Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Het algemene doel van het volgende experiment is om de kinetiek van de receptor-ligandinteractie te meten wanneer beide moleculen zijn verankerd op de oppervlakken van de interagerende cellen. Dit wordt bereikt door eerst de rode bloedcellen, die dienen als adhesiesensoren, te functionaliseren met liganden en door receptor-dragende cellen voor te bereiden. Als tweede stap wordt de micropipetkamer geassembleerd en worden adhesietests uitgevoerd om de adhesiegebeurtenissen vast te leggen.

Vervolgens wordt de curve van de adhesiekans tegenover de contacttijd van de cellen uitgezet en gefit met het model. Om de kinetische parameters te schatten, worden resultaten verkregen die de tweedimensionale effectieve bindingsaffiniteit en de off-rate tonen, geschat op basis van de gegevens. Maar waar komt het idee voor deze assay vandaan?

Onderzoekers bestuderen de interactie tussen receptoren en liganden. Meestal worden scheurkrachten gemeten en dat is wat wij ook doen, maar op een dag vroegen we ons af of we simpelweg de binaire uitkomst konden meten — nul voor geen adhesie en één voor adhesie — en vanuit deze nul-één metingen de kinetiek konden afleiden om de micro-pipetfrequentie-assay te demonstreren. Dr. Veronica Zana Zina, een wetenschappelijk onderzoeker in mijn laboratorium, zal het experiment aan u tonen.

Rode bloedcellen die uit volbloed zijn geïsoleerd, worden gebiotineerd voor de adhesiefrequentie-assay. Begin deze procedure door de buis met geïsoleerde rode bloedcellen te centrifugeren, verdeel telkens 10 µL van het pellet van rode bloedcellen over verschillende vials en voeg aan elk vial de overeenkomstige hoeveelheid PBS toe om meerdere biotinylatieconcentraties van rode bloedcellen voor te bereiden. Voeg vervolgens 10 µL 0,1 M BORES-buffer toe aan elk vial.

Voeg vervolgens een berekende hoeveelheid biotinoplossing toe aan elk vial en vortex direct. Plaats elk vial met rode bloedcellen gedurende enkele seconden in een conische buis van 50 milliliter en incubeer 30 minuten op een rotator bij kamertemperatuur; voeg na 30 minuten EAS 45-buffer toe aan elk vial en centrifugeer twee minuten bij 2000 toerental per minuut. Herhaal het wassen met EAS 45-buffer tweemaal, voor een totaal van drie wasbeurten.

Voeg ten slotte 100 µL EAS 45-buffer toe aan elk vial en bewaar deze bij 4 °C om de liganden op het oppervlak van de rode bloedcellen te functionaliseren. Nadat ze in de vorige stap zijn geactiveerd, worden de rode bloedcellen gedurende 30 minuten bij 4 °C geïncubeerd met een verzadigde concentratie strep TTR en drie keer gewassen met EAS 45-buffer gedurende twee minuten bij 2000 rpm. Incubeer daarna de rode bloedcellen direct met het gebiotineerde ligand, of incubeer de rode bloedcellen met het overeenkomstige gebiotineerde capture-antilichaam, gevolgd door incubatie met de liganden. Het protocol in deze video maakt gebruik van het gebiotineerde capture-antilichaam.

Micropipetten worden vervaardigd met behulp van borosilicaatglazen capillaire buizen met een laag smeltpunt. Gebruik eerst een micropipet-trekker om de capillaire buizen uit te trekken. Gebruik vervolgens een micromanipulator met een micro-forge om de tip van de micropipet op de gewenste openinggrootte af te snijden.

De vereiste diameter varieert gewoonlijk van één tot vijf micron, afhankelijk van de grootte van de cellen die in het onderzoek worden gebruikt. Om de celkamer voor te bereiden, gebruikt u twee stukken microscoopdekglaas die op de gewenste maat zijn gesneden, verwijder het stof van de dekglasjes met een spuitbus perslucht, voeg het medium voor de celkamer toe en sluit de kamer aan beide zijden af met minerale olie om verdamping van het medium te voorkomen. Dit zou anders de osmolariteit tijdens het experiment beïnvloeden.

Het micropipetsysteem dat in deze assay wordt gebruikt, bestaat uit drie subsystemen: een imagingsubsysteem voor het observeren, vastleggen en analyseren van de bewegingen van de met de micropipet geaspireerde cel, een micromanipulatiesubsysteem om de selectie van cellen uit de celkamer mogelijk te maken en een druksubsysteem voor het aspireren van de cellen in micropipetten. Het centrale onderdeel van het imagingsubsysteem is een omgekeerde microscoop met een 100-voudige olie-immersieobjectief. De beelden worden gedetecteerd door een CCD-camera (charge-coupled device) en verzonden naar een videorecorder.

Een videotimer is aan het systeem gekoppeld om de tijd bij te houden. Nadat de micropipet is gevuld met gedeïoniseerd water, wordt deze in de houder geplaatst op een mechanische aandrijving die op de microscoop is gemonteerd. De micropipet kan nauwkeurig worden gepositioneerd met een hydraulische micromanipulator met drie assen.

Een van de micropipet houders is gemonteerd op een computergestuurde piëzo-elektrische translator. Hiermee kan de pipet nauwkeurig worden bewogen in een adhesietestcyclus. Het drukregelsysteem wordt gebruikt om de zuigkracht te beheersen.

Tijdens het experiment verbindt een hydraulische lijn de houder van de micropipet met een vloeistofreservoir. Met een fijne mechanische positioneerder kan de hoogte van het reservoir nauwkeurig worden gemanipuleerd. Nadat de kamer is geassembleerd, worden de micropipetten ingesteld, worden de cellen in de kamer geïnjecteerd om de assay te starten, worden de interagerende cellen door de respectieve pipetten geaspireerd en wordt de PSO elektrische translator gebruikt om de rode bloedcel in en uit contact met de neutrofiel te brengen met een gecontroleerd contactoppervlak en een gecontroleerde contacttijd.

Een adhesiegebeurtenis wordt waargenomen wanneer de rode bloedcel verlengt bij celscheiding; een gebeurtenis zonder adhesie komt overeen met geen verlenging van de rode bloedcel. Registreer de waargenomen adhesiegebeurtenissen door een een voor adhesie of een nul voor geen adhesie in te voeren in een kolom van een Excel-spreadsheet.

Registreer de curve van de adhesiefrequentie tegenover de contacttijd met ten minste drie verschillende celparen voor elke contacttijd. Om een gemiddelde en SEM als controle te verkrijgen, dient de curve van aspecifieke binding te worden geregistreerd door gebruik te maken van rode bloedcellen die zijn gecoat met relevante liganden en/of door de liganden of receptoren te blokkeren met hun specifieke functionele blokkade. Met monoklonale antilichamen kan de specifieke adhesiefrequentie voor elk contacttijdstip worden berekend door de aspecifieke adhesiefrequentie eraf af te trekken.

De gegevens van de specifieke adhesiefrequentie versus contacttijd zijn gefit met een probabilistisch model dat een tweede-orde voorwaartse en een eerste-orde omgekeerde interactie in één stap beschrijft tussen één soort receptoren en één soort liganden; in deze vergelijking is KA de 2D-affiniteit en is KA de 2D-off rate.

MR en ML zijn de respectievelijke receptor- en liganddichtheden en AC is het contactoppervlak. De curvefit heeft twee parameters, ac, k, a, en K off, aangezien AC en KA zijn samengevoegd en gezamenlijk worden aangeduid als de effectieve 2D-affiniteit; het product hiervan met de off-rate is de effectieve 2D-on-rate AC K on equals AC KA times K off. Hier wordt een voorbeeld getoond van de bepaling van integrine alpha L beta twee.

Site-dichtheid op neutrofielen. Neutrofielen werden eerst geïncubeerd met 1 µg/mL E-selectine IG, gevolgd door verzadigende concentraties van PE-geconjugeerd anti-humaan CD11, een monoklonaal antilichaam, of een relevante muizen-IgG1 als controle. Na een incubatietijd van 30 minuten werden de monsters gewassen en geanalyseerd op een flowcytometer met standaardinstellingen.

Heldere PE-kalibratiekraaltjes. Paneel A toont fluorescentiehistogrammen van kalibratiekraaltjes samen met die van cellen die wel of niet met E-selectine IG zijn behandeld. Specifieke kleuring met CD 11 A monoklonaal antilichaam wordt weergegeven door ononderbroken lijnen en de relevante isotype-controle antilichaamkleuring wordt weergegeven door stippellijnen.

Paneel B toont het proces van dichtheidskwantificering. Log 10 werd berekend voor de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk van de vier beads. Kalibratiepiekwaarde uit paneel A en voor de lot-specifieke PE-moleculen per bead.

Een lineaire regressie van log 10 PE-moleculen per bead tegenover log 10 fluorescentie werd uitgezet voor geselecteerde geïntrudeerde cellen. Log 10 fi is gelijk aan 3,99, aangegeven met de blauwe gesloten cirkel, en 2,23, aangegeven met de blauwe open cirkel, voor respectievelijk het specifieke monoklonale antilichaam en het controleantilichaam. Wanneer de lineaire vergelijking voor X werd opgelost, werd het totale aantal alpha L beta two of neutrofielen berekend op 9.587.

De oppervlaktedichtheid werd berekend op 43 sites per micron kwadraat, uitgaande van een neutrofiel diameter van 8,4 microns. De volgende grafiek toont de lopende adhesiefrequentie fi voor specifieke binding bij één seconde en 10 seconden. Contacttijden gemeten uit herhaalde adhesietestcycli tussen ICAM-1 gecoate rode bloedcellen en menselijke neutrofielen die integrine alfa L beta twee tot expressie brengen.

Hier tegenover wordt de loophechtingsfrequentie fi getoond voor aspecifieke binding bij contacttijden van één seconde en tien seconden, gemeten uit herhaalde adion-testcycli tussen met menselijk IgG gecoate rode bloedcellen en menselijke neutrofielen die integrine alfa L bèta twee tot expressie brengen. Deze laatste grafiek illustreert de kinetiek van I A één-binding aan neutrofiel integrine alfa L bèta twee; de hechtingskansen gemeten voor drie celparen bij elke contacttijd werden gemiddeld en uitgezet tegen de contacttijd om te controleren voor aspecifieke binding. Er zijn twee verschillende condities gebruikt.

Eén rode bloedcel gecoat met het anti-TFC-vangstantilichaam en geïncubeerd met menselijk IgG in plaats van ICAM-1 IG en twee neutrofielen die binden aan rode bloedcellen die niet met het vangstantilichaam zijn gecoat. De niet-specifieke binding, geregistreerd als de controlecurve voor menselijk IgG, werd gebruikt om een specifieke adhesiekanscurve te verkrijgen. Hierbij is gebruikgemaakt van de eerder getoonde vergelijking voor correctie van niet-specifieke binding.

De gecorrigeerde specifieke adhesiekanscurve werd gefit met behulp van modelfitting. De specifieke adhesiekanscurve gaf de effectieve bindingsaffiniteit terug. Een CKA is gelijk aan 1,4 × 10⁻⁴ µm⁴ en koff is gelijk aan 0,3 s⁻¹.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de kinetiek van receptor-ligandinteracties meet wanneer beide moleculen verankerd zijn op de oppervlakken van de interagerende cellen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de dichtheden aan de ligandzijde zodanig gekozen moeten worden dat de adhesiefrequentie in het middenbereik ligt, en onthoud dat het werken met bloed en sommige reagentia voor specifieke behandelingen, zoals natriumazide en DMSO, extreem gevaarlijk kan zijn. Daarom zijn voorzorgsmaatregelen, zoals het zorgvuldig lezen van de MSDS van de reagentia en het dragen van handschoenen tijdens het uitvoeren van deze procedure, vereist.