Visualisatie van vasculaire Ca ^{2 +} Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS

Het algemene doel van deze procedure is om vasculair calciumsignalering te visualiseren die wordt geactiveerd door pericrine afgeleide reactieve zuurstofsoorten of r os. Dit wordt bereikt door eerst R os te visualiseren met behulp van oxidatiegevoelige kleurstoffen in actieve macrofagen. ROS kan ook worden gevisualiseerd in endotheelcellen met behulp van op plasmida gebaseerde fluorescente sensoren.

Ga vervolgens door naar het gelijktijdig visualiseren van celtrackerrood gelabelde geactiveerde macrofagen en flu of vier gelabelde endotheelcellen in een co-cultuurmodel. Meet ten slotte de calciumsignalering in endotheelcellen die wordt geactiveerd door macrofaag-afgeleide R os. Door gebruik te maken van een confocale beeldvormingssysteem.

Deze resultaten kunnen R os-niveaus onafhankelijk aantonen, evenals gelijktijdig de intracellulaire calciummobilisatie beoordelen die wordt geactiveerd door Peregrine-afgeleide ROS. Deze methode maakt gelijktijdige beoordeling mogelijk van twee verschillende signaalmoleculen die intiem een vasculair signaal en een pathofysiologisch setting stimuleren. Twee postdocs in mijn laboratorium, Karthik en Raj, zullen de procedure demonstreren op ruwe en calciummetingen en macrofaag-endotheelcelinteracties.

Kweek muizen monocytenafgeleide macrofagen op glazen bodem 35 millimeter schotels. Daarna daag de cellen uit met toll-like receptor agonisten en incubeer voor zes uur bij 37 graden Celsius. Voor visualisatie van de cytosolische.

ROS voeg oxidatiegevoelige kleurstof toe en incubeer de cellen gedurende 20 minuten. Beeld nu de cellen af op een temperatuurgestuurde trap van een confocale beeldvormingssysteem. Als alternatief, om mitochondriale ROS in TLR-geactiveerde cellen te visualiseren, voeg de mitochondriale superoxide indicator toe en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Voor een negatieve controle, behandel de cellen met PBS of DMSO voor een positieve controle. Behandel de cellen met twee millimolar antimycine. Ga vervolgens door naar het visualiseren van alle cellen op de temperatuurgestuurde trap van een confocale beeldvormingssysteem.

Gebruik image J-software om alle beeldgegevens te analyseren. De fluorescente sensor hyper detecteert hyperspecifiek submicromolaire concentraties van peroxide en op basis van zoogdierexpressie kan vectorontwerp worden gericht op cytoplasma of mitochondria. Gebruik elektroporatie om stabiele lijnen van muispulmonaire microvasculaire endotheelcellen te creëren met ongepaste hyperexpressieplasmide.

Om koloniegroei te faciliteren, plateer cellen op lage dichtheid in complete TMEM en incubeer gedurende 48 uur, vervang het medium met compleet kweekmedium aangevuld met een selectieantibioticum. Selecteer klonen voor de hoogste percentage hyperpositieve cellen en versterk de cultuur om stabiele hyperpositieve lijnen in individuele experimenten te creëren. Zaai cellen op 0,2% gelatine gecoate dekglasjes en kweek overnacht tot 80%confluëntie.

Activeer nu de cellen met TLR-liganden en incubeer gedurende zes uur bij 37 graden Celsius. Voor de detectie van cytoplasmatisch ROS, monteer de dekglasjes van cellen op een adelo-celkamer. Voeg een milliliter voorverwarmde tanks toe, balanceer zout oplossing en plaats de kamer op een temperatuurgestuurde trap van het confocale beeldvormingssysteem.

Neem fluorescentie veranderingen in cellen op voor de detectie van mitochondriale.ROS. Neem een positieve controle van twee micromolar antimycine A op. Bereid vervolgens de dekglasjes van behandelde cellen voor op confocale microscopie. Voer beeldanalyse uit met behulp van image J-software.

Begin met endotheelcellen die zijn gekweekt tot 80%confluëntie op gelatine gecoate glazen dekglasjes voor de visualisatie en meting van intracellulaire calciumveranderingen. Incubeer cellen in de fluorescente kleurstof flu oh 4:00 AM bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om kleurstofverlies te minimaliseren, spoel cellen met experimentele beeldvormingsoplossing die suen pyro zone bevat. Monteer nu dekglasjes op een adelo-celkamer bij 800 microliters van voorverwarmde experimentele beeldvormingsoplossing en plaats de cellen op een temperatuurgestuurde trap van het confocale beeldvormingssysteem in een aparte buis.

Gebruik 500 nanogram per milliliter van celtrackerrood C-M-T-P-X gedurende 15 minuten om de macrofaagpopulatie onder onderzoek te labelen, spoel cellen en resuspendeer pellets in 200 microliters van experimentele beeldvormingsoplossing. Voeg nu de gelabelde macrofagen toe aan de met flu oh 4:00 AM geladen. Endotheelcellen in de confocale kamersamenstelling. Neem de groene en rode fluorescentie om de drie seconden gedurende 10 minuten op.

In dit experiment werden J 7 74 0.1-cellen uitgedaagd met TLR twee, drie en vier liganden gedurende zes uur. Representatieve confocale beelden tonen een verhoogde cytosolische R os zoals gemeten door DCF. Interessant is dat mitoses sokken rode fluorescentie een vergelijkbare toename in mitochondriale ROS aangeeft.

Deze fluorescentie veranderingen zijn kwantitatief. Dus moeten resultaten worden genormaliseerd en uitgedrukt als relatieve voudwisseling per behandeling, het antimycine a-signaal valideert een positieve controle voor mitochondriale ROS productie. Deze figuur toont beelden van endotheel, cytosolische en mitochondriale peroxideniveaus in stabiel expressie hyper cyto of hyper D mito.

MP ECS gestimuleerd met TLR-agonisten. Kwantificering van gemiddelde fluorescentie verandering toont een toename van hyper cyto en hyper D mito fluorescentie na zes uur stimulatie in een co-cultuur systeem. Om Peregrine ROS-signalering te beoordelen, werden vers geïsoleerde mirin-macrofagen van zowel wild-type als GP 91 Fox null muizen geactiveerd door één microgram per milliliter van LPS gedurende zes uur.

Macrofagen werden rood gelabeld met C-M-T-P-X en toegevoegd aan groen flu vier.Loaded. MPM ecs. Interessant is dat LPS-geactiveerde macrofagen geïsoleerd uit wild-type muizen grote en snelle calciummobilisatie in MPM ECS veroorzaakten in vergelijking met macrofagen van GP 91 Fox null muizen.

Terwijl LI deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat langdurige download of laserblootstelling leidt tot auto-oxidatie van DCF. Het is cruciaal om fotobleking van hyper cyto en hyper D mitral te vermijden. Eenmaal beheerst, kan meting van RA in macrofagen en in endotheelcellen worden gedaan in zeven uur als het op de juiste manier wordt uitgevoerd.