Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet
July 25th, 2012
In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.
Het algemene doel van deze procedure is om het effect van mechanische belasting op de proteolytische splitsing van enkele eiwitten op een zeer parallelle en kosteneffectieve manier te bestuderen. In deze demonstratie wordt in de eerste stap de splitsing van collageen door matrix metalloproteïnase één onderzocht, collageen trimmers worden aangebracht op de glazen deksel van een flowcel, gevolgd door de bevestiging van magnetische kralen van micrometergrootte aan de individuele collageenmoleculen. De tweede stap is om de flowcel in het magnetische pincetapparaat te monteren en te controleren of niet-specifiek bevestigde kralen van het oppervlak van het deksel zijn verwijderd.
Vervolgens wordt het protease toegevoegd aan de flowcellen. De laatste stap is om de proteolysesnelheid te bepalen door de loslating van de kralen in realtime te volgen. Door de loslatingssnelheid van de kralen te meten bij verschillende proteaseconcentraties en krachten, is het mogelijk om standaard zoölogische kinetiekparameters af te leiden met behulp van minimale hoeveelheden substraat en protease.
Bovendien biedt deze techniek unieke informatie over het effect van mechanische kracht op de snelheid van proteolyse en op de structurele veranderingen in het substraateiwit die gepaard gaan met splitsing. Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met andere methoden zoals optische T-traces en atoomkrachtmicroscopie, is dat deze techniek hoog doorvoerend en kosteneffectief is. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de effectieve kracht op de proteolytische splitsing van enkele eiwitten, kunnen de instrumentatie en technieken worden toegepast op een breed scala aan biofysische problemen, waaronder het effect van kracht op eiwitvouwing en bevestiging.
Begin met de voorbereiding van de flowcel door deksels schoon te maken met behulp van sonicatie. Voeg de deksels toe aan een kleine glazen container die ze kan bevatten en die in de ator past. Vul de container met isopropanol en soniceer in een bad ator gedurende 20 minuten de isopropanol en spoel de deksels met overvloedige hoeveelheden gedeïoniseerd water.
Vul de container met water en soniceer gedurende 20 minuten. Na het soniceren droogt u de deksels in een stroom gefilterde stofvrije lucht. Inspecteer de deksels en gebruik alleen degenen die vrij zijn van vegen.
Ontvet de deksels voor een paar seconden door ze voorzichtig in een gasvlam te houden die door een bunsenbrander wordt geproduceerd, zorg ervoor dat de deksels niet vervormen door overmatige hitte. Deze stap verwijdert resterende oppervlakteverontreinigingen.
Gebruik vervolgens dubbelzijdig scotchtape om de twee deksels aan elkaar te bevestigen. Door de tape eerst ongeveer drie centimeter lang en 0,3 centimeter breed te snijden, bevestigt u de tape aan een 22 bij 40 millimeter deksel, waarbij een kanaal van 1,6 centimeter in het midden wordt achtergelaten. Gebruik een pipettentip om voorzichtig op het deksel te drukken om ervoor te zorgen dat de tape goed is gehecht.
Het magnetische pincetapparaat werd door dit lab geconstrueerd met behulp van een aluminium L-beugel met een pinachtige opening van één millimeter en gemonteerd op een verticale Z-translator om de hoogte van de pincet te moduleren. Twee permanente zeldzame aardmagneten werden aan de beugel aan beide zijden van de pinachtige opening bevestigd om het magnetische veldgradiënt te creëren. Een juiste kalibratie van de magnetische val is essentieel voor deze procedure.
Om succes te garanderen, gebruiken we twee verschillende methoden zoals beschreven in deze sectie. Om de magnetische val te kalibreren Gebruik voor de kalibratie eerder bereid DNA van Lambda-fagen gelabeld aan de vijf prime en drie prime-einden met biotine en doxygen zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Om het DNA aan de flowcel te bevestigen, vult u eerst de flowcel met anti-D zuurstof en antilichaamoplossing en laat u het antilichaam gedurende 15 minuten aan het glazen oppervlak hechten.
Vervolgens wordt het oppervlak van de flowcel behandeld om niet-specifiek binden van DNA te voorkomen door een BSA-oplossing aan de flowcel toe te voegen. Merk op dat voor deze actiestap en alle volgende stappen, het toegevoegde reagensvolume aan de flowcel minstens tweemaal moet zijn. Het volume van de flowcel, dat in deze demonstratie 75 microliter is, incubeert de flowcel gedurende 45 minuten op kamertemperatuur.
Nadat u deze stap hebt herhaald, voegt u 50 picomol functioneel lambda DNA toe en laat het 15 minuten aan het deksel hechten, wast u overtollig DNA weg met een XPBS. Ten slotte voegt u streptavidine gecoate superparamagnetische kralen toe en laat u ze 15 minuten aan het geïmmobiliseerde DNA hechten. In deze demonstratie worden kralen van 2,8 micrometer gebruikt.
Was overtollige kralen weg met een XPBS. Voer vervolgens magnetische pincetkalibratie uit door de permanente magneten naar een positie te verplaatsen die ver van het monsteroppervlak is. Plaats vervolgens de voorbereide flowcel in de microscoop.
Verplaats de permanente magneten in positie boven de flowcel. Kies het brandvlak van Lambda DNA functioneel beladen kralen door te focussen op de kralen weg van beide glazen oppervlakken. Het juiste brandvlak is een waarin de gewenste kralen een helder centrum hebben.
Neem een video van de beweging van de kralen met 80 hertz of hoger voor 500 frames. Verplaats de magneet dichter bij het monsteroppervlak en neem een video op van de beweging van de kralen op elke positie. Voor afstanden groter dan vijf millimeter, verplaats in stappen van één millimeter voor afstanden tussen één en vijf millimeter.
Verplaats in stappen van 0,5 millimeter voor afstanden kleiner dan één millimeter, verplaats in stappen van 0,25 millimeter Voor elke dataset volgt u het centrum van de kralen met behulp van een 2D Gaussische fit. Bereken de kracht via Browniaanse fluctuaties zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Bevestig de nauwkeurigheid van de krachten door de krachtberekening te controleren via een vermogensspectrum Lian-fit.
Om de afvalfrequentie te vinden, kan de relatie tussen toegepaste kracht en afvalfrequentie worden gevonden in de tekst vóór de collageenpeptidebinding aan de flowcellen, druk het collageenpeptide en MMP één eiwitten uit en zuiver. Begin met het toevoegen van de anti mic antilichaamop
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft het gebruik van magnetische pincetten om de invloed van mechanische belasting op enzymatische proteolyse op het niveau van enkele moleculen te onderzoeken. De studie richt zich op de splitsing van collageen door matrix metalloproteïnase op een zeer parallelle en kosteneffectieve manier.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Biofysica
- Proteomics
Achtergrond
- Proteolyse is een kritiek biologisch proces.
- Het begrijpen van de effecten van mechanische krachten op proteolyse kan inzicht geven in verschillende biologische functies.
- Magnetische pincetten maken nauwkeurige manipulatie en meting op het niveau van enkele moleculen mogelijk.
- Deze methode kan worden toegepast om verschillende eiwitten en enzymen te bestuderen.
Doel van de studie
- Om het effect van mechanische belasting op de proteolytische splitsing van enkele eiwitten te onderzoeken.
- Om standaard zoölogische kinetische parameters af te leiden met minimale hoeveelheden substraat en protease.
- Om het begrip van enzymatische activiteit onder kracht te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bevestiging van collageen trimmers aan een glazen dekglas in een flow cell.
- Gebruik van micrometergrote magnetische kralen bevestigd aan individuele collageenmoleculen.
- Montage van de flow cell in een magnetische pincetapparaat.
- Real-time monitoring van kraalontkoppeling om proteolysesnelheden te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bevestiging van collageen en magnetische kralen voor observatie.
- Real-time monitoring maakte de bepaling van proteolysesnelheden mogelijk.
- Variatie in proteaseconcentraties en krachten leverde waardevolle kinetische gegevens op.
- Inzichten in de relatie tussen mechanische belasting en enzymatische activiteit werden verkregen.
Conclusies
- De studie toont de effectiviteit van magnetische pincetten in proteolyseonderzoek aan.
- Mechanische krachten hebben significante invloed op enzymatische activiteit op het niveau van enkele moleculen.
- Deze methode kan in de toekomst worden toegepast op andere proteolytische studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Measuring force-dependent proteolysis at the single-molecule level enables mechanistic de-risking of protease targets by revealing how mechanical microenvironment influences catalytic efficiency. This approach supports target validation in fibrosis, cancer metastasis, and atherogenesis where extracellular matrix remodeling under load is pathophysiologically relevant. The magnetic tweezers assay provides quantitative, reproducible kinetic data using minimal reagent, informing go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying how mechanical force alters protease-substrate kinetics, de-risking targets implicated in force-sensitive pathologies.
- Operational Value: Enables parallel measurement of dozens of single-molecule events, increasing statistical power while minimizing protease and substrate consumption.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-proteolysis rate curves that serve as quantitative, mechanism-based readouts for protease inhibitor screening under physiologically relevant mechanical conditions.
- Operational Value: Adaptable to diverse protease-substrate pairs, allowing reuse of the magnetic tweezers platform across target families without major reengineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges molecular mechanism to tissue-level phenotypes by linking extracellular matrix proteolysis rates to cellular traction forces in disease-relevant microenvironments.
- Operational Value: Supports preclinical model selection by identifying protease targets whose activity is significantly modulated by biomechanical cues present in fibrotic or tumor stroma.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic insights that inform assay design and compound screening cascades.
- Discovery Biology: Tests how force influences proteolytic cleavage, clarifying whether target engagement depends on microenvironmental mechanics.
- Screening: Delivers kinetic parameters (e.g., catalytic efficiency) under defined force, enabling structure-activity relationship studies that account for biophysical context.
- Analytics: Outputs time-resolved bead detachment data, facilitating calculation of proteolysis rates and force-dependent Michaelis-Menten parameters.
- Translational Research: Connects single-molecule proteolysis dynamics to tissue remodeling processes only when supported by correlative force measurements in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, cost-effective force spectroscopy capability applicable to multiple protease targets across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing force-dependent conformational changes in substrate preceding cleavage, increasing confidence in target mechanism of action.
- Operational Value: Delivers high-throughput, reproducible single-molecule measurements with low reagent cost, improving assay efficiency.
- Strategic Value: Informs prioritization of protease targets by quantifying how biomechanical variables affect hit translation from biochemical to cellular assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets whose activity is robust versus sensitive to mechanical noise in vivo.
Implementation Considerations
- Expertise in single-molecule biophysics, magnetic tweezers operation, and protein surface chemistry.
- Instrumentation for force calibration, video tracking, and flow cell assembly with precise flow control.
- Standardization of bead immobilization, force calibration protocols, and data analysis pipelines across teams.
- Adaptation considerations for varying substrate size, charge, and linkage chemistry to magnetic beads.
- Practical limitations include force range (~1-100 pN) and requirement for tethered, soluble protein substrates amenable to surface attachment.
