Intracellulaire hervouwing Assay

Het algemene doel van het volgende experiment is om de chaperone-afhankelijke intracellulaire eiwitherfolding na een hitteshock te meten. Gebruik een luciferase-reporter om de cellen eerst te transfecteren met plasmiden die het luciferase-reportergen en de chaperone van belang bevatten. Verdeel vervolgens de getransfecteerde cellen over de verschillende herstelmomenten in het experimentele ontwerp.

Verwarm de cellen de volgende dag aan een hittepuls om eiwitontvouwing te induceren. Laat de cellen herstellen om de intracellulaire eiwitvouwing te herstellen en meet vervolgens de luciferase-reporteractiviteit. De resultaten meten de tijdsafhankelijke en chaperone-afhankelijke eiwithervouwing op basis van de luciferase-assay.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de in vitro refolding-assay, is de mogelijkheid om een fysiologische readout te verkrijgen van het effect van verbindingen of eiwitten op de chaperone-activiteit. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van een breed scala aan ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekten of kanker, aangezien chaperones een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van deze pathologieën. Warm eerst het kweekmedium, PBS en trypsine voor tot 37 °C in een waterbad.

Was een confluente cultuur van HEK 2 93 cellen met vijf milliliter PBS. Breng vervolgens één milliliter trypsine met 0,025% EDTA aan, roteer de plaat voorzichtig voor een gelijkmatige verdeling van de trypsine en incubeer bij 37 °C. Schud de plaat periodiek om de loslating van de cellen te controleren.

Resuspendeer de cellen nu in 10 milliliters volledig DMEM-medium en breng ze over naar een 50 milliliter falcon-buis. Tel vervolgens de cellen met een Beckman-teller. Zaai de cellen uit bij een confluentie van ongeveer 60 tot 70% en incubeer deze gedurende zes tot acht uur.

Breng het extreme gene, nine-reagens naar kamertemperatuur en de aliquot serumvrij medium naar 37 °C. Pipetteer het serumvrije medium in twee einor-buisjes. Voeg vervolgens het extreme gene nine-reagens toe zonder de wand van het einor-buisje te raken en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Bereid ondertussen de 2D NA-transfectiemengsels voor in buis één; voeg ran vanilla firefly en een lege vectorcontrole toe in buis twee. Voeg de ran vanilla firefly en de moleculaire chaperone toe. Voeg het DNA toe aan het mengsel van transfectiereagens, vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg dit mengsel vervolgens toe aan de geplaatste cellen en incubeer gedurende 24 uur. Oogst de getransfecteerde cellen met trypsine; zaai cellen uit bij een confluentie van 60 tot 70% in zeswelplaten en laat deze een nacht in de incubator staan. Aspireer het medium van de getransfecteerde cellen.

Voeg vervolgens één milliliter hittechokbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten. Om de de novo eiwitsynthese te stoppen, worden de deksels afgesloten met parafilmstrips en worden de cellen 30 minuten geïncubeerd in een waterbad van 45 °C. Verwijder nu de parafilm en plaats de cellen terug in de incubator voor herstel op de gespecificeerde tijdstippen.

Oogst de cellen en was deze eenmaal in PBS. Voor een efficiënte cellyse wordt het celpellet snel ingevroren (snap-freeze) in vloeibare stikstof, waarna 200 microliters verdunde passieve lysisbuffer wordt toegevoegd. Verdeel dit vervolgens in triplicaten: 30 microliters van het cellysaat per putje van een 96-wells plaat.

Om de transfectie-efficiëntie te evalueren, begint u met de niet-gechoqueerde referentiemonsters. Bereid voor het meten van de ran luciferase-activiteit verse 0,2 millimolar Lucifer in gly Gly buffer reactiebuffer voor, die 1 millimolar ATP en 0,2 micromolar ezine reactiebuffer bevat. Plaats de 96-wellsplaat in de luminometer en start het programma.

Wallach 1420 werkstation. Plaats pomp één in de Falcon-buis met 0,2 micromolar ezine reactiebuffer. Selecteer in het menu de optie dispenseronderhoud en vink pomp één aan.

Selecteer de optie vullen om de plaatindeling te bewerken. Kies de optie, bekijk het protocol en de resultaten in het menu. Selecteer het protocol.

Select nu de wells die moeten worden uitgelezen. Ga terug naar de Wallach-manager en klik op start om de emissies van de monsters te meten. Ga bij 482 nanometers naar het dispenseronderhoud en selecteer 'empty and pump one' om alle resterende oplossing terug in de buis te pompen.

Verplaats nu de buis naar een Falcon-buis met water en tik deze aan om door te spoelen. Ga verder door 'empty' (leeg) te selecteren. Plaats vervolgens de buis van pomp één in de reactiebuffer en de buis van pomp twee in de LUCIFERIAN-oplossing.

Pas de plaatindeling aan. Selecteer 'vullen' voor pomp één en pomp twee. Selecteer vanuit het onderhoudsmenu van de dispenser het protocol en start de meting van de vuurvlieg-luciferasereactie bij een golflengte van 560 nanometers.

Herhaal aan het einde van de herhaling de procedure: legen, doorspoelen, legen. Bekijk voor pomp één en pomp twee de resultaten in de Wallach 1420 Explorer. Elk experiment is gekoppeld aan een assay.

Voer de gebruikersnaam, de begin- en einddatum in en exporteer de resultaten als een Excel-bestand. Voor de analyse is de eiwitvouwing direct gerelateerd aan de hersteltijd. In dit experiment worden cellen op verschillende tijdstippen na een hittestress geëvalueerd.

In afwezigheid en aanwezigheid van het moleculaire chaperone. Zoals verwacht neemt het percentage herbouwde luciferase toe bij een langere hersteltijd in zowel de controles als in de cellen die zijn getransfecteerd met het moleculaire chaperone. Daarentegen vertoont een ongeldige dataset slechte R-kwadraatwaarden voor de correlatie tussen tijd en herbouw.

Na deze techniek kunnen andere methoden, zoals de in vitro TPA-assay, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de inhibitie van de enzymatische activiteit van het chaperone. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het meten van intracellulaire eiwitten na een hitte-shock.