op niet naar de buitenste ring van de schijven snijden. </li><li> Markeer de voorste van de IVD met een chirurgische huid marker (deze stap is optioneel, het helpt bij het bepalen van de centrum voor axiale rotatie in onze bioreactor). </li><li> Zoek de IVD-en wervel aansluiting door het bewegen van de staart zachtjes. Voel de grens tussen IVD en bot met de doffe kant van een scalpel. De site moet het splitsen van 1-2 mm weg van de IVD de richting van de wervel te zijn. Plaats op maat gemaakte industriële meshouder op de splitsen van site (afb. 4). </li><li> Aankleven IVD en wervel door het hameren op de top van de op maat gemaakte industriële mes houder (afb. 3). </li><li> Herhaal aan de andere kant van de IVD-wervel-verbinding. </li><li> Wrap geïsoleerde IVD met steriel gaas bevochtigd met 0,9% natriumchloride bevat 55mm natriumcitraat. </li><li> Ga door het isolement van IVD om het gewenste sample nummer (meestal rond de 6 kunnenworden geoogst met een diameter tussen 10-20 mm). </li><li> Sluit de jet lavage systeem (Zimmer, inc.) Met een oplossing steriele Ringer lactaat, 5L tassen zijn een handig formaat (alternatief steriele PBS of 0,9% zoutoplossing). </li><li> Houd de IVD met een tang en jet-lavage beide zijden van de eindplaat oppervlak met behulp van Zimmer Pulsavac jet-lavage systeem (Fig. 1C). De jet kanon moet worden opgenomen op de eindplaat oppervlak in een hoek tussen 30 - 60 ° voor ongeveer 30 seconden aan elke kant. (Figuren 1 en 7) </li><li> Plaats de IVD aan de 6-well plaat en wrap met bevochtigd gaas, terwijl jet het wassen van een andere disc monster. </li><li> IVD's zijn klaar voor orgel cultuur en down-stream-toepassingen (bv. levensvatbaarheid van de cellen, mechanische belasting, orgelcultuur) (fig. 1D). </li></ol> 2. Representatieve resultaten Het meten van resultaten om een ​​succesvolle tussenwervelschijf voorbereiding rechter kan een diffusie experiment zijn, waar een klein moleculair gewicht fluorescerende kleurstof (bijv. Proción rood)wordt bereid als een 1% oplossing in PBS 2. De IVD wordt gehouden met ten minste 100 ml kleurstof oplossing en de kleurstof is dan toegestaan ​​om passief diffunderen in het IVD voor 24 uur onder vrije zwelling. De IVD is dan snel bevroren in vloeibare stikstof en teruggebracht tot kamertemperatuur en uitgedroogd door een reeks van aceton transfers (eerste pre-gekoeld in -80 ° C, dan -20 ° C, dan 4 ° C en tenslotte op kamertemperatuur ). De schijf kan dan worden ingebed in poly-methyl-acrylaat (PMMA) en snijd met een scherp mes tot 100 urn dikke secties te produceren. Deze secties kunnen vervolgens worden bekeken door elke standaard helderveld microscoop, maar bij voorkeur door het gebruik van fluorescentie microscopie, omdat Proción rood straalt een rode fluorescentie (afb. 5-6). De trabeculi van het benige oppervlak lijken erg schoon te maken na de jet lavaging stap (afb. 7). Parameters voor een succesvolle orgelcultuur zijn in de eerste plaats de afwezigheid van besmetting, onderhouden levensvatbaarheid van de cellen (fig. 8-9), schijf hoogte entotale "disc integriteit ', gemeten met histologische secties en safranine O / snel groene vlek of Meyer Hematoxilin 3. We hebben protocollen en macro's gepubliceerd elders 4,5 tot leven schijf weefsel vlek en levensvatbaarheid van de cellen in 3D met behulp van een confocale laser scanning microscoop en de live / dode vlekken kit (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Zwitserland) te scannen. We hebben verder ontwikkeld een macro-en routine om geautomatiseerde cel tellen levensvatbaarheid van de cellen schatten in 3D weefsel of 3D-dragers met de NIH ImageJ platform 4-6 uit te voeren. Alternatieve protocollen zijn voorgesteld om levensvatbaarheid van de cellen van de disc cellen te bepalen door de eerste digestie met sequentiële vertering van de extracellulaire matrix met behulp van pronase en collagenase type 2 en vervolgens naar de celsuspensie 7 vlek. Een eerdere versie van het protocol betrokken een incubatie stap in PBS dat tien keer meer geconcentreerd penicilline / streptomycine concentratie voor 10min na de oogst van de schijven voorafgaande orgel culture. Met de jet lavage stap voor deze stap in onbruik is geraakt, omdat deze stap lijkt gunstig voor het kweken van doeleinden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Overzicht van de methodologische stappen van boviene coccygeale tussenwervelschijven te bereiden met intacte eindplaten en een dunne laag (1-2mm) van het bot. A) Schematische weergave van de tussenwervelschijf (IVD) en de voedingswaarde paden. B) Procedure uit te snijden van de IVD met een op maat gemaakte blade-houder en een industriële scherp mes. C) Jet lavage stap op weg naar een hoge levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen en de voedingsstoffen uitwisselen houden van de eindplaten en 1-2 mm van het bot bevestigd aan beide zijden mogelijk te maken. D) Tot slot de IVD kunnen worden gekweekt in het monster kamer van een bioreactor of worden gebruikt voor enig down-stream applicatie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 TOP:. Volle lengte vers vlees van runderen staart (idealiter obtaINED binnen 2-3 uur post-mortem om hoge levensvatbaarheid van de cellen te verzekeren. Bottom: X-ray beeld van een rund staart van rond de zes maanden illustreren het bestaan ​​van de groeischijven (GP), secundaire centrum van verbening, tussen de benige eindplaten (EP) en de wervel lichamen (VB). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. A) Tools om de runderen staart ontleden onder steriele omstandigheden. B) op maat blade-houder voor cut-out motionele segmenten van de runderen staart in actie tijdens het snijden van de tussenwervelschijf. C) Side-view van de aangepaste blade-houder met een standaard industriële mes (Lutz, Duitsland). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Tekenen en foto van de runderen staart na het verwijderen van de omliggende spieren en gewrichtsbanden ter illustratie van de splijten websites uit te snijden van de bewegingstaal segmenten. Gedeeltelijke wervel moet worden "gekraakt" wie de custom-made mes houder ideaal 1-2 mm afstand van de kraakbeenvissen eindplaten om volledige botoppervlak te verzekeren. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Demonstratie van de effectieve reiniging van de jet-lavage stap voor (A) en na (B). Let op de schone benige oppervlakken van de tussenwervelschijf segmenten na de spuiten procedure. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Free-zwelling diffusie experiment van vers bereide weggesneden runderen staart tussenwervelschijven (IVD's) links voor 24 uur in 1% Proción rode oplossing, waaruit blijkt verstopping effect door de groeischijf. Een digitale X-ray sagittale weergave van een IVD nog steeds met de groeischijf en een tweede laag van het bot fluorescentie microscopie imago van sagittale dwars door de coccygeale runderen tussenwervelschijf Explantatie met kraakbeen en bot eindplaat na 24h free diffusie. GP: groei plaat, 2ndry CO: secundaire centrum van verbening. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Gratis-zwelling experiment van de vers bereide weggesneden runderen staart tussenwervelschijven (IVD's) links voor 24 uur in 1% Proción rode oplossing, waaruit blijkt reinigende werking van jet lavage behandeling. Sagittale dikke secties (~ 100 mm) van de uitgesneden runderen IVD's met ~ 1.5-mmthick benige eindplaten dat jet lavage behandeling (links) controle kant ondergingen zonder behandeling (rechts) jet-lavaged behandeling. Inlaat laat de spray patroon, dat werd gebruikt van de Zimmer wond debridement systeem 24u gratis verspreiding experimenten van runderen tussenwervelschijf explantaten in 1% Proción rood. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. Live / Dead Beelden van projecties van confocale Imaging stapels (250μm) uit bovine tussenwervelschijf segmenten die met deze jet-lavage methode gehouden onder free-zwelling voor de 0 en 14 dagen respectievelijk voor de nucleus pulposus (NP), de binnenste annulus fibrosus (IA) en de buitenste annulus fibrosus (OA). Groene cellen = levende cellen gekleurd door calceïne AM (acetyl methylester), rode bloedcellen = dode cellen kern gekleurd door ethidium-homodimeer-1. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 9"> Figuur 9. Levensvatbaarheid van de cellen van de tussenwervelschijf met behulp van confocale laser scanning microscopie van levende weefsel-en 3D-stack scannen. Levensvatbaarheid van de cellen van de nucleus pulposus (NP) en Annulus Fibrosis (AF) over de 21-dagen-cultuur onder vrije-zwelling conditie. (Gemiddelde ± SEM, N = 6) Statistische verschillen werden getest met behulp van niet-parametrische Kruskal-Wallis Signed Rank som te testen tussen groepen. Significante verschillen werden gevonden tussen dag 21 en alle andere tijdstippen in het NP. Terwijl in AF significante verschillen werden gevonden tussen dag 7 tot en metdag 0. (* P &lt;0,05, ** p &lt;0,01).

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De eerste stap voor een succesvolle orgelcultuur is om ervoor te zorgen dat de explantatie niet moet worden besmet. De staart moet worden gevild voordat u start met de procedure. Alle dierlijk haar gebracht in een steriele laboratorium kan problematisch zijn in termen van besmetting. De runderen staart moet bij voorkeur zo vers mogelijk (dit van invloed op de initiële levensvatbaarheid van de cellen). Bovendien wordt de Betadine wasstap aanbevolen om het risico van besmetting nog verder afneemt. In plaats van het gebrui...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td colspan="4"> Vers vlees van runderen tussenwervelschijf weefsel van runderen staarten, bij de plaatselijke slacht huis (idealiter binnen enkele uren post-mortem en zonder huid). </td></tr><tr><td> Pulsavac Plus AC-systeem </td><td> Zimmer inc., Zwitserland </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> Beste prestaties met de heup-spray hoofd en met AC voeding (de een met de 8 AA-batterij heeft ook werken, maar is minder handig) </td></tr><tr><td> High Capacity Fan Spray w / Splash Shield, 12.7cm lengte </td><td> Zimmer inc., Zwitserland </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> Er zijn verschillende sproeikoppen beschikbaar is, hebben we deze een succes </td></tr><tr><td> Scalpelmesjes # 22 en # 10 </td><td> Swann-Mortop, Engeland </td><td> # 10: 0201 # 22: 0208 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel meshouder # 3 en # 4 </td><td> Hausmann, Duitsland </td><td> # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz industriële mes </td><td> Lutz, Duitsland </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> Invitrogen, Zwitserland </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Gibco, Zwitserland </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Lactaat oplossing (zonder glucose) </td><td> Bichsel, Zwitserland </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well multi-well plaat </td><td> TPP, Zwitserland </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine oplossing </td><td> Mundipharma, Zwitserland </td&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische huid marker </td><td> Porex Chirurgische, Zwitserland </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> Grote snijplank </td><td></td><td></td><td> Elk merk is mogelijk </td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de intact bovine tail tussenwervelschijven voor orgel cultuur

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

De tussenwervelschijf (IVD) is het gewricht van de wervelkolom verbinden wervel naar wervel. Het functioneert het laden van de wervelkolom doorgeven en de flexibiliteit te geven aan de wervelkolom. Het bestaat uit een drie compartimenten: de binnenste nucleus pulposus (NP), omvat door de annulus fibrosus (AF), en twee kraakbeen eindplaten het aansluiten van de NP en AF aan het wervellichaam aan beide zijden. Discogene pijn mogelijk veroorzaakt door degeneratieve tussenwervelschijf ziekte (DDD) en herniaverwijdering is geïdentificeerd als een groot probleem in onze moderne samenleving. Voor het bestuderen van mogelijke mechanismen van de IVD-degeneratie, zijn in vitro orgelcultuur systemen met een live-cd cellen zeer aantrekkelijk. De in vitro cultuur van intacte runderen coccygeale IVD&#39;s is gevorderd tot een relevant model systeem, dat de studie van mechano-biologische aspecten in een goed gecontroleerde fysiologische en mechanische omgeving mogelijk maakt. Bovine staart IVD&#39;s kan worden verkregen relatief eenvoudig in hogere aantallen eend zijn zeer vergelijkbaar met de menselijke lumbale IVD&#39;s met betrekking tot cel-dichtheid, celpopulatie en afmetingen. Echter, vorige runderen staart IVD oogsttechnieken behoud van kraakbeen en bot eindplaten eindplaten niet na 1-2 dagen van cultuur sinds de voedings-routes zijn duidelijk geblokkeerd door geronnen bloed. IVD&#39;s zijn de grootste avasculaire organen, dus de voedingsstoffen naar de cellen in het NP uitsluitend afhankelijk zijn van diffusie via de capillaire knoppen van de aangrenzende wervellichaam. De aanwezigheid van bot puin en geronnen bloed op de eindplaat oppervlakten kunnen hinderen voedingsstoffen diffusie in het midden van de schijf en compromis levensvatbaarheid van de cellen. Onze groep is een relatief snelle protocol &quot;crack&quot;-out van de IVD van de staart met een laag risico op besmetting. We zijn in staat om de vers gesneden benige eindplaat oppervlakken permeabilize door middel van een chirurgische jet lavage systeem, dat het bloed stolt en snijden vuil verwijdert en zeer efficiënt heropent de voeding diffusie padnaar het centrum van de IVD. De aanwezigheid van de groei platen aan beide zijden van de wervelkolom bot moet worden vermeden en worden verwijderd voordat de cultuur. In deze video, schetsen we de cruciale stappen tijdens de bereiding en demonstreren van de sleutel tot een succesvolle orgelcultuur het handhaven van hoge levensvatbaarheid van de cellen gedurende 14 dagen onder vrije zwelling cultuur. De cultuur tijd zou kunnen worden uitgebreid indien nodig de mechanische omgeving kan worden gehandhaafd met behulp van mechanische belasting bioreactor. De techniek blijkt hier kan worden uitgebreid tot andere diersoorten, zoals varkens, schapen, hazen-caudale en lumbale IVD isolatie.

Dit protocol geeft een oogst techniek voor coccygeale runderen tussenwervelschijven voor orgel cultuur<em&gt; In vitro</em&gt; Orgelcultuur.

Voorbereiding van de Intact Bovine Tail tussenwervelschijven voor orgel Cultuur

De tussenwervelschijf (IVD) is het gewricht van de wervelkolom dat wervel met wervel verbindt. Het dient om de belasting van de wervelkolom over te dragen en ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van intacte tussenwervelschijven uit een runderstaart voor kweek en andere downstream toepassingen; in dit geval om tussenwervelschijven voor te bereiden voor kweek in een bioreactor met behulp van complexe mechanische belasting. Dit wordt bereikt door eerst de kuitstaart te desinfecteren en vervolgens de spieren te verwijderen om een duidelijk zicht op de bot- en schijfstructuren te verkrijgen. Vervolgens wordt een enkele tussenwervelschijf uitgesneden met een op maat gemaakt snijinstrument, waarbij aan beide zijden twee tot drie millimeter van de gedeeltelijke wervel wordt vastgehouden.De derde stap is het reinigen van de benige oppervlakken van de tussenwervelschijf met het jet-lavagesysteem, om de diffusie van kleine opgeloste stoffen zoals glucose naar het centrum van de tussenwervelschijf te waarborgen. De laatste stap is om de tussenwervelschijf in een stabilisatiebuffer te plaatsen of in steriel gaas te wikkelen om deze vochtig te houden voor verdere toepassingen. Uiteindelijk wordt het succes van de procedure geëvalueerd met een live/dead-kleuring om de aanwezigheid van levende cellen te controleren 14 of 21 dagen na de start van de kweek van de tussenwervelschijf.Het volgende protocol laat zien hoe omkeerbare discussegmenten kunnen worden geconserveerd voor organkweek, wat kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de mechanobiologie en weefseltechnologie. Er is een goede reden waarom de discus van de rundertenstaart een soort modelsysteem is geworden in de weefseltechnologie. Ten eerste is de celdichtheid zeer vergelijkbaar en zeer laag, net als in een menselijke nucleus pulposus.Ten tweede is er in de celpopulatie een afwezigheid van chordale cellen, wat sterk overeenkomt met de menselijke situatie. Ten derde zijn ook de afmeting en de biochemische samenstelling zeer vergelijkbaar met de menselijke situatie. In het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het lastig is om de beenderige eindplaat van het wervelbeen te onderscheiden, waardoor het moeilijk zal zijn om de aanwezigheid van de kraakbeenergroeischijf te bevestigen.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we zochten naar een snelle en steriele techniek om de omkeerbare schijf met eindplaat te isoleren voor individuele kweek. Een visuele demonstratie van deze methoden is essentieel omdat het moeilijk is om de snijplaats te lokaliseren, aangezien deze zich slechts een millimeter van de botplaat bevindt. Verkrijg eerst een volledige rundertail van een lokaal slachthuis.Idealiter mag de staart niet meer dan vier uur postmortem zijn en moet deze worden verkregen nadat de huid is verwijderd. Aangezien de aanwezigheid van huid de kans op contaminatie vergroot, moet worden gegarandeerd dat alle instrumenten die tijdens het dissectieproces worden gebruikt steriel zijn. Creëer daarnaast een steriele werkplek door een geautoclaveerde snijplank op het werkoppervlak te plaatsen.Maak vervolgens, terwijl u in een steriele laminaire flowkast werkt, een stuk steriel gaas vochtig met een 0,9% steriele natriumchlorideoplossing die 55 millimolair natriumcitraat bevat. Plaats een stukje gedrenkt gaas in elke put van een six-well plaat. Vul daarna een schoon bekken met een 1:100 Betadine-oplossing verdund met kraanwater en dompel de staart gedurende vijf minuten in de oplossing.Verwijder na het weken de staart. Droog deze kort af met steriel gaas en plaats de staart op het steriele werkstation. Gebruik eerst een scalpel nummer 20 of nummer 22 om het spierweefsel rondom de staart te verwijderen. Gebruik vervolgens een guillotine om ongewenste delen van de staart weg te knippen, meestal aan de proximale en distale uiteinden, die relatief grote en zeer kleine tussenwervelschijven bevatten.Gebruik vervolgens een scalpel nummer 10 om de spieren en pezen rondom de tussenwervelschijven weg te snijden. Let erop dat de buitenste annulus van de schijven indien nodig niet wordt doorgesneden. Markeer ter oriëntatie de anteriorzijde van de tussenwervelschijf met een chirurgische huidstift.Beweeg vervolgens voorzichtig de staart om de tussenwervelschijf en het verbindingspunt met de wervel te lokaliseren. Gebruik de botte zijde van een scalpellamel om de grens tussen de tussenwervelschijf en het bot af te tekenen. Bepaal daarna de splitsingsplaats, die één tot twee millimeter vanaf de tussenwervelschijf in de richting van de wervel moet liggen.Plaats de op maat gemaakte industriële meshouder op de splitsingsplaats. Dit diagram laat de splitsingsplaats duidelijk zien. Splits de tussenwervelschijf en de wervels door bovenop de op maat gemaakte industriële meshouder te hameren. Verplaats vervolgens de meshouder naar de andere zijde van de verbinding tussen de tussenwervelschijf en de wervels en hamer door deze zijde van de verbinding tussen de tussenwervelschijf en de wervels om de tussenwervelschijf los te maken.Isoleer vervolgens snel de tussenwervelschijf met steriel gaas dat bevochtigd is met 0,9% natriumchloride bevattend 55 millimolair natriumcitraat. Herhaal dit proces om het gewenste aantal tussenwervelschijven te verkrijgen. Gewoonlijk kunnen er ongeveer zes schijven met een diameter van 10 tot 20 millimeter uit één staart worden verkregen.Zodra alle omkeerbare schijven zijn geoogst, wordt het jet-lavagesysteem aangesloten op een zak van drie liter met steriele lactated Ringer-oplossing, steriele PBS of 0,9% steriele zoutoplossing. Houd vervolgens een omkeerbare schijf vast met een pincet en spoel beide zijden van het eindplato-oppervlak gedurende 30 seconden per zijde met de jet-lavage, terwijl de jet-lavage in een hoek van 30 tot 60 graden ten opzichte van het eindplato-oppervlak wordt gehouden; deze afbeelding toont het reinigende effect van de jet-lavage. De bovenste rij schijven toont de omkeerbare schijven vóór de reiniging, terwijl de onderste rij dezelfde schijven na de reiniging toont.Zodra de eerste tussenwervelschijf is gewassen, wikkel deze in vochtig gaas terwijl de overige tussenwervelschijven worden gewassen. Na het wassen zijn de tussenwervelschijven gereed voor organkweek. Daarnaast kan, terwijl er in een laminaire flowkast wordt gewerkt, een diffusie-experiment worden uitgevoerd om het succes van de preparatie van de tussenwervelschijven te bepalen.Bereid per tussenwervelschijf 40 milliliters steriel DMEM-kweekmedium voor dat 5% foetaal kalfserum bevat. Overbreng het medium naar een bekerglas en dompel vervolgens één tussenwervelschijf onder in het medium. Plaats het bekerglas op een schudplatform in een weefselkweekincubator die is ingesteld op 37 °C en 5% koolstofdioxide.De tussenwervelschijven kunnen op deze manier gedurende ongeveer 14 dagen worden gekweekt. Het gebruik van deze op maat gemaakte monsterkamers handhaaft een passende mechanische belasting, wat een verlengde kweekduur mogelijk maakt. Bereid eerst, zoals eerder beschreven, 40 milliliters steriel DMEM-kweekmedium met 5% foetaal kalfserum per schijf.Plaats vervolgens de omkeerbare schijf in een van de op maat gemaakte kweekkamers en voeg 40 milliliters van het vers bereide medium toe. Sluit de kamer onder de laminaire flowkast. Plaats de op maat gemaakte monsterkamer in een weefselkweekincubator.Voeg gewicht toe aan de kamer op basis van het oppervlak van de schijven. Bereid eerst 100 milliliter van een 1% oplossing van een fluorescente kleurstof, zoals proso red in PBS, per tussenwervelschijf voor. Dompel de schijf vervolgens onder in de oplossing en incubeer deze gedurende de nacht onder dezelfde condities.Voor de vrij-zwellende kweek na de incubatie: vries de discus snel in met vloeibare stikstof en dompel deze vervolgens onder in aceton bij -80 °C. Daarna wordt de tussenwervelschijf langzaam teruggebracht naar kamertemperatuur door incubaties van 24 uur in aceton bij -20 °C, 4 °C en tot slot in aceton bij kamertemperatuur. Nadat de discus is teruggebracht naar kamertemperatuur, wordt deze gedurende één tot twee weken volledig ingebed in polymethylmethacrylaat volgens standaardprocedures.Zodra het schijfje volledig is ingebed, wordt het verwerkt door middel van snijden met een scherp mes en polijsten met een slijper. Na verwerking kan de diffusie van pro cy red door het hele schijfje worden geëvalueerd via microscopie. Deze afbeeldingen tonen de resultaten van een vrij zwelling-diffusie-experiment.Paneel C toont het röntgenoverzicht van een omkeerbare schijf met de twee benige eindplaten die met onze methode zijn voorbereid. Aan de bovenzijde is de groeischijf niet verwijderd en afgebeeld onder fluorescentiemicroscopie. Het is te zien dat de diffusie van de rood fluorescerende kleurstof wordt geblokkeerd door de aanwezigheid van de groeischijf, aangeduid met gp, die zodoende fungeert als een barrière voor het kleuren van de diepere lagen van de kraakbeenhoudende eindplaat en de omkeerbare schijf.De groeischijf bevindt zich tussen de primaire en secundaire ossificatiecentra, aangeduid met co. Als de groeischijf succesvol is verwijderd, kan de rode fluorescente kleurstof ongehinderd diffunderen naar de nucleus pulposus, aangeduid met np. Deze afbeeldingen tonen het reinigende effect van de jet lavage-behandeling.De sagittale doorsneden hebben een dikte van ongeveer 100 micron en de benige eindplaten zijn ongeveer 1,5 millimeter dik. Hier heeft de tussenwervelschijf een jet lavage-behandeling ondergaan en de diffusie van de kleurstof is zichtbaar door de gehele eindplaat. Echter diffundeert de kleurstof niet goed aan de controlezijde, waar geen jet lavage-behandeling is uitgevoerd.Hier zien we live/dead confocale microscopiebeelden van segmenten van bovine omkeerbare schijven, geprepareerd met deze jet-lavagemethode en gehouden onder vrije zwellingcondities; de kernpoolprocessen zijn gelabeld als np, de binnenste annulus fibrosus als IA en de buitenste annulus fibrosus als oa. De groene regio's zijn levende cellen gekleurd met calciumacetylmethylester, en de rode gebieden zijn de kernen van dode cellen gekleurd met ethidiumhomodimeer-1. Beelden uit dezelfde regio's tonen aan dat een hoog aantal levensvatbare cellen, aangegeven door groene fluorescentie, behouden blijft na 14 dagen onder vrije zwellingcondities.Deze grafiek toont de celviabiliteit van de nucleus pulposus- en annulus fibrosus-regio's van de tussenwervelschijven over de kweekperiode van 21 dagen; de resultaten zijn weergegeven als het gemiddelde plus of min de standaardfout van het gemiddelde voor zes monsters. Zoals getoond werden statistische verschillen tussen groepen getest met behulp van non-parametrische Wilcoxon signed-rank sum tests.Er werden significante verschillen gevonden tussen dag 21 en alle andere tijdstippen in de nucleus pulposus, terwijl er in de annulus fibrosus significante verschillen werden gevonden tussen dag zeven en dag nul. Na deze procedure kan deze kweekconditie worden aangepast om additionele vragen te beantwoorden, zoals de invloed van mechanische belasting, nutritionele factoren of groeifactoren op de progressie van deze degeneratie of regeneratie. Ons protocol versnelt de oogsttechniek waarmee interpreteerbare schijfsegmenten kunnen worden verkregen voor tissue engineering-benaderingen om fysiologie of mechanobiologie te meten. Bij traditionele methoden wordt een histologische bandsaag of een draaitechniek gebruikt, die ongeveer twee uur langer duurt dan ons protocol.

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor...

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

This video demonstrates the establishment of primary human placental villous and decidual organ cultures in ex vivo conditions. These models are well-suited for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface.

Establishing Villous and Decidual Organ Cultures as Ex Vivo Models of Human Maternal-Fetal Interface

This video demonstrates a method to establish an infection model in placental tissues to study infection propagation. An ex vivo placental organ culture is infected with Listeria monocytogenes, a facultative intracellular parasite. The bacteria invade extravillous trophoblasts (EVTs) to enter the placental tissue and then propagate to other cells via cell-to-cell spread.

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture

This video demonstrates a technique for culturing bovine intervertebral discs in bioreactors to develop a three-dimensional organ culture model. Specific nutrient-deprived media and degenerative pressure conditions are applied to the discs, mimicking the pro-inflammatory and degenerative microenvironment observed during early-stage intervertebral disc disease. The disc heights are measured post-treatment to analyze the effects of nutrient deprivation and degenerative loading.

Generating a Pro-Inflammatory Organ Culture Model to Simulate an Early Intervertebral Disc Disease

This video demonstrates the development of a pro-inflammatory and degenerative organ culture model for early-stage intervertebral disc (IVD) disease using TNF-α. It outlines the procedure for injecting TNF-α into the intervertebral disc and explains the mechanisms through which TNF-α induces inflammation and degradation of the IVD.

Generating an Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease

Hele orgelcultuur van de tussenwervelschijf (IVD) behoudt het natieve extracellulaire matrix, celfenotypen en cellulaire-matrix interacties. Hier beschrijven we een IVD cultuur systeem met behulp van de muis lumbale en caudale IVD's in hun functionele spinale-eenheden en een aantal applicaties door middel van dit systeem.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Dit protocol presenteert een nieuw experimenteel model van pro-inflammatoire, degeneratieve runderorgaancultuur om vroege tussenwervelschijfdegeneratie te simuleren.

Een pro-inflammatoire, degeneratieve orgaancultuurmodel om intervertebrale discusziekte in een vroeg stadium te simuleren.

We presenteren een methode om ruimtelijke chondrocytenorganisatie in de anulus fibrosus van de tussenwervelschijf te onderzoeken met behulp van een optische sectioningmethode.

Optische sectie en visualisatie van de tussenwervelschijf van embryonale ontwikkeling tot degeneratie

Deze studie presenteert een nieuwe chirurgische techniek voor het implanteren van een biomimetische kunstmatige tussenwervelschijf (BioAID). De methode zorgt voor een nauwkeurige plaatsing en stabiliteit, met als doel de functie van de cervicale wervelkolom te herstellen met behulp van een geitenmodel. Deze techniek is veelbelovend voor klinische toepassing bij zowel menselijke als hondenpatiënten die lijden aan myelopathie van de cervicale wervelkolom.

Chirurgische techniek voor de implantatie van een biomimetische kunstmatige tussenwervelschijf in een diermodel van een geit

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

Leer hoe u intacte tussenwervelschijven uit runderstaarten prepareert voor orgaan-cultuur. Deze methode omvat desinfectie, spierverwijdering, snijden met een aangepast gereedschap en reiniging met een jet-lavage-systeem.

Voorbereiding van de Intact Bovine Tail tussenwervelschijven voor orgel Cultuur

Meer video's verkennen