Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet
25 juli 2012
In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.
Het algemene doel van deze procedure is om het effect van mechanische belasting op de proteolytische splitsing van enkele eiwitten op een zeer parallelle en kosteneffectieve manier te bestuderen. In deze demonstratie wordt in de eerste stap de splitsing van collageen door matrix metalloproteïnase één onderzocht, collageen trimmers worden aangebracht op de glazen deksel van een flowcel, gevolgd door de bevestiging van magnetische kralen van micrometergrootte aan de individuele collageenmoleculen. De tweede stap is om de flowcel in het magnetische pincetapparaat te monteren en te controleren of niet-specifiek bevestigde kralen van het oppervlak van het deksel zijn verwijderd.
Vervolgens wordt het protease toegevoegd aan de flowcellen. De laatste stap is om de proteolysesnelheid te bepalen door de loslating van de kralen in realtime te volgen. Door de loslatingssnelheid van de kralen te meten bij verschillende proteaseconcentraties en krachten, is het mogelijk om standaard zoölogische kinetiekparameters af te leiden met behulp van minimale hoeveelheden substraat en protease.
Bovendien biedt deze techniek unieke informatie over het effect van mechanische kracht op de snelheid van proteolyse en op de structurele veranderingen in het substraateiwit die gepaard gaan met splitsing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met andere methoden zoals optische T-traces en atoomkrachtmicroscopie, is dat deze techniek hoog doorvoerend en kosteneffectief is. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de effectieve kracht op de proteolytische splitsing van enkele eiwitten, kunnen de instrumentatie en technieken worden toegepast op een breed scala aan biofysische problemen, waaronder het effect van kracht op eiwitvouwing en bevestiging.
Begin met de voorbereiding van de flowcel door deksels schoon te maken met behulp van sonicatie. Voeg de deksels toe aan een kleine glazen container die ze kan bevatten en die in de ator past. Vul de container met isopropanol en soniceer in een bad ator gedurende 20 minuten de isopropanol en spoel de deksels met overvloedige hoeveelheden gedeïoniseerd water.
Vul de container met water en soniceer gedurende 20 minuten. Na het soniceren droogt u de deksels in een stroom gefilterde stofvrije lucht. Inspecteer de deksels en gebruik alleen degenen die vrij zijn van vegen.
Ontvet de deksels voor een paar seconden door ze voorzichtig in een gasvlam te houden die door een bunsenbrander wordt geproduceerd, zorg ervoor dat de deksels niet vervormen door overmatige hitte. Deze stap verwijdert resterende oppervlakteverontreinigingen.
Gebruik vervolgens dubbelzijdig scotchtape om de twee deksels aan elkaar te bevestigen. Door de tape eerst ongeveer drie centimeter lang en 0,3 centimeter breed te snijden, bevestigt u de tape aan een 22 bij 40 millimeter deksel, waarbij een kanaal van 1,6 centimeter in het midden wordt achtergelaten. Gebruik een pipettentip om voorzichtig op het deksel te drukken om ervoor te zorgen dat de tape goed is gehecht.
Het magnetische pincetapparaat werd door dit lab geconstrueerd met behulp van een aluminium L-beugel met een pinachtige opening van één millimeter en gemonteerd op een verticale Z-translator om de hoogte van de pincet te moduleren. Twee permanente zeldzame aardmagneten werden aan de beugel aan beide zijden van de pinachtige opening bevestigd om het magnetische veldgradiënt te creëren. Een juiste kalibratie van de magnetische val is essentieel voor deze procedure.
Om succes te garanderen, gebruiken we twee verschillende methoden zoals beschreven in deze sectie. Om de magnetische val te kalibreren Gebruik voor de kalibratie eerder bereid DNA van Lambda-fagen gelabeld aan de vijf prime en drie prime-einden met biotine en doxygen zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Om het DNA aan de flowcel te bevestigen, vult u eerst de flowcel met anti-D zuurstof en antilichaamoplossing en laat u het antilichaam gedurende 15 minuten aan het glazen oppervlak hechten.
Vervolgens wordt het oppervlak van de flowcel behandeld om niet-specifiek binden van DNA te voorkomen door een BSA-oplossing aan de flowcel toe te voegen. Merk op dat voor deze actiestap en alle volgende stappen, het toegevoegde reagensvolume aan de flowcel minstens tweemaal moet zijn. Het volume van de flowcel, dat in deze demonstratie 75 microliter is, incubeert de flowcel gedurende 45 minuten op kamertemperatuur.
Nadat u deze stap hebt herhaald, voegt u 50 picomol functioneel lambda DNA toe en laat het 15 minuten aan het deksel hechten, wast u overtollig DNA weg met een XPBS. Ten slotte voegt u streptavidine gecoate superparamagnetische kralen toe en laat u ze 15 minuten aan het geïmmobiliseerde DNA hechten. In deze demonstratie worden kralen van 2,8 micrometer gebruikt.
Was overtollige kralen weg met een XPBS. Voer vervolgens magnetische pincetkalibratie uit door de permanente magneten naar een positie te verplaatsen die ver van het monsteroppervlak is. Plaats vervolgens de voorbereide flowcel in de microscoop.
Verplaats de permanente magneten in positie boven de flowcel. Kies het brandvlak van Lambda DNA functioneel beladen kralen door te focussen op de kralen weg van beide glazen oppervlakken. Het juiste brandvlak is een waarin de gewenste kralen een helder centrum hebben.
Neem een video van de beweging van de kralen met 80 hertz of hoger voor 500 frames. Verplaats de magneet dichter bij het monsteroppervlak en neem een video op van de beweging van de kralen op elke positie. Voor afstanden groter dan vijf millimeter, verplaats in stappen van één millimeter voor afstanden tussen één en vijf millimeter.
Verplaats in stappen van 0,5 millimeter voor afstanden kleiner dan één millimeter, verplaats in stappen van 0,25 millimeter Voor elke dataset volgt u het centrum van de kralen met behulp van een 2D Gaussische fit. Bereken de kracht via Browniaanse fluctuaties zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Bevestig de nauwkeurigheid van de krachten door de krachtberekening te controleren via een vermogensspectrum Lian-fit.
Om de afvalfrequentie te vinden, kan de relatie tussen toegepaste kracht en afvalfrequentie worden gevonden in de tekst vóór de collageenpeptidebinding aan de flowcellen, druk het collageenpeptide en MMP één eiwitten uit en zuiver. Begin met het toevoegen van de anti mic antilichaamop
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft het gebruik van magnetische pincetten om de impact van mechanische belasting op enzymatische proteolyse op het niveau van individuele moleculen te onderzoeken. De studie richt zich op de splitsing van collageen door matrixmetalloproteïnasen op een zeer parallelle en kostenefficiënte manier.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Biofysica
- Proteomics
Achtergrond
- Proteolyse is een cruciaal biologisch proces.
- Inzicht in de effecten van mechanische krachten op proteolyse kan leiden tot nieuwe inzichten in diverse biologische functies.
- Magnetische tweezers maken nauwkeurige manipulatie en meting op het niveau van individuele moleculen mogelijk.
- Deze methode kan worden toegepast voor de studie van diverse eiwitten en enzymen.
Doel van de studie
- Om het effect van mechanische belasting op de proteolytische splitsing van enkelvoudige eiwitten te onderzoeken.
- Om standaard zoologische kinetische parameters af te leiden met minimale hoeveelheden substraat en protease.
- Om het begrip van enzymatische activiteit onder kracht te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bevestiging van collageen-trimmers aan een glazen dekglas in een flowcel.
- Gebruik van magnetische bolletjes op micrometer-schaal die zijn bevestigd aan individuele collageenmoleculen.
- Montage van de flowcel in een magnetische pincet-apparaat.
- Real-time monitoring van het loslaten van de bolletjes om proteolyse-snelheden te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle hechting van collageen en magnetische kralen voor observatie.
- Real-time monitoring maakte de bepaling van proteolyse-snelheden mogelijk.
- Variatie in proteaseconcentraties en krachten leverde waardevolle kinetische gegevens op.
- Er werd inzicht verkregen in de relatie tussen mechanische belasting en enzymatische activiteit.
Conclusies
- De studie demonstreert de effectiviteit van magnetische tweezers in proteolyse-onderzoek.
- Mechanische krachten hebben een significante invloed op de enzymatische activiteit op het niveau van enkelvoudige moleculen.
- Deze methode kan in de toekomst worden toegepast op andere proteolytische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het meten van krachtafhankelijke proteolyse op single-molecule niveau maakt mechanistische risicoanalyse van protease-targets mogelijk door te onthullen hoe de mechanische micro-omgeving de katalytische efficiëntie beïnvloedt. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie bij fibrose, kankermetastasen en atherogenese, waarbij remodeling van de extracellulaire matrix onder belasting pathofysiologisch relevant is. De magnetic tweezers-assay levert kwantitatieve, reproduceerbare kinetische gegevens met een minimaal verbruik aan reagentia, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te kwantificeren hoe mechanische kracht de kinetiek tussen protease en substraat beïnvloedt, waardoor risico's voor targets die betrokken zijn bij krachtgevoelige pathologieën worden verminderd.
- Operationele waarde: Maakt parallelle meting van tientallen enkelvoudige moleculaire gebeurtenissen mogelijk, waardoor de statistische kracht toeneemt terwijl het verbruik van protease en substraat wordt geminimaliseerd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kracht-proteolyse-snelheidscurves die dienen als kwantitatieve, mechanisme-gebaseerde read-outs voor de screening van protease-remmers onder fysiologisch relevante mechanische condities.
- Operationele waarde: Aanpasbaar aan diverse protease-substraatparen, waardoor het magnetische tweezers-platform kan worden hergebruikt voor verschillende targetfamilies zonder dat daar uitgebreide herontwikkeling voor nodig is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen moleculaire mechanismen en fenotypen op weefselniveau door proteolyse-snelheden van de extracellulaire matrix te koppelen aan cellulaire tractiekrachten in ziekterelevante micro-omgevingen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de selectie van preklinische modellen door protease-doelen te identificeren waarvan de activiteit significant wordt gemoduleerd door biomechanische signalen die aanwezig zijn in fibrotisch stroma of tumorstroma.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses tot lead-identificatie, en biedt mechanistische inzichten die bijdragen aan het ontwerp van assays en screeningcascades voor verbindingen.
- Discovery Biology: Test hoe kracht de proteolytische splitsing beïnvloedt, waardoor duidelijk wordt of de binding aan het doelwit afhankelijk is van de mechanica van de micro-omgeving.
- Screening: Levert kinetische parameters (bijv. katalytische efficiëntie) onder een gedefinieerde kracht, wat structuur-activiteitsrelatie-studies mogelijk maakt die rekening houden met de biofysische context.
- Analytics: Levert tijdopgeloste gegevens van kraaldetachement, wat de berekening van proteolysesnelheden en krachtafhankelijke Michaelis-Menten-parameters faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Verbindt proteolyse-dynamiek op enkelvoudig molecuulniveau met weefselremodelleringsprocessen, mits ondersteund door correlatieve krachtmetingen in ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde, kostenefficiënte capaciteit voor krachtspectroscopie die toepasbaar is op meerdere protease-doelwitten in diverse discovery-projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door krachtafhankelijke conformationele veranderingen in het substraat voorafgaand aan de splitsing te onthullen, waardoor het vertrouwen in het beoogde werkingsmechanisme toeneemt.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare single-molecule metingen met een hoge doorvoer en lage reagenskosten, wat de efficiëntie van de assay verbetert.
- Strategische waarde: Informeert de prioritering van protease-targets door te kwantificeren hoe biomechanische variabelen de vertaling van hits van biochemische naar cellulaire assays beïnvloeden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door targets te identificeren waarvan de activiteit robuust is versus gevoelig voor mechanische ruis in vivo.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in single-molecule biofysica, het bedienen van magnetische pincetten en eiwit-oppervlaktechemie.
- Instrumentarium voor krachtkalibratie, videotracking en de assemblage van flowcellen met nauwkeurige stroomcontrole.
- Standaardisatie van kraalimmobilisatie, krachtkalibratieprotocollen en data-analysepijplijnen tussen teams.
- Overwegingen voor aanpassing van variërende substraatgrootte, lading en koppelingschemie aan magnetische kralen.
- Praktische beperkingen omvatten het krachtbereik (~1-100 pN) en de vereiste voor getetherde, oplosbare eiwitsubstraten die geschikt zijn voor oppervlaktebevestiging.
