Name: Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Leer de hechtingsfrequentie-assay om receptor-ligand-interactiekinetiek te meten op celoppervlakken met functionele rode bloedcellen als sensoren. Deze methode schat bindingsaffiniteit en off-rate voor biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de NIH subsidie ​​R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343, en R01GM096187.

1. RBC isolatie van de volbloed <ol><li> Bereid EAS-45 oplossingen. Afweging van alle ingrediënten uit Tabel I en los op in 100-200ml van DI water. Voeg water toe om 1000ml oplossing te maken en de pH aan te passen aan 8,0. Filter en aliquot van 50ml. Invriezen bij -20 ° C voor opslag. </li></ol> Opmerking: Stap 1.2 moet worden uitgevoerd door een opgeleide medische professional, zoals een verpleegkundige, met een Institutional Review Board goedgekeurde protocol. <ol start="2"><li> Teken 3-5ml van bloed uit de mediaan cubitaal ader in een 10ml tube met EDTA en voorzichtig mengen onmiddellijk het bloed met EDTA en grondig om te voorkomen dat stolling. </li><li> Proces bloedmonster zo spoedig mogelijk. Al de volgende stappen, behalve centrifugeren moet worden gedaan onder de motorkap te houden de voorbereiding steriel. Overdracht van het bloed om een ​​50 ml centrifugebuis, voeg 10 ml koud en steriel Histopaque 1077 en centrifugeer 5 min @ 1000 tpm, 4 ° C. Tweemaal herhalen. </li><li> Voeg 10ml koud en steriel PBS, centrifuge voor 5min @ 1000 tpm, 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal dit vier maal (totaal 5 keer). </li><li> Wassen met steriele EAS-45 (5min @ 1000 tpm, 4 ° C) twee keer. Tijdens de laatste wassen zet RBC naar een nieuwe steriele 15 ml buis. </li><li> Resuspendeer RBC in10ml EAS-45. </li></ol> 2. RBC biotinylatie <ol><li> Neem de tube met RBC vanaf stap 1. Verwijder alle supernatant na centrifugeren voor 5min @ 1000 tpm, 4 ° C. Doe 10μl van RBC pellet aan elk van de verschillende flesjes en voeg overeenkomstige hoeveelheid PBS aan elke injectieflacon (zie tabel II van bijvoorbeeld de voorbereiding van zes verschillende RBC biotinylering concentraties). </li><li> Het maken van verse Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 verdunningen volgens tabel II. </li><li> Voeg 10μl van 0,1 M boraatbuffer aan elke flacon. </li><li> Voeg berekende hoeveelheid biotine oplossing voor elke flacon (zie tabel II als voorbeeld) en vortex onmiddellijk. </li><li> Plaats elke RBC flaconin een 50 ml conische buis en incubeer op rotator voor 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was elke flacon 3 keer met 800μl van EAS-45 voor 2min @ 2000 tpm. </li><li> Voeg 100μl van EAS-45 aan elk flesje en bewaar bij 4 ° C. In elk 1μl van de uiteindelijke oplossing nu moet worden ~ 1mln van RBC. </li></ol> 3. Functionaliseren de biotine-linked liganden * op RBC <ol><li> Bereid 2mg/ml streptavidine oplossing volgens instructies van de fabrikant. Aliqouted oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C. </li><li> Meng een gelijke hoeveelheid van RBC uit stap 2.7 (10μl) met streptavidine-oplossing, vortex onmiddellijk op rotator voor 30 minuten incuberen bij 4 ° C. </li><li> Was drie keer met 500μl van EAS-45 voor 2min @ 2000 tpm. Voeg 15μl EAS-45 / 1% BSA voor opslag. </li><li> Meng gelijke hoeveelheid van RBC uit stap 3.3 (10μl) met een 20μg/ml ligand-oplossing, vortex onmiddellijk en incubeer op rotator voor 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was twee keer met 500μl van EAS-45 / 1% BSA voor 2min @ 2000 tpm. Voeg 15μl van EAS-45 / 1% BSA voor opslag. </li></ol> * Als uw eiwit heeft geen biotine link kunt u gebruik maken van een van de commercieel verkrijgbare kits voor eiwit biotinylatie (bijvoorbeeld, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-biotinylatie Kit) of het gebruik gebiotinyleerde het vastleggen van antilichamen als een tussenstap zoals getoond in de video. 4. Kwantificering van de receptor en ligand dichtheden <ol><li> Incubeer ligand-coated RBC uit stap 3 en, in een ander flesje, receptor-dragende cellen met verzadigende concentraties van de respectieve mAbs voor 30min bij kamertemperatuur. Incubeer in afzonderlijke flacons cellen met irrelevante isotype-gematchte antilichamen voor controle. Als de primaire antilichamen worden niet fluorescent gelabelde, incubeer met fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Analyseren van monsters bereid in stap 4.1 met flow cytometery met bijbehorende TL-calibration kralen. Bereken de dichtheden zoals getoond in Fig. 1. </li></ol> 5. Voorbereiding voor micropipet en cel kamer <ol><li> Trek micropipetten uit capillaire buizen met behulp van PN-30 Magnetic Glass Narishige 'micro-elektrode Horizontale Puller of Sutter Instrumenten Micropipet Puller. </li><li> Gebruik micromanipulator met microforge aan het uiteinde van de getrokken micropipet aan te passen aan een gewenste grootte (meestal de gewenste diameter varieert van 1-5 urn afhankelijk van de grootte van de cellen om gebruikt te worden in de studie). </li><li> Bereid de cel kamer door te snijden microscoop Dekglas tot het gewenste formaat. Afdichting van de kamer gebruik van minerale olie aan beide kanten tot middelgrote verdamping te voorkomen om de osmolariteit veranderen tijdens het experiment. </li><li> Voeg de receptor-en ligand-dragende cellen naar de kamer. </li></ol> 6. Micropipet hechting frequentie test <ol><li> Aspireren van de interactie cellen door respectieve pipetten en gebruiken de computer geprogrammeerde piezoelectr ic vertaler van de RBC in-en uitrijden van het contact met de andere cel met gecontroleerde contactoppervlak en tijd. Detect hechting gebeurtenissen door het observeren van RBC rek bij de cel scheiding. </li><li> Herhaal de contact-retractie cyclus 50-100 keer voor een bepaalde tijd contact. Noteer de waargenomen hechting gebeurtenissen door het toevoegen van "1" voor hechting of "0" voor geen hechting in een kolom van Excel-spreadsheet. U kunt gebruik maken van een opname-apparaat, bijvoorbeeld, digitale media of videoband, voor de microscopische beelden. </li><li> Noteer de hechting frequentie versus contact opnemen met de tijd curve met behulp van ten minste drie verschillende cel-paren voor elk contact de tijd om een ​​gemiddelde en SEM te verkrijgen. </li><li> Noteer de niet-specifieke binding curve voor de controle met behulp van rode bloedcellen bedekt met irrelevante liganden (bijv. BSA) en / of blokkeren van de liganden of receptoren met behulp van hun specifieke functionele blokkade mAb's. Specifieke hechting frequentie bij elk contact tijdstip kan worden berekend door verwijdering van de niet-specifieke aanhechting frequentie 1. </li></ol>ove_title "&gt; 7. Data-analyse <ol><li> Passen bij de specifieke hechting frequentie P versus een contact tijd t gegevens door een probabilistische model (vergelijking 1) dat een tweede-orde naar voren en eerste-orde omgekeerd, single-step interactie tussen een enkele soort van receptoren en een enkele soort van liganden 1 beschrijft : <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking 1"> waar K een is de 2D-effectieve bindingsaffiniteit, k is uit de off-rate, m r en l m zijn de respectieve receptor en ligand dichtheden gemeten in stap 4, en A c is het contactoppervlak. De curve-fit heeft twee parameters, A c K a en k off, als een C en K een hoop worden gegooid bij elkaar en riep samen zo effectief 2D-affiniteit. Het product met de off-rate is het effectieve 2D on-tarief: A c k op = A c K een x k off. De specifieke hechting frequentie P een wordt berekend door aftrek van de niet-specifieke aanhechting fractie (P-specifieke) van de totale gemeten hechting (P gemeten) 1,21: <img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking 2"></li></ol> 8. Representatieve resultaten: <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Bepaling van de integrine α L β 2 site dichtheid op neutrofielen. Neutrofielen werden eerst geïncubeerd met 1μg/ml van E-selectine-Ig voor 10min aan de experimentele conditie gebruikt worden in de figuren 3,4 of zonder E-selectine-Ig wedstrijd, en vervolgens met verzadigende concentraties (10μg/ml) van PE-geconjugeerd anti -menselijke CD11a mAb (kloon HI111, zie Tabel van specifiekereagentia en apparatuur) of irrelevant muis lgG1 voor controle, gewassen, en geanalyseerd onmiddellijk. Monsters werden gelezen op BD LSR flowcytometer met standaard QuantiBRITE PE-kalibratie kralen. Paneel A toont fluorescentie histogrammen van de kalibratie kralen (roze) samen met die van E-selectine-Ig behandeld (blauwe kleur) of onbehandelde cellen (groene kleur). Specifieke CD11a mAb kleuring is getekend in volle bochten en irrelevante isotype-gematchte controle antilichaam kleuring wordt weergegeven in stippellijnen. Cellen behandeld met E-selectine-Ig (aanwezigheid in alle wasstappen en in FACS buffer) had geen invloed op de CD11a dichtheid gezien vanaf de vergelijking met onbehandelde cellen. Paneel B toont het proces van dichtheid van kwantificering. Log10 werd berekend voor de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (FI) van elke piek waarde van vier kalibratie kraal histogrammen uit Panel A (roze cirkels) en voor het perceel-specifieke PE moleculen per kraal (van de fabrikant). Een lineaire regressie van Log10 PE moleculen per kraal tegen Log10 fluoresclingen werd uitgezet. Voor E-selectine behandelde cellen de Log10 FI (y)-waarden gelijk zijn 3,99 (blauw rondje) en 2,23 (blauw open cirkel) voor specifieke mAb en controle antilichaam, voor respectievelijk. We losten de lineaire vergelijking voor x (waarden worden uitgezet als groene en blauwe cirkels op Paneel B) x = Log10 PE / cel en, zoals PE:. MAb-verhouding was 1:1, het totaal aantal α L β 2 op neutrofielen werd berekend als 9587. Oppervlaktedichtheid werd berekend op 43 moleculen / um 2, met behulp van 8.4μm als de neutrofielen diameter 22. Dichtheid van ICAM-1 werd eveneens gemeten met flow cytometery gebruik van PE-anti-humaan CD54 mAb, die 65 mol / um 2 geëvenaard. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Micropipet systeem schema's. Ons micropipet systeem werd geassembleerd in huis en bestaat uit drie subsystemen: een imaging subsysteem om een ​​te observeren, record en analyseren van de bewegingen van de micropipet-opgezogen cel; een micromanipulatie subsysteem om een ​​om de cellen uit de cel te selecteren kamer, en een druk subsysteem om een ​​om de cellen te zuigen in de micropipetten. Het centrale stuk van de beeldvorming subsysteem is omgekeerde microscoop (Olympus IMT-2 IMT2) met een 100x olie-immersie 1,25 NA doelstelling. Het beeld wordt naar een videorecorder door middel van een heffing paar apparaat (CCD) camera. Een video timer is gekoppeld aan het systeem voor het bijhouden van de tijd. Elke micropipet kan worden gemanipuleerd door een mechanische aandrijving gemonteerd op de microscoop en fijn geplaatst met een drie-assige hydraulische micromanipulator. Mechanische manipulatoren van Newport konden worden gebruikt. Een van de micropipet houders is gemonteerd op een piëzo-elektrische vertaler, is de chauffeur van die gecontroleerd wordt door een computer LabView code (beschikbaar op aanvraag) en het signaal vertaalt door middel van een DAQ bord via een spanning versterker (zelfgemaakte) naar de piezo actuator. Dit is eenllows een om de pipet te verplaatsen nauwkeurig en herhaalbaar in een hechting testcyclus. De drukregeling subsysteem wordt gebruikt om te zuigen controle tijdens het experiment. Een hydraulische lijn verbindt de micropipet houder een vloeistof reservoir. Een fijne mechanische klepstandsteller kan de hoogte van het reservoir om precies te zijn gemanipuleerd. Micropipetten zijn gegenereerd met behulp van KIMAX smeltpunt borosilicaatglas capillaire buizen (met een buitendiameter van 1,0 ± 0,07 mm en een binnendiameter van 0,7 ± 0,07 mm. Ten eerste, de micropipetten van capillairen worden getrokken met behulp van de norm PN-30 Magnetic Glass Narishige 'micro-elektrode horizontaal Puller (Sutter Instruments Micropipet Puller is een andere trekker optie). Ten tweede, Microforge systeem (gebouwd in huis) wordt gebruikt om de micropipetten tot de gewenste grootte van de opening te snijden. Commerciële modellen van Microforge systemen zijn ook beschikbaar. Voor trillingen van de micropipetten voorkomen dat tijdens het experiment, de Microscopa, samen met de micromanipulators, wordt geplaatst op een luchtvering tafel. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Running hechting frequentie F i voor specifieke (A) en niet-specifieke (B) binding op 1s (rood) en 10s (blauw) contact tijden gemeten vanaf herhaald hechting testcycli tussen RBC's bedekt met ICAM-1 (A) of Higg (B ) met menselijke neutrofielen uiten van integrine α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), waarbij i de testcyclus index, X i is gelijk aan "1" (adhesie) of "0" (geen adhesie). F n (n = 50) werd gebruikt als de beste schatting voor de hechting waarschijnlijkheid. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4 De kinetiek vanICAM-1 binding aan neutrofielen integrine α L β 2 ( <img alt="Square" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Square"> ). Gemeten hechting waarschijnlijkheid zoals getoond in figuur 3 voor de drie cellen paren op elk contact is gemiddeld en uitgezet tegen contact met de tijd. De kamer medium werd HBSS met 1 mM elk van Ca 2 + en Mg 2 + plus 1μg/ml van dimeer E-selectine-Ig aan α L β upregulate 2 bindend. Voor het vastleggen van ICAM-1-Ig op rode bloedcellen, een tussenstap werd toegevoegd aan RBC incuberen met 10μg/ml capture antilichaam (gebiotinyleerd geit-anti-humaan Fc antilichaam, eBioscience) na de streptavidine incubatie stap. Om te controleren voor niet-specifieke binding twee verschillende condities werden gebruikt: 1) RBC bekleed met de anti-mens-Fc capture antilichaam en geïncubeerd met humaan IgG in plaats van ICAM-1-Ig (O) en 2) neutrofielen binden aan RBC niet bedekt met de capture antilichaam (Δ). 10μg/ml menselijk IgG werd toegevoegd aan het medium te minimaliseren binding van E-Selectine-Ig in oplossing om de capture antilichaam op de RBC oppervlak. Niet-specifieke binding opgenomen als menselijk IgG regelcurve werd gebruikt om een ​​specifieke hechting kans curve te verkrijgen ( <img alt="Square" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Square"> ) Met behulp van Eq. 2. Montage van de specifieke hechting kans curve met Eq. Een (vaste lijn) terug effectieve bindingsaffiniteit A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 en k off = 0,3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> MW (g / mol) </th><th> Concentratie (mM) </th><th> Hoeveelheid (g) </th></tr><tr><td> Adenine </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-glucose (dextrose) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Natriumfosfaat, tweebasisch (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. EAS-45 buffer voorbereiding (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg biotine-XHS in 550 ul van DMF </td><td> 0,1 M biotine-oplossing </td></tr><tr><td> 1:10 verdunning van 0,1 biotine w / DMF </td><td> 0,01 M biotine-oplossing </td></tr><tr><td> 1:100 verdunning van 0,1 biotine w / DMF </td><td> 0.001m biotine-oplossing </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Voorbereiding van de biotine-oplossing. <table border="1"><tbody><tr><th> biotine uiteindelijke concentratie (uM) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBC pellet voorraad (pl) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (pl) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0,1 M boraatbuffer (pl) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0,01 M biotine-oplossing (pl) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> 0.001m biotine-oplossing (pl) </td><td> 0.8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Biotinylering van RBC.

<ol><li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+anchor+influences+ligand+binding+two-dimensional+kinetic+rates+and+three-dimensional+affinity+of+FcgammaRIII+%28CD16%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16).</a> J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+and+independent+binding+of+Fcgamma+receptors+IIa+and+IIIb+to+surface-bound+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG.</a> Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+binding+to+multiple+ligands%3A+kinetic+rates+of+CD16b+for+membrane-bound+IgG1+and+IgG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2.</a> Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+effects+of+molecular+orientation+and+length+on+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics.</a> J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).</li>
<li>Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurements+of+cell+surface+E-selectin%2Fcarbohydrate+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions.</a> Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophys. J. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+carrier+stiffness+and+microtopology+on+two-dimensional+kinetics+of+P-selectin+and+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+%28PSGL-1%29+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions.</a> J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).</li>
<li>Waugh, R. E., Lomakina, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+formation%2C+not+bond+kinetics%2C+limits+adhesion+rate+between+human+neutrophils+and+immobilized+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1.</a> Biophys. J. 96, 268-275 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+kinetics+regulation+of+alphaLbeta2-ICAM-1+interaction+by+conformational+changes+of+the+alphaL-inserted+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).</li>
<li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1%3A+divalent+ion+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. J. 96, 276-284 (2009).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chien, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stage+cadherin+kinetics+require+multiple+extracellular+domains+but+not+the+cytoplasmic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region.</a> J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).</li>
<li>Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+MHC-CD8+interaction+at+the+T+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane.</a> J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).</li>
<li>Wasserman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+variant+peptide-mediated+anergy+of+encephalitogenic+T+cells+requires+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1.</a> J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 Forthcoming.</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).</li>
<li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li>
<li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li>
<li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+leukocytes+in+capillaries%3A+role+of+cell+size+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+%28CD16a%29+binding+to+IgG+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin%3A+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li>
<li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells%2C+particles%2C+and+membrane+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li>
<li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li>
<li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+modeling+of+rosette+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li>
<li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li>
<li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met succes gebruik van de micropipet hechting frequentie test moet men overwegen een aantal kritische stappen. Controleer eerst of de specifieke interactie van de receptor-ligand systeem van belang vast te leggen. Niet-specifieke controle metingen (zie Fig. 3, 4) zorgen voor de specificiteit. Idealiter zou niet-specifieke aanhechting waarschijnlijkheden lager zijn dan 0,05 voor alle contact tijd duur en om een ​​significant verschil tussen de specifieke en niet-specifieke aanhechting kansen voor elk tijdstip te hebben. ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus # </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Verdun tot 1x met gedeïoniseerd water voor gebruik </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> RBC isolatie </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> RBC isolatie </td></tr><tr><td> Adenine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 voorbereiding </td></tr><tr><td> D-glucose (dextrose) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 voorbereiding </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 voorbereiding </td></tr><tr><td> Natriumchloride (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 voorbereiding </td></tr><tr><td> Natriumfosfaat, tweebasisch (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 voorbereiding </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 voorbereiding </td></tr><tr><td> Biotine-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> RBC biotinylatie </td></tr><tr><td> Dimethylformamide (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> RBC biotinylatie </td></tr><tr><td> Boraat buffer (0,1 M) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 11455-90 </td><td> RBC biotinylatie </td></tr><tr><td> Streptavidine </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligand functionaliseren </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligand functionaliseren </td></tr><tr><td> Quantibrite PE Beads </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Dichtheid kwantificering </td></tr><tr><td> Flowcytometer </td><td> BD Immunocytometry Systems </td><td> BD LSR II </td><td> Dichtheid Quanidentificatie </td></tr><tr><td> Capillaire Tube 0.7-1.0mm x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipet trekken </td></tr><tr><td> Mineral Oil </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Kamer montage </td></tr><tr><td> Microscoop Dekglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-G </td><td> Kamer montage </td></tr><tr><td> PE α-menselijke CD11a Kloon HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Reagens voor Fig.1 </td></tr><tr><td> PE anti-humaan CD54 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Reagens voor Fig.1 </td></tr><tr><td> Muis IgG1 isotype controle PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Reagens voor Fig.1 </td></tr><tr><td> hydraulische micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipet systeem </td></tr><tr><td> Mechanische manipulator </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-m, SM-13, DM-13 </td><td> Micropipet systeem </td></tr><tr><td> piëzo-elektrische vertaler </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipet systeem </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Versie 8.6 </td><td> Micropipet systeem </td></tr><tr><td> DAQ board </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipet systeem </td></tr><tr><td> Optische tafel </td><td> Kinetics Systems </td><td> 5200 Series </td><td> Micropipet systeem </td></tr></tbody></table>

hechting frequency assay voor in situ kinetiek analyse van de cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

De micropipet hechting test werd ontwikkeld in 1998 tot twee-dimensionale (2D) receptor-ligand bindingskinetiek een te meten. De test maakt gebruik van een menselijke rode bloedcellen (RBC) als hechting sensor en presenterende cel voor een van de interagerende moleculen. Er werken micromanipulatie aan de RBC in contact te brengen met een andere cel die de andere interactie molecuul tot uitdrukking met precies gecontroleerde zone en tijd in een band de vorming mogelijk te maken. De hechting gebeurtenis wordt gedetecteerd als RBC rek op te trekken de twee cellen uit elkaar. Door het controleren van de dichtheid van de liganden geïmmobiliseerd op het oppervlak van RBC, is de kans op aanhechting bewaard in mid-range tussen 0 en 1. De hechting kans is geschat op basis van de frequentie van hechting gebeurtenissen in een opeenvolging van herhaald contact cycli tussen de twee cellen voor een bepaalde tijd contact. Het variëren van de contacttijd genereert een bindend curve. Montage van een probabilistisch model voor receptor-ligand reactiekinetiek 1 tot en met de bindendecurve geeft de 2D-affiniteit en off-rate. De test is gevalideerd met behulp van interacties van Fcγ-receptoren met IgG Fc 1-6, selectines met glycoconjugaat liganden 6-9, integrines met liganden 10-13, homotypical cadherine binding 14, T-cel-receptor en coreceptor met peptide-major histocompatibility complexen 15 - 19. De methode is gebruikt om de regelgeving van 2D-kinetiek te kwantificeren door biofysische factoren, zoals het membraan microtopology 5, membraan anker 2, moleculaire oriëntatie en lengte 6, vervoerder stijfheid 9, kromming 20, en impingement werking 20, evenals biochemische factoren, zoals modulatoren van het cytoskelet en membraan micro-omgeving waar de interagerende moleculen wonen en het oppervlak organisatie van deze moleculen 15,17,19. De methode is ook gebruikt to onderzoek de gelijktijdige binding van dual-receptor-ligand soorten 3,4, en 19 trimolecular interacties met behulp van een aangepast model 21. Het grote voordeel van de methode is dat deze studie van receptoren in hun eigen omgeving membraan mogelijk maakt. De resultaten kunnen zeer verschillend zijn van de verkregen die gebruik maken van gezuiverd receptoren 17. Het staat ook studie van de receptor-ligand interacties in een sub-seconde tijdschaal met temporele resolutie ver buiten de typische biochemische methoden. Ter illustratie van de micropipet hechting frequentie methode, tonen we kinetiek meting van intercellulaire adhesie molecule 1 (ICAM-1) gefunctionaliseerde op RBC binding aan integrine α L β 2 op neutrofielen met een dimeer E-selectine in de oplossing voor α L β 2 te activeren.

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

De micropipet-adhesieassay werd in 1998 ontwikkeld om tweedimensionale (2D) receptor-ligand-bindingskinetiek te meten1. De assay maakt gebruik van een humane rode bloed...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de kinetiek van de receptor-ligandinteractie te meten wanneer beide moleculen zijn verankerd op de oppervlakken van de interagerende cellen. Dit wordt bereikt door eerst de rode bloedcellen, die dienen als adhesiesensoren, te functionaliseren met liganden en door receptor-dragende cellen voor te bereiden. Als tweede stap wordt de micropipetkamer geassembleerd en worden adhesietests uitgevoerd om de adhesiegebeurtenissen vast te leggen.Vervolgens wordt de curve van de adhesiekans tegenover de contacttijd van de cellen uitgezet en gefit met het model. Om de kinetische parameters te schatten, worden resultaten verkregen die de tweedimensionale effectieve bindingsaffiniteit en de off-rate tonen, geschat op basis van de gegevens. Maar waar komt het idee voor deze assay vandaan?Onderzoekers bestuderen de interactie tussen receptoren en liganden. Meestal worden scheurkrachten gemeten en dat is wat wij ook doen, maar op een dag vroegen we ons af of we simpelweg de binaire uitkomst konden meten — nul voor geen adhesie en één voor adhesie — en vanuit deze nul-één metingen de kinetiek konden afleiden om de micro-pipetfrequentie-assay te demonstreren. Dr. Veronica Zana Zina, een wetenschappelijk onderzoeker in mijn laboratorium, zal het experiment aan u tonen.Rode bloedcellen die uit volbloed zijn geïsoleerd, worden gebiotineerd voor de adhesiefrequentie-assay. Begin deze procedure door de buis met geïsoleerde rode bloedcellen te centrifugeren, verdeel telkens 10 µL van het pellet van rode bloedcellen over verschillende vials en voeg aan elk vial de overeenkomstige hoeveelheid PBS toe om meerdere biotinylatieconcentraties van rode bloedcellen voor te bereiden. Voeg vervolgens 10 µL 0,1 M BORES-buffer toe aan elk vial.Voeg vervolgens een berekende hoeveelheid biotinoplossing toe aan elk vial en vortex direct. Plaats elk vial met rode bloedcellen gedurende enkele seconden in een conische buis van 50 milliliter en incubeer 30 minuten op een rotator bij kamertemperatuur; voeg na 30 minuten EAS 45-buffer toe aan elk vial en centrifugeer twee minuten bij 2000 toerental per minuut. Herhaal het wassen met EAS 45-buffer tweemaal, voor een totaal van drie wasbeurten.Voeg ten slotte 100 µL EAS 45-buffer toe aan elk vial en bewaar deze bij 4 °C om de liganden op het oppervlak van de rode bloedcellen te functionaliseren. Nadat ze in de vorige stap zijn geactiveerd, worden de rode bloedcellen gedurende 30 minuten bij 4 °C geïncubeerd met een verzadigde concentratie strep TTR en drie keer gewassen met EAS 45-buffer gedurende twee minuten bij 2000 rpm. Incubeer daarna de rode bloedcellen direct met het gebiotineerde ligand, of incubeer de rode bloedcellen met het overeenkomstige gebiotineerde capture-antilichaam, gevolgd door incubatie met de liganden. Het protocol in deze video maakt gebruik van het gebiotineerde capture-antilichaam.Micropipetten worden vervaardigd met behulp van borosilicaatglazen capillaire buizen met een laag smeltpunt. Gebruik eerst een micropipet-trekker om de capillaire buizen uit te trekken. Gebruik vervolgens een micromanipulator met een micro-forge om de tip van de micropipet op de gewenste openinggrootte af te snijden.De vereiste diameter varieert gewoonlijk van één tot vijf micron, afhankelijk van de grootte van de cellen die in het onderzoek worden gebruikt. Om de celkamer voor te bereiden, gebruikt u twee stukken microscoopdekglaas die op de gewenste maat zijn gesneden, verwijder het stof van de dekglasjes met een spuitbus perslucht, voeg het medium voor de celkamer toe en sluit de kamer aan beide zijden af met minerale olie om verdamping van het medium te voorkomen. Dit zou anders de osmolariteit tijdens het experiment beïnvloeden.Het micropipetsysteem dat in deze assay wordt gebruikt, bestaat uit drie subsystemen: een imagingsubsysteem voor het observeren, vastleggen en analyseren van de bewegingen van de met de micropipet geaspireerde cel, een micromanipulatiesubsysteem om de selectie van cellen uit de celkamer mogelijk te maken en een druksubsysteem voor het aspireren van de cellen in micropipetten. Het centrale onderdeel van het imagingsubsysteem is een omgekeerde microscoop met een 100-voudige olie-immersieobjectief. De beelden worden gedetecteerd door een CCD-camera (charge-coupled device) en verzonden naar een videorecorder.Een videotimer is aan het systeem gekoppeld om de tijd bij te houden. Nadat de micropipet is gevuld met gedeïoniseerd water, wordt deze in de houder geplaatst op een mechanische aandrijving die op de microscoop is gemonteerd. De micropipet kan nauwkeurig worden gepositioneerd met een hydraulische micromanipulator met drie assen.Een van de micropipet houders is gemonteerd op een computergestuurde piëzo-elektrische translator. Hiermee kan de pipet nauwkeurig worden bewogen in een adhesietestcyclus. Het drukregelsysteem wordt gebruikt om de zuigkracht te beheersen.Tijdens het experiment verbindt een hydraulische lijn de houder van de micropipet met een vloeistofreservoir. Met een fijne mechanische positioneerder kan de hoogte van het reservoir nauwkeurig worden gemanipuleerd. Nadat de kamer is geassembleerd, worden de micropipetten ingesteld, worden de cellen in de kamer geïnjecteerd om de assay te starten, worden de interagerende cellen door de respectieve pipetten geaspireerd en wordt de PSO elektrische translator gebruikt om de rode bloedcel in en uit contact met de neutrofiel te brengen met een gecontroleerd contactoppervlak en een gecontroleerde contacttijd.Een adhesiegebeurtenis wordt waargenomen wanneer de rode bloedcel verlengt bij celscheiding; een gebeurtenis zonder adhesie komt overeen met geen verlenging van de rode bloedcel. Registreer de waargenomen adhesiegebeurtenissen door een een voor adhesie of een nul voor geen adhesie in te voeren in een kolom van een Excel-spreadsheet.Registreer de curve van de adhesiefrequentie tegenover de contacttijd met ten minste drie verschillende celparen voor elke contacttijd. Om een gemiddelde en SEM als controle te verkrijgen, dient de curve van aspecifieke binding te worden geregistreerd door gebruik te maken van rode bloedcellen die zijn gecoat met relevante liganden en/of door de liganden of receptoren te blokkeren met hun specifieke functionele blokkade. Met monoklonale antilichamen kan de specifieke adhesiefrequentie voor elk contacttijdstip worden berekend door de aspecifieke adhesiefrequentie eraf af te trekken.De gegevens van de specifieke adhesiefrequentie versus contacttijd zijn gefit met een probabilistisch model dat een tweede-orde voorwaartse en een eerste-orde omgekeerde interactie in één stap beschrijft tussen één soort receptoren en één soort liganden; in deze vergelijking is KA de 2D-affiniteit en is KA de 2D-off rate.MR en ML zijn de respectievelijke receptor- en liganddichtheden en AC is het contactoppervlak. De curvefit heeft twee parameters, ac, k, a, en K off, aangezien AC en KA zijn samengevoegd en gezamenlijk worden aangeduid als de effectieve 2D-affiniteit; het product hiervan met de off-rate is de effectieve 2D-on-rate AC K on equals AC KA times K off. Hier wordt een voorbeeld getoond van de bepaling van integrine alpha L beta twee.Site-dichtheid op neutrofielen. Neutrofielen werden eerst geïncubeerd met 1 µg/mL E-selectine IG, gevolgd door verzadigende concentraties van PE-geconjugeerd anti-humaan CD11, een monoklonaal antilichaam, of een relevante muizen-IgG1 als controle. Na een incubatietijd van 30 minuten werden de monsters gewassen en geanalyseerd op een flowcytometer met standaardinstellingen.Heldere PE-kalibratiekraaltjes. Paneel A toont fluorescentiehistogrammen van kalibratiekraaltjes samen met die van cellen die wel of niet met E-selectine IG zijn behandeld. Specifieke kleuring met CD 11 A monoklonaal antilichaam wordt weergegeven door ononderbroken lijnen en de relevante isotype-controle antilichaamkleuring wordt weergegeven door stippellijnen.Paneel B toont het proces van dichtheidskwantificering. Log 10 werd berekend voor de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk van de vier beads. Kalibratiepiekwaarde uit paneel A en voor de lot-specifieke PE-moleculen per bead.Een lineaire regressie van log 10 PE-moleculen per bead tegenover log 10 fluorescentie werd uitgezet voor geselecteerde geïntrudeerde cellen. Log 10 fi is gelijk aan 3,99, aangegeven met de blauwe gesloten cirkel, en 2,23, aangegeven met de blauwe open cirkel, voor respectievelijk het specifieke monoklonale antilichaam en het controleantilichaam. Wanneer de lineaire vergelijking voor X werd opgelost, werd het totale aantal alpha L beta two of neutrofielen berekend op 9.587.De oppervlaktedichtheid werd berekend op 43 sites per micron kwadraat, uitgaande van een neutrofiel diameter van 8,4 microns. De volgende grafiek toont de lopende adhesiefrequentie fi voor specifieke binding bij één seconde en 10 seconden. Contacttijden gemeten uit herhaalde adhesietestcycli tussen ICAM-1 gecoate rode bloedcellen en menselijke neutrofielen die integrine alfa L beta twee tot expressie brengen.Hier tegenover wordt de loophechtingsfrequentie fi getoond voor aspecifieke binding bij contacttijden van één seconde en tien seconden, gemeten uit herhaalde adion-testcycli tussen met menselijk IgG gecoate rode bloedcellen en menselijke neutrofielen die integrine alfa L bèta twee tot expressie brengen. Deze laatste grafiek illustreert de kinetiek van I A één-binding aan neutrofiel integrine alfa L bèta twee; de hechtingskansen gemeten voor drie celparen bij elke contacttijd werden gemiddeld en uitgezet tegen de contacttijd om te controleren voor aspecifieke binding. Er zijn twee verschillende condities gebruikt.Eén rode bloedcel gecoat met het anti-TFC-vangstantilichaam en geïncubeerd met menselijk IgG in plaats van ICAM-1 IG en twee neutrofielen die binden aan rode bloedcellen die niet met het vangstantilichaam zijn gecoat. De niet-specifieke binding, geregistreerd als de controlecurve voor menselijk IgG, werd gebruikt om een specifieke adhesiekanscurve te verkrijgen. Hierbij is gebruikgemaakt van de eerder getoonde vergelijking voor correctie van niet-specifieke binding.De gecorrigeerde specifieke adhesiekanscurve werd gefit met behulp van modelfitting. De specifieke adhesiekanscurve gaf de effectieve bindingsaffiniteit terug. Een CKA is gelijk aan 1,4 × 10⁻⁴ µm⁴ en koff is gelijk aan 0,3 s⁻¹.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de kinetiek van receptor-ligandinteracties meet wanneer beide moleculen verankerd zijn op de oppervlakken van de interagerende cellen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de dichtheden aan de ligandzijde zodanig gekozen moeten worden dat de adhesiefrequentie in het middenbereik ligt, en onthoud dat het werken met bloed en sommige reagentia voor specifieke behandelingen, zoals natriumazide en DMSO, extreem gevaarlijk kan zijn. Daarom zijn voorzorgsmaatregelen, zoals het zorgvuldig lezen van de MSDS van de reagentia en het dragen van handschoenen tijdens het uitvoeren van deze procedure, vereist.

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate the technique to measure transcellular interactions between synaptic cell adhesion molecules through the HEK cell aggregation assay. In this assay, an equal number of HEK cells expressing a desired presynaptic cell adhesion molecule and a fluorescent protein are mixed with HEK cells expressing a post-synaptic cell adhesion molecule and another fluorescent protein. The interaction between the cell adhesion molecules forces the cells to aggregate, which can be...

Cell Aggregation Assay to Detect Trans Interactions between Cell Adhesion Molecules

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Deze presentatie demonstreert een methode waarbij elektroporatie van adherante, gekweekte cellen wordt gebruikt voor het bestuderen van intercellulaire, junctionele communicatie, terwijl de cellen groeien op een plaatje dat bedekt is met geleidend en transparant indium-tinoxide.

Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.

Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Leer de hechtingsfrequentie-assay om receptor-ligand-interactiekinetiek te meten op celoppervlakken met functionele rode bloedcellen als sensoren. Deze methode schat bindingsaffiniteit en off-rate voor biologisch onderzoek.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Meer video's verkennen