Intracellulaire hervouwing Assay
24 januari 2012
In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om chaperon-afhankelijk intracellulair eiwit te meten, hervouwen na hitteschok. Gebruik een luciferase reporter om eerst cellen te transfecteren met plasmiden die het luciferase reportergen en het chaperon van belang omhullen. Verdeel vervolgens de getransfecteerde cellen voor hersteltijdstippen in het experimentele ontwerp.
De volgende dag, schok de cellen thermisch om eiwit ontvouwen te induceren. Laat herstel plaatsvinden om intracellulair eiwit opnieuw te vouwen en meet vervolgens de luciferase reporter activiteit. De resultaten meten tijdsafhankelijk en chaperon-afhankelijk eiwit hervouwen op basis van de luciferase assay.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals in vitro hervouwen assay, is de mogelijkheid van een meer fysiologisch resultaat van het effect van verbindingen of eiwitten op de chaperon activiteit. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een therapie voor een breed scala aan ziekten zoals neurodegeneratieve ziekten of kanker omdat chaperonen een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van deze pathologieën. Verwarm eerst het kweekmedium, PBS en trypsine voor tot 37 graden Celsius in een waterbad.
Was een confluente cultuur van HEK 2 93 cellen met vijf milliliter PBS. Breng vervolgens een milliliter trypsine met 0,025% EDTA aan, draai de plaat voorzichtig om voor gelijkmatige verdeling van de trypsine en incubeer bij 37 graden Celsius. Schud periodiek de plaat om celdetachering te verifiëren.
Suspensieer nu de cellen in 10 milliliter compleet DMEM medium en breng over naar een 50 milliliter falcon buis. Tel vervolgens cellen met behulp van een Beckman counter plate. De cellen zijn ongeveer 60 tot 70% confluent en incubeer gedurende zes tot acht uur.
Breng het extreme gen, negen reagens naar kamertemperatuur en de aliquot van serumvrij medium naar 37 graden Celsius. Pipetteer het serumvrije medium in twee einor buizen. Voeg vervolgens het extreme gen negen reagens toe zonder de einor buiswand aan te raken en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Bereid ondertussen de 2D NA transfectiemixen voor in buis een, voeg ran vanilla firefly en een lege vectorcontrole toe in buis twee. Voeg de ran vanilla firefly en de moleculaire chaperon toe. Voeg het DNA toe aan de transfectiereagens mix, vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Voeg deze mix verder toe aan de beplate cellen en incubeer gedurende 24 uur. Oogst de getransfecteerde cellen met behulp van trypsine, zaai cellen bij 60 tot 70% confluency in zes welborden en laat ze overnacht in de incubator staan. Aspirateer het medium van de getransfecteerde cellen.
Voeg vervolgens een milliliter hitteschok buffer toe en incubeer gedurende 30 minuten. Om Denovo eiwitsynthese te stoppen, sluit de deksels af met paraform strips en incubeer gedurende 30 minuten in een 45 graden Celsius waterbad. Verwijder nu de paraform en plaats de cellen terug in de incubator voor herstel bij opgegeven tijdstippen.
Oogst de cellen en was één keer in PBS Voor een efficiënte cel lysis, bevries het cellysaatje in vloeibare stikstof, voeg 200 microliter verdunde passieve lysis buffer toe. Verdeel nu in drievoudig. 30 microliter van het cellysaat per putje van een 96 well plaat.
Om de transfectie-efficiëntie te evalueren, begin met de niet geschokken referentiemonsters. Om ran luciferase activiteit te meten, bereid verse 0,2 millimolair Luciferin Gly Gly buffer reactiebuffer voor met één millimolair ATP en 0,2 micromolair ezine reactiebuffer. Plaats de 96 well plaat in de luminometer en start het programma.
Wallach 1420 werkstation. Breng pomp een in de Falcon buis met 0,2 micromolair ezine reactiebuffer. Kies uit het menu de optie dispenser onderhoud en vink pomp een aan.
Selecteer de optie vul om het plaatlay-out te bewerken. Kies de optie, protocol en resultaten onderzoeken in het menu. Selecteer het protocol.
Selecteer nu de putjes die gelezen moeten worden. Ga terug naar Wallach manager en klik op starten om monstersemissies te meten. Bij 482 nanometer, ga naar dispenser onderhoud en selecteer leeg en pomp een om alle resterende oplossing terug in de buis te brengen.
Verplaats nu de buis naar een Falcon met water en vink aan, spoel. Ga verder met leeg te selecteren. Plaats vervolgens de buis van pomp een in de reactiebuffer en de buis van pomp twee in de LUCIFERIAN oplossing.
Verander de plaatlay-out. Selecteer vul voor pomp een en pomp twee. Selecteer uit het dispenser onderhoud menu het protocol en start met het meten van de firefly luciferase reactie golflengte van 560 nanometer.
Aan het einde van de herhaling, herhaal de procedure, leeg, spoel, leeg. Voor pomp een en pomp twee, bekijk de resultaten in de Wallach 1420 Explorer. Elk experiment is gekoppeld aan een assay.
Nummer gebruikersnaam begin en einddatum exporteer resultaten als Excel bestand. Voor analyse is eiwit hervouwen direct gerelateerd aan de hersteltijd. In dit experiment worden cellen op verschillende tijdstippen na hitteschok geëvalueerd.
In afwezigheid en in aanwezigheid van moleculaire chaperon. Zoals verwacht, neemt het percentage hervouwen luciferase toe met verlengde hersteltijd in zowel controles als cellen getransfecteerd met de moleculaire chaperon. Daarentegen geeft een ongeldige dataset slechte R vierkant waarden voor correlatie tussen tijd en hervouwen.
Volgens deze techniek kunnen andere methoden zoals in vitro TPAs assay worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden zoals inhibitie van de enzymatische activiteit van het chaperon. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intracellulair eiwit meet. We volgen na hitteschok.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om intracellulair eiwit hervouwen na hitteschok te meten, met focus op de rol van moleculaire chaperones. Firefly luciferase activiteit dient als reporter voor het beoordelen van de chaperone hervouwen activiteit.
Belangrijke Studie Componenten
Gebieden van Wetenschap
- Celbiologie
- Eiwit Vouwen
- Moleculaire Chaperones
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwit hervouwen is cruciaal voor cellulaire functie.
- Hitteschok kan leiden tot eiwit ontvouwen, waardoor hervouwen mechanismen noodzakelijk zijn.
- Moleculaire chaperones assisteren in het hervouwen proces.
- Luciferase assays bieden een kwantitatief maat voor hervouwen activiteit.
Doel van Studie
- Om chaperone-afhankelijke intracellulair eiwit hervouwen te meten.
- Om de effecten van hitteschok op eiwit structuur te onderzoeken.
- Om luciferase als reporter te gebruiken voor het beoordelen van chaperone activiteit.
Gebruikte Methoden
- Transfectie van cellen met plasmiden bevattende luciferase en chaperone genen.
- Herstel tijdstippen vastgesteld na transfectie.
- Inductie van hitteschok om eiwit ontvouwen te bevorderen.
- Meting van luciferase activiteit om hervouwen efficiëntie te beoordelen.
Belangrijkste Resultaten
- Tijdsafhankelijke hervouwen van eiwitten werd waargenomen.
- Chaperone activiteit werd bevestigd door middel van luciferase assays.
- Resultaten duiden op de effectiviteit van chaperones in eiwit herstel.
- Data ondersteunt de rol van moleculaire chaperones in cellulaire stress responsen.
Conclusies
- De methode meet effectief eiwit hervouwen na hitteschok.
- Luciferase assays zijn een betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chaperone activiteit.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van eiwit homeostase in cellen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This intracellular refolding assay provides a cell-based readout for measuring molecular chaperone activity, enabling target validation in protein homeostasis pathways. By linking chaperone function to luciferase refolding, it supports mechanistic de-risking in oncology and neurodegeneration drug discovery. The assay facilitates compound screening for modulators of chaperone activity, informing lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chaperone-dependent protein refolding as a therapeutic hypothesis in stress response pathways.
- Operational Value: Provides a quantitative, luciferase-based readout for assessing chaperone function in live cells.
- Predictive Value: Supports target confidence by measuring compound effects on intracellular refolding activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds that inhibit or stimulate chaperone-mediated refolding.
- Operational Value: Uses a normalized dual-luciferase system (firefly/renilla) to control for transfection efficiency and variability.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chaperone involvement in cancer chemoresistance and neurodegeneration, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges target validation to functional assessment of chaperone activity in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on compound effects on proteostasis mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modulators of protein folding networks.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about chaperone function in intracellular refolding after heat shock-induced protein unfolding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides time-dependent and chaperone-dependent refolding metrics for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical models where chaperones influence disease progression in cancer and neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing chaperone modulators across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures target engagement through functional refolding output, reducing mechanistic ambiguity in chaperone modulation.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using defined transfection and recovery protocols for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by identifying compounds with desired effects on proteostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of chaperone-targeted candidates in oncology and CNS therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection and luciferase reporter assays.
- Dependent on luminometer compatibility for dual-wavelength luciferase detection.
- Necessitates standardized heat shock and recovery conditions across experimental batches.
- Adaptation to other chaperone-client pairs may require validation of refolding dependence.
- Limited to soluble, refoldable protein reporters like luciferase; not suitable for aggregation-prone clients without modification.
