Name: Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer hoe je fluorescentiecorrelatiespectroscopie gebruikt om lipid raft-partitionering van fluorescente eiwitten in levende cellen te kwantificeren. Deze methode meet diffusietijden om membraandynamica te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van Agence Nationale de la Recherche (Choad). We zijn ook dankbaar voor de Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) voor hun financiële steun.

1. Kalibratie van de FCS Setup <ol><li> Start de confocale microscoop, lasers, computers, incubator voor temperatuur-en CO 2-controle. </li><li> Zorg ervoor dat de SPAD (Single Photon Avalanche Diode) is ingeschakeld en de fluorescentie filter in de SPAD is zeer geschikt voor uw monster. Controleer of de SPAD wordt gesynchroniseerd in de tijd. Let op alleen begin je FCS-software zodra je SPAD instellingen zijn klaar voor overname. </li><li> Bereid een verse oplossing van cholera toxine Alexa488 verdund in PBS met een concentratie van 1 ug / ml (17,5 nM) bereikt. </li><li> Optimaliseren confocale beelden van de oplossing volgens interne detectie van de microscoop. </li><li> Schakel over naar de scanmodus te wijzen en een punt in de oplossing monster te kiezen. Zorg ervoor dat de duur van de laser verlichting is lang genoeg om je FCS overnames uit te voeren (&gt; 5 minuten). </li><li> Schakel externe detectie door de SPAD en de FCS software. Bewaak uw fluorescentie-signaal en zorg ervoor dat het goed suibonden met de SPAD (genoeg signaal, maar geen verzadiging, 10 000 tot 50 000 counts / s is prima). Indien nodig, te wijzigen z-positie, winst en / of laservermogen om de juiste fluorescentie-signaal te bereiken. </li><li> Verwerven van 10 sets van 30 seconden metingen. Acquisitie tijd moet worden geoptimaliseerd voor uw monster (compromis tussen de beste bemonstering en fotobleken problemen). </li><li> Analyseer uw gegevens (zie stap 4) om ervoor te zorgen dat u een auto-correlatie curve die overeenkomt met een tl-soorten verspreiden in oplossing (vergelijking in Fig. 2) en dat de verspreiding tijd verkregen na montage de juiste is (ongeveer 0,2 ms) (Fig 3.). </li></ol> 2. Kleuring van levende cellen met lipid rafts Marker <ol><li> Plaat HEK293 cellen op 8-goed Labteks bekleed met poly-L-lysine (1mg/ml) de dag voor beeldvorming om ervoor te zorgen dat hun hechting correct is. Gebruik medium zonder fenol rood om ervoor te zorgen is er geen verstoring van de fluorescentie-signaal. </li><li>Twee keer wassen cellen met HBSS (gebufferde Salt Hank's oplossing). </li><li> Voeg choleratoxine-Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) in 500 ul HBSS de cellen 30 minuten bij 37 ° C. Cholera toxine zal binden aan ganglioside GM1, bekend bij voorkeur worden gepartitioneerd in lipid rafts. </li><li> Twee keer wassen cellen met HBSS (gebufferde Salt Hank's oplossing). </li></ol> 3. FCS Data Acquisition op levende cellen <ol><li> Plaats de gekleurde cellen op de microscoop podium. Zorg ervoor dat de temperatuur en CO 2-omstandigheden optimaal zijn anders kan dit leiden tot artefacten in diffusie tijden. </li><li> Optimaliseer confocale beelden van een cel van belang met behulp van interne detectie van de microscoop (afb. 4). </li><li> Schakel over naar de scanmodus te wijzen en een punt in de plasmamembraan van de cel van belang te kiezen. Voer 1-2 live-beelden van de cel te zorgen dat de cel niet beweegt tijdens de overname. </li><li> Schakel over naar de externe detectie door de SPAD en aan de FCS software. Bewaak uw fluorescentie-signaal en zorg ervoor dat het zeer geschikt voor de SPAD (genoeg signaal, maar geen verzadiging, 10 000 tot 50 000 counts / s is prima). Indien nodig, te wijzigen z-positie, winst en / of laservermogen om de juiste fluorescentie-signaal te bereiken. Als dit niet genoeg is, kunt u overwegen te veranderen vlekken omstandigheden. </li><li> Verwerven 10 monsters van 30 seconden gemeten. Aangezien de meeste cellen zijn auto-tl, kunt u een afname van de fluorescentie te zien tijdens de eerste aankopen, als gevolg van auto-fluorescentie vervagen. </li></ol> 4. FCS Data Analyse <ol><li> Stel de correlatie interval genereren autocorrelatie krommen met FCS software. De correlatie interval zal doorgaans variëren van de kortste oplosbare vertraging tot aan de langste tijd mogelijk zijn (zoals de statistieken van de meting wordt meer en meer onvoldoende wanneer de maximale correlatietijd totale overnameprijs tijd nadert, is de maximale vertraging is beperkt tot 80% van de acquisitietijd de Picoquant software). </li><li> Voor elk monster uitvoeren bestanden die van fluorescentie fluctuaties en autocorrelatiefunktie als functie van de tijd. </li><li> Gebruik een data-analyse en passende software zoals Origin Pro om de bestanden te importeren. </li><li> Voor elk monster, zorg ervoor dat er geen fotobleken tijdens overname wil zeggen de fluorescentie blijft stabiel tijdens de 30 seconden. Gooi alle maatregelen die het weergeven van fotobleken, omdat dit kan leiden tot kunstmatige meer diffusie tijden. </li><li> Controleer de vorm van de resterende FCS krommen juist is (zie figuur 5). Bepaal de gemiddelde FCS curve. </li><li> Breng de curve met de juiste wiskundig model (Fig. 2). Deze fit geeft je de diffusie tijd (s) en het aandeel van moleculen verspreiden met deze (ESE) diffusie tijd (s). </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een FCS ijking met een cholera toxine Alexa488 oplossing is getoond in figuur 3 (figuur 3A), individuele vertonen en gemiddelde FCS curven werden berekend. Gemiddelde FCS curven voorzien vergelijkingen overeenkomstige verschillende diffusiemodellen (voorbeelden in figuur 2). De parameter klassiek als de kwaliteit van een geschikt vast is determinatiecoëfficiënt R2. Hoe dichter R2 1, hoe beter de past. In dit geval is de meest nauwkeurige model de gemiddelde FCS curve past is een beschrijving van een populatie van fluorescerende moleculen diffusie vrij in drie dimensies (vergelijking 1 in figuur 2 en figuur 3B). De diffusietijd uit de passing 0,32 ms. Residuen van curve-fitting (Figuur 3C) en R2 factor (0,99906) geven een schatting van de kwaliteit van de pasvorm. Een voorbeeld van FCS-analyse voor cholera toxine-Alexa488 lood HEK293 cellen in figuur 5. De multifasische gemiddelde FCS curve vorm onthult het bestaan ​​van populaties van fluorescerende moleculen met verschillende diffusie tijden. De beste past bij de kromming overeenkomt met een model met drie populaties van fluorescerende probes: twee met een gehinderde diffusie (diffusie in twee dimensies in het membraan vlak) en een vrij diffusievast maakt in drie dimensies (vergelijking 2 in figuur 2 en figuur 5) . Dit laatste populatie overeen met fluorescerende moleculen zich buiten het membraan vlak, namelijk bindend of ontbinding hun membraan doelstellingen bereikt het membraan door afscheiding of recycling traject, of uit het membraan door endocytose. De twee diffusie tijden het membraan, overeenkomend met choleratoxine gebonden GM1, werden 2 ms (25% moleculen), overeenkomend met diffusie buiten rafts en 75 ms (50% moleculen), overeenkomend met diffusie in rafts . Houd er rekening mee dat elke photobleachING tijdens de overname zal leiden tot een kunstmatige meer diffusie keer wellicht dus ook het creëren van een voorkeur voor lokalisatie van GM1 in lipid raft domeinen. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van de FCS opstelling (figuur gemodificeerd uit Marquer et al. 12). <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbeeld van een diffusie-modellen en de bijbehorende vergelijkingen gebruikt om autocorrelatie bochten te passen. De structuur parameter S kan worden geschreven als S = z 0 / w 0 met z 0 effectieve centrale straal langs de optische as 1 / e 2 intensiteit w0 effectieve laTeral focale straal van 1 / e 2 intensiteit. Deze waarden kunnen worden geëxtraheerd uit een klassiek punt spreiding functie (PSV) meting. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Beoordeling van diffusie tijd van cholera toxine-Alexa488 in oplossing voor FCS kalibratie. A) Fluorescentie fluctuatie als functie van de tijd voor een representatief voorbeeld van 30 seconden acquisitie. B) Gemiddelde autocorrelatie verkregen kromme 10 monsters van 30 seconden verkrijging voorzien formule 1 (zie figuur 2). C) residuen van curve fitting. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. HEK-293 cellen gekleurd met cholera toxine-Alexa488. De cellen werden afgebeeld op een SP5 confocale microscoop (Leica Microsystems, Wetzlar, Duitsland) met de interne 488nm laser lijn. Fluorescentie werd verzameld met een x60 plannen apochromat olie-immersie objectief tussen de 500en 650 nm. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Beoordeling van diffusie tijd van cholera toxine-Alexa488 op de plasmamembraan van HEK293 cellen. A) Gemiddelde autocorrelatie curve voorzien vergelijking 2 (zie figuur 2). B) residuen van curve fitting. (Gemodificeerd uit Marquer et al. 12).

<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalizing+membrane+rafts%3A+new+tools+and+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li>
<li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol%2C+lipid+rafts%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li>
<li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+elusive+or+illusive%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li>
<li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+now+you+see+them%2C+now+you+don%27t%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li>
<li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li>
<li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+lipid+rafts%3A+an+identity+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li>
<li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li>
<li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li>
<li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li>
<li>Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+review+of+biochemical+and+microfluidic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications.</a> Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Ilien, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pirenzepine+promotes+the+dimerization+of+muscarinic+M1+receptors+through+a+three-step+binding+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process.</a> J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).</li>
<li>Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-receptor+kinetics+measured+by+total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).</li>
<li>Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li>
<li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li>
<li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li>
<li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+image+correlation+spectroscopy%3A+measuring+number+densities%2C+aggregation+states%2C+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li>
<li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li>
<li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holin+triggering+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope%3A+exploiting+the+hidden+time+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De FCS hier gepresenteerde methode zorgt voor een gevoelige en snelle analyse van de lipid raft verdeling van fluorescerende probes van belang in levende cellen. FCS combineert de nauwkeurigheid van de lokalisatie van confocale microscopie met de gevoeligheid van single photon tellen. Het belangrijkste verschil tussen FCS en standaard technieken is dat biochemische FCS de absolute bepaling van de rafts verdeling van het doel en niet de relatieve verdeling kan zoals het geval is DRM isolatie of co-patching. <p class=...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Cholera toxine subunit B-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentameer) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Incubator voor temperatuur-en CO 2-controle </td><td> Life imaging-diensten </td><td> De Cube en de Box </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Avalanche Diode) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM serie (100 micrometer gevoelig gebied) </td><td></td></tr><tr><td> High-pass filter 488 nm </td><td> Semrock </td><td> 488 nm blokkeren rand BrightLine lange-pass-filter Part #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS-eenheid </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 module </td><td></td></tr><tr><td> Aan-en auto-correlatie-software </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Aanpassoftware </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie correlatie spectroscopie (fcs)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In de afgelopen vijftien jaar het idee dat de celmembranen niet homogeen zijn en vertrouwen op microdomeinen om hun taken uit te oefenen is op grote schaal geaccepteerd. Lipid rafts zijn membraan microdomeinen verrijkt in cholesterol en sfingolipiden. Ze spelen een rol in de cellulaire fysiologische processen, zoals het signaleren, en de handel 1,2, maar wordt ook gedacht dat de belangrijkste spelers in een aantal ziekten, waaronder virale of bacteriële infecties en neurodegeneratieve ziekten 3. Maar hun bestaan ​​is nog steeds onderwerp van controverse 4,5. Inderdaad, lipid raft grootte van naar schatting rond de 20 nm 6 te zijn, ver onder de resolutie limiet van conventionele microscopie (ongeveer 200 nm), waardoor zich verzet tegen hun directe beeldvorming. Tot nu toe de belangrijkste technieken gebruikt om de verdeling van eiwitten van belang in lipid rafts te beoordelen waren reinigingsmiddelenbestendige Membranen (DRM&#39;s) isolatie en co-patching met antilichamen. Hoewel gebruikte becahet gebruik van hun vrij makkelijk de uitvoering, deze technieken waren gevoelig voor artefacten en dus kritiek op 7,8. Technische verbeteringen waren daarom noodzakelijk om deze artefacten te overwinnen en om te kunnen lipid rafts partitie sonde in levende cellen. Hier presenteren we een methode voor de gevoelige analyse van lipide rafts verdeling van fluorescent-gemerkte eiwitten of lipiden in het plasmamembraan van levende cellen. Deze methode genoemd Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS), gebaseerd op het verschil in diffusie tijden fluorescerende probes binnen of buiten rafts. In feite, zoals blijkt uit zowel kunstmatige membranen en celculturen, zou probes verspreiden veel sneller buiten dan binnen dichte lipid rafts 9,10. Diffusie tijd te bepalen, worden minuten fluorescentie schommelingen gemeten als functie van de tijd in een knooppunt (ongeveer 1 femtoliter), gelegen aan de plasmamembraan van cellen met een confocale microscoop (Fig.1). De auto-correlatie curves kan vervolgens worden getrokken uit deze schommelingen en met de juiste wiskundige diffusiemodellen 11. FCS kan worden aan de lipide vlot verdeling van verschillende probes, zolang zij fluorescent gelabeld bepalen. Fluorescerende labels kan worden bereikt door de expressie van fluorescerende fusie-eiwitten of door binding van fluorescerende liganden. Bovendien kan FCS niet alleen worden gebruikt in kunstmatige membranen en cellijnen, maar ook in primaire kweken zoals beschreven onlangs 12. Het kan ook worden gebruikt om de dynamiek van lipide vlot afscherming volgen verslavingen membraan lipiden verandering 12.

Een techniek om de lipid raft verdeling van fluorescerende eiwitten in de plasmamembraan van levende cellen sonde wordt beschreven. Het maakt gebruik van de verschillen in verspreiding tijden van eiwitten die gelegen zijn binnen of buiten van lipide rafts. Overname kan dynamisch worden uitgevoerd in controle omstandigheden of na drugsverslaving.

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

In de afgelopen vijftien jaar is het idee dat celmembranen niet homogeen zijn en afhankelijk zijn van microdomeinen om hun functies uit te oefenen, algemeen aanvaard geraakt.

Lipid rafts zijn microdomeinen binnen het plasmamembraan die fungeren als organiserende centra voor cellulaire processen zoals signalering en transport. Hier wordt de partitie van lipid rafts in het plasmamembraan van levende cellen gekwantificeerd met fluorescentie-correlatiespectroscopie om de partitie van het ganglioside GM1 in lipid rafts te onderzoeken. Zoogdiercellen worden onderzocht met Alexa 488-gelabelde B-subunits van choleratoxine.De fluorescente eiwitten binden aan ganglioside GM1, dat bij voorkeur in lipid rafts wordt gepositioneerd met behulp van confocale microscopie. Minimale fluorescentieschommelingen bij het plasmamembraan worden gemeten. Autocorrelatiecurves worden gegenereerd en gefit met passende wiskundige diffusiemodellen om de diffusietijden van Fluor te bepalen.Aangezien probes veel sneller diffunderen buiten dan binnenin dichte lipid rafts, geven de verkregen resultaten het niveau van partitionering aan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals de isolatie van detergent-resistente membranen of co-patching met antilichamen, is dat FCS de bepaling van het absolute en niet het relatieve lipid raft-patroon van het doelwit mogelijk maakt. Bovendien kan het worden gebruikt voor zowel lipiden als eiwitten, zolang ze fluorescent gelabeld zijn.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ziekte van Alzheimer, zoals wat de betekenis van lipiden is voor de productie van amyloïde beta? Dit zal leiden tot belangrijke ontdekkingen, zoals nieuwe inhibitoren die specifiek binden aan lipide-graftcomponenten. Begin deze procedure met het kalibreren van het fluorescentie-correlatiespectroscopie- of FCS-systeem.Deze FCS-opstelling bestaat uit een confocale microscoop die is verbonden met een externe detectie-eenheid met een detectiefilter en een avalanche-fotodiode, en een tijdgecorreleerd single-photon-tel-systeem. Start de lasers van de confocale microscoop, de computer voor confocale beeldvorming en de computer voor FCS-acquisitie. Zet vervolgens de incubator aan en stel deze in op 37 °C en 5% koolstofdioxide.Zorg ervoor dat de single photon avalanche diode of spad is ingeschakeld en dat het fluorescentiefilter in de spad goed is afgestemd op het monster. Controleer of de spad tijdsynchronisatie vertoont. Zodra de spad-instellingen gereed zijn voor acquisitie, start u de FCS PICO quant-software.Bereid een verse oplossing van cholera toxine Alexa 4 88 voor, verdund in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 1 µg/mL. Pipetteer de oplossing op een dekglas. Stel vervolgens de Z-instellingen van de microscoop in om het vlak te vinden waarin de fluorescentie het meest intens is.Om over te schakelen naar de puntscanmodus, klikt u op de knop voor het bleekpunt en klikt u vervolgens op het beeldscherm om een puntvormig interessegebied in het vloeistofmonster te kiezen. Stel met de software de belichtingstijd in op meer dan vijf minuten. Dit zorgt ervoor dat de laserbestraling lang genoeg is om de FCS-acquisities uit te voeren.Schakel vervolgens met de FCS-software over naar externe detectie via de spad. Zorg ervoor dat het fluorescentiesignaal in het bereik van 10.000 tot 50.000 counts per seconde ligt. Het doel is om een goed signaal te verkrijgen zonder verzadiging.Verkrijg 10 sets van 32 metingen op hetzelfde veld. De acquisitietijd moet worden geoptimaliseerd voor het monster, zodat een hoogwaardige bemonstering wordt bereikt zonder fotobleken. Zodra de gegevens van het optimalisatiemonster zijn verkregen, worden deze gebruikt om autocorrelatiecurves te genereren waarmee de diffusietijden van fluorescerende soorten zullen worden bepaald. Eerst.Stel met de FCS-software het correlatie-interval in en genereer een autocorrelatiecurve die overeenkomt met de fluorescerende species die in de oplossing diffunderen. Voor elke 32ste meting zal de software elke 32ste sample onafhankelijk analyseren en autocorrelatiecurves genereren op basis van de fluorescentie-intensiteiten, gebruikmakend van een klassieke wiskundige functie die de overeenkomst tussen waarnemingen rapporteert als functie van het tijdsinterval tussen deze waarnemingen. Het correlatie-interval zal doorgaans variëren van de kortste oplosbare LAC-tijd tot de langst mogelijke tijd.Zoals hier te zien is, wordt de meting minder nauwkeurig naarmate de maximale correlatietijd de totale acquisitietijd nadert. Hier is de maximale lag-tijd beperkt tot 80% van de acquisitietijd. Exporteer vervolgens voor elk monster de bestanden die overeenkomen met de fluorescentieschommelingen en de autocorrelatie als functie van de tijd. Importeer deze bestanden daarna in een softwarepakket voor data-analyse en fitting, zoals Origin Pro, om te controleren of er tijdens de acquisitie geen fotobleken is opgetreden.Bestudeer het bestand met de fluorescentieschommelingen. De fluorescentie moet gedurende de 30 seconden stabiel zijn en moet worden weergegeven als een vlakke lijn. Wanneer fluorescentiemetingen fotobleking vertonen.Gebruik de overeenkomstige FCS-curves niet voor verdere analyse, aangezien dit kan leiden tot kunstmatig langere diffusietijden in de resterende FCS-curves. Bepaal de gemiddelde FCS-curve door de autocorrelatiewaarden voor elk tijdstip te middelen. Gebruik ten slotte de fittingmodule van Origin Pro met de juiste vergelijking om de curve te fitten met het passende wiskundige model.Deze fit geeft de diffusietijd van moleculen en de oplossing weer. In dit geval is er slechts één populatie die vrij diffundeert in de diffusie. De verkregen diffusietijd is correct, ongeveer 0,2 milliseconden.De opstelling is goed gekalibreerd en kan worden gebruikt voor verdere experimenten. Nu de kalibratie van de opstelling is gecontroleerd, kan het systeem worden gebruikt om de partitionering van lipid RAF's van een flora te meten. Haal de vier relevante levende cellen, HEC 2 93-cellen, uit de incubator.De cellen moeten de dag ervoor op eight wheel lab Tech-plaatjes zijn gezaaid die zijn gecoat met poly-L-lysine, zodat ze de tijd hebben om te hechten. Er moet medium zonder fenolrood worden gebruikt om verstoring van het fluorescentiesignaal te voorkomen. Gebruik een pipet om voorzichtig het grootste deel van het medium uit de well te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat de cellen niet uitdrogen.Voeg vervolgens voorzichtig HBSS toe aan de well. Herhaal deze wasstap één keer voor elke well. Voeg 500 µL verdunde cholera toxine, Alexa 488 toe aan de cellen voor 30 minuten.Bij 37 °C zal het choleratoxine na de incubatie binden aan ganglioside GM1, waarvan bekend is dat het bij voorkeur in lipide rafts is gepartitioneerd. Was de cellen tweemaal met HBSS zoals voorheen; de cellen zijn nu gereed voor FCS-data-acquisitie. Plaats de gekleurde cellen op de microscooptafel en controleer de temperatuur- en koolstofdioxide-instellingen.Optimaliseer de confocale beeldvorming van een geselecteerde cel met behulp van de interne detectie van de microscoop. Zoek een cel met een goed gekleurd membraan. Schakel zoals eerder beschreven over naar de puntscanmodus en kies een punt in het plasmamembraan van de geselecteerde cel.Maak één tot twee snapshots van de cel om er zeker van te zijn dat de cel niet beweegt tijdens de acquisitie. Schakel, zoals voorheen, over naar externe detectie via de spad en naar de FCS-software om een correct signaal van 10.000 tot 50.000 te garanderen. Pas de Z-positie gain en/of het laservermogen aan.Veramel 10 monsters van de 32ste metingen, aangezien de meeste cellen autofluorescerend zijn. Er kan een afname in fluorescentie optreden tijdens de eerste acquisities door het vervagen van de autofluorescentie. Analyseer de fluorescentieschommelingen zoals voorheen om de gemiddelde FCS-curve te bepalen.Pas vervolgens de multifasische gemiddelde FCS-curve aan met het passende wiskundige model. Gebruik hiervoor de fittingmodule van Origin Pro met de juiste vergelijking. Deze fit levert de diffusietijden en het aandeel moleculen op dat met deze diffusietijden diffundeert.Deze figuur toont een voorbeeld van een FCS-kalibratie met een cholera toxine Alexa 488-oplossing. Nadat was gecontroleerd of de individuele fluorescentiemetingen als functie van de tijd geen fotobleking vertoonden, werden de individuele en gemiddelde FCS-curven berekend. De gemiddelde FCS-curven werden gefit met vergelijkingen die overeenkomen met verschillende diffusiemodellen.De parameter die klassiek wordt beschouwd om de kwaliteit van een fit te bepalen, is de determinatiecoëfficiënt R-kwadraat. Hoe dichter R-kwadraat bij één ligt, hoe beter de fit; in dit geval is dat het meest accurate model voor de fit. De gemiddelde FCS-curve is degene die een populatie van fluorescerende moleculen beschrijft die vrij diffunderen in drie dimensies.De diffusietijd afgeleid uit de fit is 0,32 milliseconden. De residuen van de curvefitting en de R-kwadraatfactor geven hier een schatting van de kwaliteit van de fit. De r-kwadraatwaarde is 0,99906, wat duidt op een goede fit.Hier wordt een voorbeeld getoond van een FCS-analyse voor HC 2 93-cellen die zijn gekleurd met Alexa 4 88-choleratoxine. In dit voorbeeld begint het toxine te worden geendocyteerd, zoals blijkt uit de aanwezigheid van kleine intracellulaire fluorescerende stippen om de diffusie te beoordelen. Tijd van cholera toxine Alexa 4 88 bij het plasmamembraan.De gegevens zijn verzameld en geanalyseerd zoals beschreven in deze video. De vorm van de multifasische gemiddelde FCS-curve onthult het bestaan van populaties fluorescerende moleculen met verschillende diffusietijden. De beste fit voor deze curve komt overeen met een model met drie populaties fluorescerende probes, waarvan twee een belemmerde diffusie vertonen.Diffusie in twee dimensies, zoals in het membraanvlak, en één die vrij diffundeert in drie dimensies. Deze laatste populatie komt overeen met fluorescente moleculen die zich buiten het membraanvlak bewegen. Met andere woorden: de fluorescente moleculen binden aan of ontkoppelen van membraandoelen die het membraan bereiken via het secretie- of recyclingpad, of verlaten het membraan via endocytose.Er werden twee diffusietijden waargenomen bij het membraan. 25% van de moleculen had diffusiesnelheden van twee milliseconden, wat overeenkomt met diffusie buiten de lipide rafts. 50% van de moleculen had diffusietijden van 75 milliseconden, wat overeenkomt met diffusie in lipide rafts.Door deze procedure te volgen en te koppelen aan een alternatieve optische configuratie kan vervolgens detectie van enkelvoudige moleculen onder de diffractielimiet worden uitgevoerd, wat na de ontwikkeling toegang biedt tot een breder bereik aan diffusietijden. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van lipide rafts om ziekte-gerelateerde dynamiek van de partitionering van lipide rafts te bestuderen na medicatietoediening of veranderingen in de lipidecompositie van het membraan in cellijnen en primaire culturen.

determination-lipid-raft-partitioning-fluorescently-tagged-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

Een methode om eiwitdiffusie in membranen van primaire immuuncellen te meten met behulp van fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS) wordt beschreven. In dit artikel wordt het gebruik van antilichamen voor fluorescentielabeling geïllustreerd.

Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Antilichamen die zich aan target receptoren van het celoppervlak binden kunnen verlenen bevleesdheid en clustering wijzigingen. Deze dynamische veranderingen hebben gevolgen voor het karakteriseren van Geneesmiddelenontwikkeling in de doelcellen. Dit protocol maakt gebruik van de confocal microscopie en afbeelding correlatie spectroscopie via ImageJ/FIJI te kwantificeren van de omvang van de receptor clustering op het celoppervlak.

Confocale microscopie onthult cel oppervlakte Receptor aggregatie via afbeelding correlatie spectroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Dit artikel is bedoeld om een protocol te presenteren over het bouwen van een spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten op het plasmamembraan van levende cellen.

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Leer hoe je fluorescentiecorrelatiespectroscopie gebruikt om lipid raft-partitionering van fluorescente eiwitten in levende cellen te kwantificeren. Deze methode meet diffusietijden om membraandynamica te analyseren.

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS) (Video) | JoVE Journal

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

Meer video's verkennen