Name: Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Leer multiplexed single-molecule force proteolyse metingen met magnetische pincetten voor biochemisch onderzoek. Deze methode onderzoekt mechanische belasting op enzymatische activiteit van matrix metalloproteinase op collageen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Burroughs Wellcome Career Award op het Wetenschappelijk Interface (ARD), de National Institutes of Health door New Innovator Award van de NIH Director&#39;s Programma 1-DP2-OD007078 (ARD), de William Bowes Jr Stanford Graduate Fellowship (ASA ), en aan de Stanford Cardiovascular Institute Jongere Predoctoraal Fellowship (JC). De auteurs danken James Spudich voor lenen microscopie apparatuur.

1. Flow Cell Bereiding <ol><li> Dekglaasjes (# 1.5, 22x22 mm en 22x40 mm, VWR) worden gereinigd met ultrasoonapparaat. <ol><li> Voeg de dekglaasjes tot een klein glazen fles kunnen houden dekglaasjes en passend in de ultrasoonapparaat (zie stap 2). </li><li> Vul de container met isopropanol en ultrasone trillingen in een bad ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten. </li><li> Gooi de isopropanol en spoel de dekglaasjes met een ruime hoeveelheid gedemineraliseerd water geproduceerd door een Barnsted MilliQ apparaat of soortgelijk apparaat. Vul de bak met water en ultrasone trillingen gedurende 20 minuten. </li><li> Na sonicatie, drogen de dekglaasjes in een stroom van gefilterde, stofvrije lucht. Gebruik alleen dekglaasjes die verschijnen schoon (dwz geen vlekken). </li><li> Voorzichtig vlam de dekglaasjes voor een paar seconden om ze schoon te maken van de overige stof en vocht: langs de dekglaasjes door middel van een gasvlam geproduceerd met een bunsenbrander, zorg ervoor dat u het dekglaasje als gevolg van overtollige warmte kromtrekken. Deze stap verwijdert op het oppervlakverontreinigingen. </li></ol></li><li> Met behulp van dubbelzijdig plakband, samen bevestig de twee dekglaasjes. Snijd de tape ~ 3 cm lengte en 0,3 cm in de breedte. Bevestig de tape op 22x40 mm dekglaasje aan het verlaten van een 1,6 cm-kanaal in het midden. Gebruik een pipet tip om zachtjes in te drukken op het dekglaasje om ervoor te zorgen dat de tape goed heeft gehandeld. </li></ol> 2. Magnetisch pincet Setup en kalibratie <ol><li> Magnetisch pincet waren setup met permanente zeldzame aardmetalen magneten zoals eerder beschreven 10,12. Een aluminium L-vormige beugel is uitgevoerd met een 1 mm diameter pinhole en gemonteerd op een verticaal z-translator (Thorlabs) het moduleren van de hoogte van de pincet. Twee vaste zeldzame aardmetalen magneten zijn bevestigd aan de beugel aan weerszijden van het gaatje de magnetische trap (figuur 1) te maken. </li><li> DNA preparaat: DNA van faag lambda gelabeld aan de 5 'en 3' uiteinden met biotine en digoxigenine (IDT DNA, San Diego, CA) werd gebruikt om de mag kalibrerenmagnetische pincet. <ol><li> Meng 50 pi 4 λ nM-DNA met 2 pi van 40 nM biotine geconjugeerd oligonucleotide en warmte bij 60 ° C gedurende 10 minuten. Dan langzaam afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Voeg DNA ligase volgens fabrikant en ligeren bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. </li><li> Voeg 2 pi van 400 nM digoxigenine geconjugeerd oligonucleotide en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. </li><li> Voeg 1,5 ul 10 mM ATP en verder ligatie van de digoxigenine geconjugeerde oligonucleotide de λ-DNA gedurende 3 uur. </li><li> Het overtollige oligonucleotiden en DNA ligase met 100 kDa rotatie filters (Microcon Ultracell YM-100). Een totaal van 1000-voudige buffer-uitwisseling in TE-buffer is voldoende om het overtollige oligo's. Let op: Het is belangrijk niet te gebruiken centrifugetoerental&gt; 500xG, omdat dit zal leiden tot het scheren van het DNA. </li><li> Een steekproef van de DNA via elektroforese op een 0,7% agarosegel dat de DNA iis niet gedenatureerd of geschoren. </li><li> Meet concentratie van DNA. Het gebruik van een NanoDrop UV-Vis spectrometer (Thermo Scientific) wordt aanbevolen omdat de beschikbare monstervolume kan zeer klein. </li></ol></li><li> Bereid stroom cellen zoals beschreven in paragraaf 1. </li><li> Voor de bevestiging van de DNA van de doorstroomcel toevoegen anti-digoxigenine antilichaam (schapen IgG, 1 pg ml'1, Roche Bioscience, Manheim, Duitsland) en laat het op het glasoppervlak hechten gedurende 15 minuten. </li><li> Passiveren het oppervlak van de doorstroomcel niet-specifieke kleven van DNA voorkomen door toevoeging van 2 mg ml -1 BSA, 0,1% Tween-20 in PBS 1x. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. </li><li> Herhaal stap 2.5. </li><li> Voeg 50 pM van fuctionalized λ-DNA en laat het dekglaasje hechten gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder de overmaat DNA met 1x PBS. </li><li> Voeg streptavidine gecoate parels superparamagnetische (1 pm korrels = 2 ug ml'1; 2,8 pm kralen = 20 pg ml'1 </li><li> Verwijder de overmaat kralen met 1x PBS. </li><li> Magnetisch pincet Kalibratie <ol><li> Beweeg de permanente magneten in een positie die ver van het monster oppervlak (&gt; 15 mm). </li><li> Plaats bereide doorstroomcel in de microscoop. </li><li> Zet de permanente magneten in positie boven de doorstroomcel. </li><li> Kies het brandvlak van λ-DNA-gefunctionaliseerde kralen door te focussen op de kralen uit de buurt van beide glazen oppervlakken. De juiste focal plane is er een waarin de gewenste kralen hebben een helder centrum. </li><li> Neem een ​​video van kraal beweging bij 80 Hz of meer voor de 500 frames. </li><li> Plaats de magneet dichter bij het monster oppervlak. Voor afstanden boven de 5 mm, bewegen in stappen van 1 mm. Voor afstanden tussen de 1 en 5 mm, bewegen in stappen van 0,5 mm. Voor afstanden minder dan 1 mm, bewegen in stappen van 0,25 mm. </li><li> Herhaal stap 2.11.5 en 2.11.6 bij elke nieuwe positie van de magneet. </li><li> Voor elke dataingesteld volgen het midden van de korrels met een 2D Gaussiaanse benadering. </li><li> Bereken de kracht via de Brownse fluctuaties met behulp van: </li></ol><img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking 1"> waarbij k B T de Boltzmann thermische energie, L de lengte van λ-DNA en &lt;X 2&gt; de variatie in zwaartepunt positie. <ol start="10"><li> De juistheid van de krachten door het controleren van de berekening van krachten via een vermogensspectrum Lorentz geschikt om de rolloff frequentie te vinden. Uitgeoefende kracht is gerelateerd aan de frequentie rolloff door de relatie: </li></ol><img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking 2"> Wanneer ƒ 0 het rolloff frequentie, een de kraal radius en μ de viscositeit 12. </li></ol> 3. Collageen Peptide Bijlage bij Flow cellen Om een ​​concreet voorbeeld voor de toepassing van onze methodologie te bieden, beschrijven we recent werk in ons laboratorium dat de proteolyse van een trimere collageen model peptide kenmerkt. We verwachten dat deze algemene benadering kan breed worden toegepast op andere eiwitten en polynucleotiden. <ol><li> Het collageen model peptide bestaat uit een N-terminaal 6x His-tag voor zuivering, gevolgd door een 5 x Myc-label (GPP) 10 drievoudige helix-formatie te handhaven, het collageen α1 residuen 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL) in de vorm MMP- een herkenningsplaats de foldon sequentie (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) en een C-terminale KKCK vergemakkelijking labelen met biotine-maleïmide. Foldon afgeleid van de T4-faag eiwit fibritin en stabiliseert collageen model trimeren bij gefuseerd aan de N - of C-terminus 13,14. </li><li> Het collageen peptide en MMP-1 eiwitten werden tot expressie gebracht en gezuiverd als eerder beschreven 4,15. &lt;/ Li&gt; </li><li> Voeg anti-myc (15 ug ml-1) tot de meetcel en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de anti-myc te hechten aan het oppervlak van de doorstroomcel. </li><li> Passiveren de doorstroomcel niet-specifieke bevestiging van eiwitten met 5 mg BSA ml'1 op dezelfde wijze als beschreven in stap 2.5 voorkomen. </li><li> Voeg 150 pM collageen peptide en laat het aan het antilichaam hechten via de myc-tag voor 45 minuten. </li><li> Verwijder de overmaat collageen met PBS-buffer. </li><li> Voeg streptavidine gecoate superparamagnetische kralen (1 micrometer = kralen 2 ug ml-1 en 2,8 micrometer kralen = 20 ug ml -1) en laat ze hechten aan de collageen moleculen gedurende 45 minuten. De 1 pm korrels worden verdund tot de gewenste concentratie in PBS. De 3 urn korrels te scheiden van de oplossing met sterke magneten dan resolubilized in PBS. Dit proces wordt herhaald 3 keer. We hebben gemerkt dat deze stap is essentieel voor get de 3 urn korrels te binden aan het oppervlak geïmmobiliseerd collageen peptide. </li></ol> 4. Force Proteolyse Assay <ol><li> Zodra de stroom cel wordt gemonteerd met collageen peptide en magnetische korrels, het imago van de stroom cel in de magnetische val onder lage, ~ 1 pN kracht. In onze ervaring is een subpopulatie van de korrels soms zwak hechtten aan het oppervlak in een niet-specifieke wijze. De toepassing van bescheiden kracht zorgt ervoor dat deze kralen bevrijd zijn. </li><li> Voeg geactiveerd enzym de doorstroomcel. In dit geval MMP-1 werd vooraf geactiveerd door toevoeging 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetaat) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur. De activering werd gecontroleerd met behulp van SDS-PAGE. </li><li> Zodra de stroom cel wordt teruggeleid in de magnetische pincet apparaat, een video spanning enkele gezichtsveld, meestal waarbij honderden bijgevoegde kralen. Dit zal t = 0. </li><li> Herhaal hetzelfde proces betreffende het opslaan van verschillende gezichtsveld (terwijl t weero hetzelfde gezichtsveld) op regelmatige tijdstippen, tot alle korrels los te koppelen of geen verdere proteolyse waarneembaar is. </li><li> Kinetische data-analyse <ol><li> Tel de kralen in de verschillende domeinen van uitzicht op verschillende tijdstippen en gemiddeld hen. Normaliseren aantal korrels door de gemiddelde aantal korrels op elk tijdstip het aantal korrels bij t = 0. Dit zorgt ervoor dat we de tarieven van de proteolyse van verschillende experimenten te vergelijken, omdat het absolute aantal kralen zal verschillen van experiment om te experimenteren. </li><li> Zet de verhouding als functie van de tijd. In dit geval verdient gemonteerd aan een exponentieel plus een constante. </li></ol><img alt="Vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking 3"> waarbij ƒ (t) is de verhouding van de korrels bevestigd (of collageenmoleculen unproteolyzed) t de tijd, a de fractie van korrels gemonteerd door collageen ketting, b is het verval constant en cde fractie korrels die niet specifiek verbonden. <ol start="3"><li> Hetzelfde experiment wordt herhaald bij verschillende kracht en MMP-1 concentraties om het effect van werking op collageen proteolyse verduidelijken van MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Representatieve resultaten De bovenstaande protocol beschrijft een nieuwe toepassing van magnetische pincet (figuur 1) voor het bestuderen van het effect van werking van enzymatische proteolyse. We gekalibreerd pincet 1 pm en 3 pm kralen met zowel de omvang van de waargenomen Brownse fluctuaties en berekening van de roll-off frequentie verschillende posities magneet (figuur 2). In de kracht proteolyse experimenten de installatie is gelijk behalve dat het DNA wordt vervangen collageen (figuren 3, 4). De genormaliseerde aantal korrels nog worden uitgezet als functie van de tijd de Proteolyse percentages (figuur 5) te vinden, en dit proces kanherhaald voor verschillende enzymconcentraties en krachten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van de magnetische val kalibratie (niet op schaal). Twee permanente zeldzame aarde magneten zorgen voor een magnetisch veld dat trekt aan de superparamagnetische kraal. Het vertalen van de magneet op en neer past de uitgeoefende kracht. De kralen worden afgebeeld met behulp van een conventionele bright-field microscoop met het licht dat door een gaatje tussen de twee magneten Inzet:. Foto gemaakt met een 40x lucht doelstelling. De scherpe ronde punten overeen met de korrels aan het dekglaasje oppervlak. De out-of-focus objecten zijn vrijstaande kralen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Stukken de gekalibreerde kracht als functie van magneet afstand van het monster oppervlak van 1 mm (links) en 2,8 pm (rechts) beads. De gegevens werden bevestigd aan de empirische functie <img alt="Vergelijking4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Vergelijking4"> , Waarbij x de afstand van de magneet. A = 31,8, b = 5,61 en c = 4,39 voor 1 pm kralen en a = 140 b = 3,10 en c = 1,86 voor de 3 pm kralen. Deze waarden zijn specifiek voor onze specifieke instrument en experimentele geometrie en elk instrument moet individueel worden gekalibreerd. De foutmarges in elk punt vertegenwoordigen ~ 10% variabiliteit uitgeoefende kracht op een kraal naar hiel basis als gevolg van de variabiliteit in korrelgrootte. De toegepaste kracht is evenredig met de hoeveelheid van de korrels en de kraal volume varieert ~ 9% over het gemiddelde (volgens de specificaties). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Force proteolyse test setup (niet op schaal). Het collageen model trimeer is aan het oppervlak van het dekglaasje via myc / anti-myc conjugatie. De streptavidine gecoate parels superparamagnetische zijn aan het collageen trimeren via een biotine-streptavidine koppeling. Actief MMP-1 snijdt het collageen in de tijd, waardoor de kralen op los te maken van het oppervlak en af ​​te stappen van het brandvlak. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Schematische tekening van Proteolyse als functie van de tijd. De cartoon toont een voorbeeld gezichtsveld in de tijd als proteolyse optreedt. Na verloop van tijd, MMP-1 snijdt collageen en de kralen verwijderen en verder van het brandvlak onder invloed van het magnetische veld. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Proteolyse tarieven zijn afhankelijk van de toegepaste kracht 16. Getoond zijn gegevens verzameld bij 1,0 pN (3 uM MMP-1, zwart), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rood) en 13 pN (0,2 uM MMP-1; magenta). De tarieven van proteolyse (fit parameters) zijn: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 PN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 PN), en 2,08 ± 0,18 min -1 (13 PN). De fractie van kralen unproteolyzed op lange tijd de punten (&gt; 15 minuten) ongeveer constant blijft op ~ 0,25 in de verschillende experimenten. Error bars komen overeen met de Poisson statistieken als gevolg van het aantal waarnemingen op elk tijdstip. De fout op elk tijdstip van n korrels n 1/2. De fout in de fractie van de bijgevoegde kralen werd berekend door fout propagation.1 um kralen werden gebruikt voor de 1.0 en 6.2 pN pN experimenten en 2,8 micrometer kralen werden gebruikt voor 13 pN experimenten.

<ol><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li>
<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).</li>
<li>Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+structure+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin structure and wound healing.</a> J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).</li>
<li>Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Load+Induces+a+100-Fold+Increase+in+the+Rate+of+Collagen+Proteolysis+by+MMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).</li>
<li>Zareian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+collagen%2Fenzyme+mechanochemistry+in+native+tissue+with+dynamic%2C+enzyme-induced+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.</a> Langmuir. 26, (2010).</li>
<li>Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+bovine+pericardium+accelerates+enzymatic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation.</a> Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).</li>
<li>Jesudason, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+regulate+elastase+activity+and+binding+site+availability+in+lung+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin.</a> Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+determination+of+unbinding+force%2C+off+rate+and+energy+barrier+for+protein-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction.</a> Micron. 38, 446-461 (2007).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+short+collagen-like+triple+helices+by+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering.</a> J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).</li>
<li>Stetefeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stabilization+at+atomic+level%3A+crystal+structure+of+designed+%28GlyProPro%2910foldon%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon.</a> Structure. 11, 339-346 (2003).</li>
<li>Chung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+unwinds+triple-helical+collagen+prior+to+peptide+bond+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis.</a> EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).</li>
<li>Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+specific+adhesion+of+cells+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Models for the specific adhesion of cells to cells.</a> Science. 200, 618-627 (1978).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22, 292-299 (2006).</li>
<li>Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+ligand-receptor+complexes+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers.</a> Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoenzymatic+cleavage+of+the+ultralarge+vascular+protein+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor.</a> Science. 324, 1330-1334 (2009).</li>
<li>Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li>
<li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol beschrijft een nieuwe toepassing voor een klassieke single molecule techniek. Magnetisch pincet laten medium tot high-throughput enkel molecuul testen op een kosten-efficiënte manier. Echter, net als alle andere experimentele technieken zijn er uitdagingen en mogelijke valkuilen. Beperkingen van magnetische pincet In vergelijking met een optische val van de ruimtelijke en temporele resolutie van een MT apparaat is laag. Bovendien is de krachten opgewekt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Micro Dekglas # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro Dekglas # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligase </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcontroller Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenine </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc antilichaam </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Bovine serum albumine </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Streptavidine </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Streptavidine </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-acetaat Aminophenylmercuric </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotine-maleïmide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Biotine gelabelde oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Synthese op maat </td></tr><tr><td> Digoxigenine gelabelde oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Synthese op maat </td></tr><tr><td> Collageenpeptide gen </td><td> DNA-2.0 </td><td> Synthese op maat </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> Harvard Plasmide Database </td><td></td></tr><tr><td> z-translator </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Servo-controller voor vertaler </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed single-molecule force proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Het genereren en detectie van mechanische krachten is een alomtegenwoordig aspect van de cel fysiologie, met directe relevantie voor kanker metastase 1, 2 en atherogenese wondgenezing 3. In elk van deze voorbeelden cellen zowel uitoefenen van kracht op de omgeving en tegelijkertijd enzymatisch vorm van de extracellulaire matrix (ECM). Het effect van krachten op ECM is zo uitgegroeid tot een gebied van groot belang vanwege de mogelijke biologische en medische belang 4-7. Enkel molecuul technieken zoals optische trapping 8, atomic force microscopie 9, en magnetische pincet 10,11 kunnen de onderzoekers om de functie van enzymen op moleculair niveau door het uitoefenen van krachten op afzonderlijke eiwitten te onderzoeken. Van deze technieken, magnetische pincet (MT) zijn opmerkelijk vanwege hun lage kosten en hoge doorvoer. MT oefenen krachten in het bereik van 1-100 ~ pN en kunnen milliseconde temporele resolutiekwaliteiten die goed zijn voor de studie van enzym-mechanisme afgestemd op de single-molecule level 12. Hier rapporteren een zeer parallelizable MT assay het effect van kracht op de Proteolyse van een eiwitmoleculen bestuderen. Wij geven het specifieke voorbeeld van de Proteolyse van een trimere collageen peptide matrix metalloproteinase 1 (MMP-1), maar deze assay kan gemakkelijk worden aangepast aan andere substraten en proteasen bestuderen.

In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

De generatie en detectie van mechanische krachten is een alomtegenwoordig aspect van de celphysiologie, met directe relevantie voor kankermetastase1, atherogenese2 ...

Het algemene doel van deze procedure is om het effect van mechanische belasting op de proteolytische splitsing van individuele eiwitten op een hoogst parallelle en kosteneffectieve manier te bestuderen. In deze demonstratie wordt de splitsing van collageen door matrixmetalloproteïnase 1 onderzocht; in de eerste stap worden collageen-trimmers bevestigd aan het glazen dekglas van een flowcel, gevolgd door de bevestiging van magnetische kralen ter grootte van micrometers aan de individuele collageenmoleculen. De tweede stap bestaat uit het monteren van de flowcel in het magnetische pincet-apparaat en het controleren of aspecifiek gebonden kralen van het oppervlak van het dekglas zijn verwijderd.Vervolgens wordt het protease aan de flowcellen toegevoegd. De laatste stap is het bepalen van de proteolysesnelheid door de loslating van de beads in real-time te monitoren. Door de loslatingssnelheden van de beads te meten bij verschillende proteaseconcentraties en krachten, is het mogelijk om standaard zoölogische kinetische parameters af te leiden met behulp van minimale hoeveelheden substraat en protease.Bovendien biedt deze techniek unieke informatie over het effect van mechanische kracht op de snelheid van proteolyse en op de structurele veranderingen in het substraateiwit die gepaard gaan met klieving. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals optische T-sporen en atoomkrachtmicroscopie, is dat deze techniek een hoge doorvoer heeft en kosteneffectief is. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de effectieve kracht op de proteolytische klieving van enkelvoudige eiwitten, kunnen de instrumentatie en technieken worden toegepast op een breed scala aan biofysische vraagstukken, waaronder het effect van kracht op eiwitvouwing en -conformatie.Begin de voorbereiding van de flowcel door de dekglasjes te reinigen middels sonicatie. Plaats de dekglasjes in een klein glazen bakje dat groot genoeg is om ze te bevatten en dat in de sonicator past. Vul het bakje met isopropanol en soniceer gedurende 20 minuten in een sonicatiebad, verwijder vervolgens de isopropanol en spoel de dekglasjes grondig af met grote hoeveelheden gedeïoniseerd water.Vul de container met water en sonicize gedurende 20 minuten. Droog de dekglasjes na de sonicatie met een stroom gefilterde, stofvrije lucht. Inspecteer de dekglasjes en gebruik alleen die welke vrij zijn van vlekken.Vlam de dekglasjes voorzichtig enkele seconden lang om eventueel overgebleven stof en vocht te verwijderen door de dekglasjes door een gasvlam van een bunsenbrander te halen, waarbij u er op let dat het dekglasje niet vervormt door overmatige hitte. Deze stap verwijdert resterende oppervlakteverontreinigingen.Gebruik vervolgens dubbelzijdige plakband om de twee dekglasjes aan elkaar te bevestigen. Knip eerst het plakband in stukken van ongeveer drie centimeter lang en 0,3 centimeter breed en breng het plakband aan op een dekglasje van 22 bij 40 millimeter, waarbij in het midden een kanaal van 1,6 centimeter vrijblijft. Gebruik een pipetpunt om voorzichtig op het dekglasje te drukken, zodat het plakband goed is hecht.De magnetische pincetapparatuur is door dit laboratorium geconstrueerd met behulp van een aluminium L-beugel met een gaatje van één millimeter diameter en is gemonteerd op een verticale Z-translatortafel om de hoogte van de pincet te moduleren. Twee permanente neodymiummagneten werden aan de beugel bevestigd aan weerszijden van het gaatje om de gradiënt van het magnetische veld te creëren. Een correcte kalibratie van de magnetische val is essentieel voor deze procedure.Om succes te garanderen, gebruiken we twee verschillende methoden zoals beschreven in deze sectie. Gebruik voor de kalibratie van de magnetische val eerder geprepareerd DNA van de Lambda-faag, gelabeld aan de 5'- en 3'-uiteinden met biotine en doxygen, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Om het DNA aan de flowcel te hechten, vult u de flowcel eerst met een anti-D oxygen-antilichaamoplossing en laat u het antilichaam gedurende 15 minuten aan het glasoppervlak hechten.Breng vervolgens een BSA-oplossing aan in de flowcel om aspecifieke binding van DNA aan het oppervlak te voorkomen. Let op dat voor deze blokkeringsstap en alle daaropvolgende stappen het toegevoegde reagensvolume minstens tweemaal het volume van de flowcel moet zijn, wat in deze demonstratie 75 microliters is; incubeer de flowcel gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.Nadat deze stap is herhaald, voegt u 50 pico molar gefunctionaliseerd lambda DNA toe en laat u dit 15 minuten lang hechten aan het dekglas; was vervolgens het overtollige DNA weg met één keer XPBS. Voeg ten slotte streptavidine-gecoate superparamagnetische beads toe en laat deze 15 minuten lang hechten aan het geïmmobiliseerde DNA. In deze demonstratie worden 2.8 micrometer beads gebruikt.Was het overtollige aantal beads weg met één keer XPBS. Voer vervolgens de kalibratie van de magnetische pincetten uit door de permanente magneten naar een positie te verplaatsen die ver verwijderd is van het sample-oppervlak. Plaats daarna de voorbereide flowcel in de microscoop.Plaats de permanente magneten in positie boven de flowcel. Kies het brandvlak van de gefunctionaliseerde Lambda DNA-beads door scherp te stellen op de beads, weg van beide glazen oppervlakken. Het juiste brandvlak is dat waarin de gewenste beads een helder centrum hebben.Maak een video van de beweging van de kralen met een frequentie van meer dan 80 hertz gedurende 500 frames. Verplaats de magneet dichter naar het sample-oppervlak en neem bij elke positie een video van de beweging van de kralen op. Voor afstanden groter dan 5 mm dient dit in stappen van 1 mm te gebeuren voor afstanden tussen 1 en 5 mm.Verplaats in stappen van 0,5 millimeter voor afstanden kleiner dan één millimeter, en in stappen van 0,25 millimeter. Volg voor elke dataset het centrum van de kraaltjes met behulp van een 2D Gaussische fit. Bereken de kracht via brownse fluctuaties zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Bevestig de nauwkeurigheid van de krachten door de krachtberekening te controleren via een power spectrum lineaire fit.Om de afragefrequentie te bepalen, kan de relatie tussen de uitgeoefende kracht en de afragefrequentie worden gevonden in de tekst voorafgaand aan de bevestiging van het collageenpeptide aan de flowcellen; expressie en zuivering van het collageenpeptide en de MMP-1-eiwitten. Begin met het toevoegen van de anti-Myc-antilichaamoplossing aan de flowcel en incubeer dit gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de anti-Myc aan het oppervlak van de flowcel te laten hechten. Blokkeer de flowcel om aspecifieke binding van eiwitten te voorkomen met 5 mg/mL BSA. Voeg 150 pM collageenpeptide toe en laat dit gedurende 45 minuten via de Myc-tag aan het antilichaam hechten.Was het overtollige collageen weg met PBS-buffer voordat de 2,8 micrometer kralen aan de flowcel worden toegevoegd. Deze moeten met sterke magneten worden gescheiden van het strep-divid en de gecoate kraalensuspensie, en vervolgens worden geresuspendeerd in PBS. Dit proces dient drie keer te worden herhaald.Deze stap is essentieel om de 2,8 micrometer kralen te laten binden aan het op het oppervlak geïmmobiliseerde collageenpeptide. Voeg vervolgens strep divid streptavidine-gecoate superparamagnetische kralen toe en laat deze gedurende 45 minuten hechten aan de collageenmoleculen. Zodra de flowcel is geassembleerd met collageenpeptide en magnetische kralen, wordt de flowcel in de magnetische val afgebeeld.Bij een lage kracht is een subpopulatie van de kraaltjes soms zwak en aspecifiek aan het oppervlak gehecht. Het toepassen van een gematigde kracht zorgt ervoor dat deze kraaltjes worden losgemaakt. Voeg het geactiveerde enzym toe aan de flowcel.In dit geval werd MMP1 vooraf geactiveerd door toevoeging van 3,5 mM PMA en drie uur lang geïncubeerd bij 37 °C. Zodra een flowcel opnieuw in het magnetische pincetapparaat wordt geplaatst, wordt een video opgenomen over een aantal gezichtsvelden, wat doorgaans resulteert in enkele honderden gehechte beads. Deze meting komt overeen met tijd gelijk aan nul.Herhaal hetzelfde proces van het vastleggen van verschillende gezichtsvelden op regelmatige tijdstippen totdat alle beads loslaten of er geen verdere proteolyse meer waarneembaar is. De magnetische pincetten werden gekalibreerd voor beads van 1 µm en 2,8 µm. Door gebruik te maken van zowel de amplitude van de waargenomen brownse fluctuaties als de berekening van de roll-off frequentie bij variërende magneetposities in de geforceerde proteolyse-experimenten, kan het genormaliseerde aantal overgebleven beads worden uitgezet als functie van de tijd om de proteolyse-snelheid te bepalen.Dit proces kan worden herhaald voor verschillende enzymconcentraties en krachten. Proteolysesnelheden zijn afhankelijk van de uitgeoefende kracht. De proteolysesnelheden werden bepaald bij 1 pN, 6,2 pN en 13 pN.Het fractie aandeel ongebonden kralen bij meer dan 15 minuten blijft in verschillende experimenten ongeveer constant op 0,25. In ons geval stelde de assay ons in staat om de katalytische efficiëntie van MMP1 te meten als functie van de uitgeoefende kracht. Door de gegevens te analyseren, ontdekten we dat de collageen triple helix lokaal moet ontwinden voorafgaand aan de proteolyse.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze correct worden uitgevoerd in vijf tot zes uur. Het is belangrijk om te onthouden dat er ten minste 30 tot 50 beads per gezichtsveld nodig zijn om een goede statistische significantie van uw gegevens te verkrijgen. Vergeet niet dat PMA extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, laboratoriumjassen en mondkapjes altijd moeten worden getroffen bij het uitvoeren van dit experiment.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de invloed van kracht op de proteolytische splitsing van enkelvoudige eiwitten kan worden gemeten met behulp van magnetische pincetten. Magnetische pincetten zijn een uitstekend instrument voor het begrijpen van biofysische experimenten met enkelvoudige moleculen. Deze techniek kan worden uitgebreid naar andere combinaties van proteasen en substraten.Daarnaast kunnen soortgelijke technieken worden gebruikt om de structurele dynamiek van eiwitten te begrijpen, evenals om andere eiwitten te bestuderen die RNA en/of DNA binden of modificeren.

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Magnetische pincet, een krachtige single-molecule manipulatie techniek kan worden aangepast voor de directe metingen van de twist (met een configuratie genoemd vrij-baan magnetische pincet) en koppel (met een configuratie genoemd magnetisch koppelpincet) in biologische macromoleculen. Richtlijnen voor het uitvoeren van dergelijke metingen worden gegeven, met inbegrip van toepassingen aan de studie van DNA en bijbehorende nucleo-eiwit filamenten.

Magnetische pincet voor het meten van Twist en Torque

Een single-molecuul magnetische pincet platform te manipuleren van de G-quadruplexes is gemeld, waardoor voor de studie van G4 stabiliteit en verordening door verschillende eiwitten.

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Een zeer parallelle methode voor het meten van het site-specifieke decolleté van DNA op het niveau van één molecuul wordt beschreven. Dit protocol toont de techniek met behulp van de beperking endonuclease NdeI. De methode kan eenvoudig worden aangepast om elk proces dat resulteert in site-specifieke DNA-decolleté te bestuderen.

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

Dit protocol demonstreert het gebruik van een magnetisch pincet met één molecuul om interacties te bestuderen tussen telomere DNA-bindende eiwitten (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] en TRF2) en lange telomeren die uit menselijke cellen worden geëxtraheerd. Het beschrijft de voorbereidende stappen voor telomeren en telomere repeat-bindingsfactoren, de uitvoering van experimenten met één molecuul en de methoden voor gegevensverzameling en -analyse.

Analyse van telomere eiwit-DNA-interacties met behulp van een magnetisch pincet met één molecuul

Wordt het gebruik van een constante kracht axiaal optische pincetten om de mechanische eigenschappen van korte DNA moleculen te verkennen. Door stretching DNA axiaal, minimaliseren we sterische hindernissen en artefacten die in conventionele laterale manipulatie, waardoor we DNA-moleculen te bestuderen zo kort ~ 100 nm.

Stretching korte sequenties van DNA met Constant Force Axiale optisch pincet

Een methode om de persistentielengte of buigstijfheid van biopolymeren meten beschreven. De methode gebruikt een kinesine aangedreven microtubule gliding assay experimenteel bepalen de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar aan actine gebaseerde assays glijden.

Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Leer multiplexed single-molecule force proteolyse metingen met magnetische pincetten voor biochemisch onderzoek. Deze methode onderzoekt mechanische belasting op enzymatische activiteit van matrix metalloproteinase op collageen.

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

Meer video's verkennen