Name: Intracellulaire hervouwing Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer een luciferase-gebaseerde methode om chaperon-afhankelijke intracellulaire eiwit-hervouwing na warmteschok te meten in HEK293-cellen. Deze techniek biedt een fysiologische read-out voor chaperon-activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Danilo Maddalo is een ontvanger van een onderzoeks-fellowship als Young Investigator Group (Yig) van het Karlsruhe Institute of Technology.

1. Zaaien van de cellen <ol><li> Voordat u begint, warm-up de cultuur medium, de PBS 1X en de trypsine in een waterbad bij 37 ˚ C </li><li> Neem de cellen uit de incubator en zuig het medium. </li><li> Voorzichtig toe te passen 5 ml PBS 1X op de cellen om ze te wassen. </li><li> Zuig het PBS 1X en breng 1 ml trypsine bevat 0,025% EDTA. </li><li> Voorzichtig draaien de plaat een gelijkmatige verdeling van het trypsine te hebben. </li><li> Plaats de cellen in de incubator bij 37 ˚ C gedurende 5-10 minuten (afhankelijk van het celtype). Van tijd tot tijd te controleren of cellen worden losgemaakt door schudden van de plaat. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10-20 ml medium en verzamel ze in een 50 ml Falcon buis. </li><li> Tel de cellen met behulp van een Beekman teller. Het aantal cellen moet voldoende zijn om een ​​samenloop van ongeveer 60-70% te garanderen. </li><li> Het bord van de cellen en laat ze zaad voor 6-8 uur. </li></ol> 2. TransFection <ol><li> Voorafgaand aan transfectie, warm-up een portie van serum-vrij medium in een waterbad van 37 ˚ C. </li><li> Breng de X-treme Gene 9 tot kamertemperatuur. </li><li> Pipet het serum vrij medium in 2 eppendorf tubes (1 tube = 1 transfectie). </li><li> Pipet de X-treme Gene 9 in het serum vrij medium opletten dat de tip niet de plastic wand van de Eppendorf en incubeer gevoel voor 5 minuten. In de tussentijd bereiden twee DNA-mixen: in de ene buis mix samen de plasmiden voor renilla, vuurvlieg en een lege vector controle, in een andere buis renilla, vuurvlieg en de moleculaire chaperonne. </li><li> Voeg de DNA-mix om elk eppendorf serum bevat dat vrij medium + X-treme Gene 9, vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg druppelsgewijs elke mix op elk bord en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 </li></ol> 3. Het splitsen van de cellen <ol><li> 24 uur na transfectie, trypsinize de cellen, zoals beschreven in 1,4 tot 1,6 en verdun ze tot een definitieve confluentie van 60-70% in een 6-wells plaat. </li><li> Bereid een plaat voor de niet-geschokt-controle en evenveel platen als de hersteltijd punten die moeten worden geanalyseerd, zoals bleek in Fig. 2. </li></ol> 4. Heat shock <ol><li> Voor warmte shock, pre-warm serum bevattend medium in een waterbad van 37 ˚ C. </li><li> Voor te bereiden 'heat shock buffer' door verdunning in serum bevattend medium cycloheximide tot een uiteindelijke concentratie van 20 pg / ml en MOPS tot 20 mm. </li><li> Nu nemen de platen uit de incubator en zuig het medium. </li><li> Voeg toe aan elk putje 1 mL van 'Heat shock buffer', en gedurende 30 minuten bij 37 incubeer ˚ C en 5% van de CO 2 (onder meer ook de verwijzing plaat in deze behandeling). Dit zal de novo eiwitsynthese te stoppen. </li><li> In de tussentijd schakelaar op een waterbad en zet de temperature bij 45 ˚ C. </li><li> Na de incubatie zegel het deksel van de platen met Parafilm eerder gesneden in strepen. De referentie-plaat (100% van refolfed vuurvliegje) is nog in de couveuse. </li><li> Incubeer de platen bij 45 ˚ C gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de platen uit het waterbad, verwijder de parafilm en weer de platen om de couveuse naar herstel mogelijk te maken. </li><li> Op elk tijdstip de oogst van de cellen en was ze in PBS 1x door centrifugeren bij 2000Xg gedurende 1 minuut bij 4 ˚ C. </li></ol> 5. Cellysis en luciferase assay <ol><li> Voor een efficiënte cellysis, snap bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof. </li><li> Voeg 200 ul van passieve lysis buffer verdund 1:05 in dubbel gedistilleerd water in een glazen buis. </li><li> Voeg 30 ul van de cel lysaat in een 96 wells plaat. Elk monster wordt gepipetteerd in drievoud. </li><li> Alleen de 'niet geschrokken' referentiemonsters worden gebruikt omLees de renilla luciferase-activiteit, omdat deze stap wordt gebruikt om gelijk transfectie-efficiëntie te controleren. </li><li> Bereid de oplossingen voor de test. Voor de luciferine oplossing verdunnen luciferine tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mM in Gly Gly-buffer. Voor de reactie buffer verdunnen DTT en ATP 1 mM uiteindelijke concentratie in Gly-Gly buffer. Voor coelenterazine reactiebuffer, verdunnen coelenterazine tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 uM in coelenterazine buffer. Houd luciferine oplossing en coelenterazine reactiebuffer licht beschermd. </li><li> Plaats nu de 96-wells plaat in de luminometer en start het programma 'Wallac 1420 Workstation'. </li><li> Breng de Pump1 in de valk buis die de coelenterazine oplossing. Sluit het deksel zodat er geen licht kan in contact komen met de buis. </li><li> Kies uit het menu de optie 'Dispenser onderhoud' en vink Pump1. </li><li> Selecteer de optie 'Fill'. </li><li> Voor het bewerken van de plaat lay-out kiezen voor de optie 'Explore-protocol en de resultaten' op het menu. Selecteer het protocol en dubbelklik erop. Selecteer nu de putten te lezen. </li><li> Ga terug naar 'Wallac Manager' en klik op 'Start'. De reactie tussen de renilla luciferase en het substraat coelenterazine straalt licht uit met een piek golflengte van 482 nm. </li><li> Na de lezing, ga op 'Dispenser onderhoud' en selecteer 'Empty' en Pump1 om alle resterende oplossing terug vrij te geven aan de buis. </li><li> Nu schuif de tube naar een falcon buis met water en vink 'Flush'. </li><li> Na het spoelen stap, leeg de buis door het selecteren van 'Empty'. </li><li> Plaats de buis van Pump1 in de reactiebuffer valk buis en die van Pump2 in de luciferine falcon buis. </li><li> Verander de plaat lay-out. </li><li> Selecteer 'Fill' voor Pump1 en Pump2 van de 'DiSpenser Onderhoud 'menu. </li><li> Selecteer het protocol en start de lezing. De reactie tussen de Firefly luciferase en het substraat luciferine straalt licht uit met een piek golflengte van 560 nm. </li><li> Aan het eind van de lezing te herhalen van de procedure Empty-Flush-Lege voor Pump1 en Pump2. </li><li> De resultaten zijn nu beschikbaar in de 'Wallac 1420 Explorer'. </li><li> Elk experiment is gekoppeld aan een test nummer, gebruikersnaam, begin-en einddatum. </li><li> De resultaten kunnen nu worden geëxporteerd als een Excel-bestand. </li><li> Voor berekeningen, worden de cellen verdeeld in drie groepen: 1. niet-geschokt referentiemonsters (ingesteld als 100% van de hervouwen vuurvlieg luciferase), 2. cellen zonder moleculaire chaperonne en warmte geschokt, 3. cellen met moleculaire chaperone en warmte geschokt. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Eiwit hervouwing is direct gerelateerd aan de tijd van het herstel dan ook om te testen of het systeem werkt pro Perly, een test moet worden uitgevoerd verzamelen van de cellen op verschillende tijdstippen. Een directe correlatie tijd / percentage van de hervouwing geeft aan dat het experiment goed is uitgevoerd en vormt derhalve een beperkende factor. Het moet echter altijd worden beschouwd dat de hervouwing na heat shock is een verzadigende gebeurtenis en daarom een ​​goede tijdsverloop analyse moeten worden uitgevoerd voordat u begint met een experiment. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Overzicht van het experiment. In vivo hervouwing-test vereist 3 tot 4 dagen in te vullen. Op dag 1 cellen worden gezaaid en getransfecteerd. De volgende dag cellen worden gesplitst in een kleiner formaat en op dag drie zijn ze warmte geschokt. Op dit punt is het mogelijk om de luciferase assay uit te voeren direct na het oogsten van de cellen of naar de cel pellet op te slaan bij -80 ° C en voer de test in een ander moment _content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Cel splitsen. Op dag 2 cellen worden gesplitst in een 6-wells plaat. Elke transfectie zal worden verdund in een goed in om alle transfectie op dezelfde plaat te hebben. Elke plaat komt overeen met een bepaalde hersteltijd plus een niet-geschokt referentie plaat. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger goed resultaat. A. Percentage van hervouwing rechtstreeks door vuurvlieg luciferase activiteit. Elke staaf grafiek geeft het percentage van de hervouwing in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van een moleculaire chaperonne op verschillende hersteltijd punten. B. Correlatie tussen tijd en hervouwing in afwezigheid (zwarte lijn) en in aanwezigheid van (rode lijn) van de chaperonne. De r kwadraat waarden geven een goede correlatie. In Fig.3A wordt een representatieve resultaten waar de cellen werden verzameld 15, 30, 45, 60 en 120 minuten na de heat shock in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van moleculaire chaperonne. Percentage van de luciferase stijgt hervouwen met een langere hersteltijd en met de transfectie van de moleculaire chaperonne. De correlatie tussen hervouwing en tijd voor de controle (Fig. 3B, zwarte lijn) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (Fig. 3B, rode lijn) wordt weergegeven. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vertegenwoordiger slecht resultaat. A. Percentage van hervouwing rechtstreeks door luciferase activiteit. Elke staaf grafiek geeft het percentage van de hervouwing in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van een moleculaire chaperonne op verschillende hersteltijd punten. B. Correlatie tussen tijd en hervouwing in afwezigheid en in aanwezigheid (rood line) van chaperonne. De r kwadraat waarden geven slechte correlatie. Figuur 4A. Toont een representatief resultaat van een experiment niet correct is uitgevoerd. Zowel de controle (zwarte balken) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (rode balken) vertoonden geen een toename van de eiwit-hervouwing met de tijd. Bovendien heeft transfectie van de moleculaire chaperone niet resulteren in een toename van de hervouwing. Deze arme correlatie wordt bevestigd in Fig. 4B toont een r kwadraat waarde van 0,6619 en 0,1882 respectievelijk voor de controle (zwarte lijn) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (rode lijn).

<ol><li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+and+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li>
<li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+the+heat+shock+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li>
<li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li>
<li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+proteins+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast.+Cancer.+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li>
<li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li>
<li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li>
<li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17-AAG%3A+mechanisms+of+antitumour+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Investig.+Drugs%22%5BJournal%5D)">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP70+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li>
<li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pineal.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li>
<li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaK%2C+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li>
<li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li>
<li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li>
<li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit werk een protocol om intracellulaire hervouwing activiteit van moleculaire chaperonnes maatregel is gepresenteerd. De hele test kan worden uitgevoerd in 3 tot 4 dagen zoals blijkt uit het overzicht in Fig. 1. De robuustheid en de lineariteit van het lichtsignaal door de vuurvlieg en de renilla luciferase vormen een solide basis voor de reproduceerbaarheid van het protocol. De kritische stap van de test is de keuze van een efficiënte transf...

Voor dit experiment een Luminometer vorm Perkin Elmer &#39;1420 Luminescentie Counter &#39;Vector Light&#39; werd gebruikt Programma&#39;s voor de Luminometer: Renilla: Pomp 1, 100 pi injectie Reactie Buffer: Pump1, 70 ul injectie Luciferine: Pump2, 30μl injectie Voor de buffers voor te bereiden van deze voorraad oplossingen in dubbel gedistilleerd water: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O in 1 liter </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA in 1 liter </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 in 1 liter </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3H 2 O in 1 liter </li><li> - 5M NaCl: 292,2 g NaCl in 1 liter </li><li> - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O in 1 liter &nbsp;</li></ul> Gly-Gly-buffer: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> Voor 1 liter gebruik 3,3 g Glycylglycin, 15 ml van een 1M MgSO4 oplossing en 8 ml van een 0,5 M EGTA-oplossing. Op te lossen in water, breng de pH op 7,8 te brengen en tot een totaal volume van 1 liter. Reactie buffer voor Renilla / Coelenterazine buffer: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1 mM EDTA </li></ul> Voor 1 liter gebruik 13,4 ml van een 1 M KH 2 PO 4-oplossing, 86,6 ml van een 1 M K 2 HPO 4-oplossing, 100 ml van een 5M NaCl-oplossing en 2 ml van een 0,5 M EDTA-oplossing. <table border="1"><tr><td></td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus / Productnummer: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum Gold </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 DNA transfectiereagens </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-morfolino) Propanesulfonic zuur </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Passieve Lysis Buffer 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferine Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP (Adenosine Triphosphate) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellulaire hervouwing assay

Intracellular Refolding Assay

Dit protocol beschrijft een methode om de enzymatische activiteit van moleculaire chaperonnes te meten in een cel-gebaseerd systeem en de mogelijke effecten van verbindingen met remmende / stimulerende activiteit. Moleculaire chaperones zijn eiwitten die betrokken zijn bij de regulatie van het vouwen van eiwitten 1 en hebben een cruciale rol bij het ​​bevorderen van overleving van de cel op stress-beledigingen als heat shock 2, voedingsstoffen honger en blootstelling aan chemicaliën / gifstoffen 3. Om deze reden chaperones blijken te zijn betrokken bij evenementen zoals de ontwikkeling van tumoren, chemioresistance van kankercellen 4 en 5 neurodegeneratie. Ontwerp van kleine moleculen kunnen remmen of stimuleren van de activiteit van deze enzymen is dan ook een van de meest bestudeerde strategieën voor kankertherapie 7 en neurodegeneratieve aandoeningen 9. De test hier beschreven biedt de mogelijkheid om de hervouwing activiteit van een specifieke moleculaire chaperonne te meten en het effect van de comp studieounds op zijn activiteit. In deze methode het gen van de onderzochte moleculaire chaperone samen getransfecteerd met een expressievector codering voor de vuurvlieg luciferase-gen. Het is al beschreven dat gedenatureerd vuurvlieg luciferase kan worden opnieuw gevouwen door moleculaire chaperonnes 10,11. Als het normaliseren van transfectie controle is een vector die codeert voor de renilla luciferase-gen getransfecteerde. Alle transfecties beschreven in dit protocol zijn uitgevoerd met X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cellen. In de eerste stap wordt de eiwitsynthese geremd door het behandelen van de cellen met cycloheximide. Daarna eiwitten ontvouwen wordt veroorzaakt door warmte shock bij 45 ° C gedurende 30 minuten. Na herstel bij 37 ° C, worden eiwitten opnieuw gevouwen in hun actieve conformatie en de activiteit van de vuurvlieg luciferase wordt gebruikt als read-out: hoe meer licht zal worden geproduceerd, de meer eiwitten zal opnieuw kreeg de oorspronkelijke conformatie. Niet-warmte geschokt cellen zijn ingesteld als referentie (100% van hervouwenluciferase).

In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.

Intracellulaire hervouwing Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de chaperone-afhankelijke intracellulaire eiwitherfolding na een hitteshock te meten. Gebruik een luciferase-reporter om de cellen eerst te transfecteren met plasmiden die het luciferase-reportergen en de chaperone van belang bevatten. Verdeel vervolgens de getransfecteerde cellen over de verschillende herstelmomenten in het experimentele ontwerp.Verwarm de cellen de volgende dag aan een hittepuls om eiwitontvouwing te induceren. Laat de cellen herstellen om de intracellulaire eiwitvouwing te herstellen en meet vervolgens de luciferase-reporteractiviteit. De resultaten meten de tijdsafhankelijke en chaperone-afhankelijke eiwithervouwing op basis van de luciferase-assay.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de in vitro refolding-assay, is de mogelijkheid om een fysiologische readout te verkrijgen van het effect van verbindingen of eiwitten op de chaperone-activiteit. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van een breed scala aan ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekten of kanker, aangezien chaperones een belangrijke rol spelen bij de ontwikkeling van deze pathologieën. Warm eerst het kweekmedium, PBS en trypsine voor tot 37 °C in een waterbad.Was een confluente cultuur van HEK 2 93 cellen met vijf milliliter PBS. Breng vervolgens één milliliter trypsine met 0,025% EDTA aan, roteer de plaat voorzichtig voor een gelijkmatige verdeling van de trypsine en incubeer bij 37 °C. Schud de plaat periodiek om de loslating van de cellen te controleren.Resuspendeer de cellen nu in 10 milliliters volledig DMEM-medium en breng ze over naar een 50 milliliter falcon-buis. Tel vervolgens de cellen met een Beckman-teller. Zaai de cellen uit bij een confluentie van ongeveer 60 tot 70% en incubeer deze gedurende zes tot acht uur.Breng het extreme gene, nine-reagens naar kamertemperatuur en de aliquot serumvrij medium naar 37 °C. Pipetteer het serumvrije medium in twee einor-buisjes. Voeg vervolgens het extreme gene nine-reagens toe zonder de wand van het einor-buisje te raken en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur.Bereid ondertussen de 2D NA-transfectiemengsels voor in buis één; voeg ran vanilla firefly en een lege vectorcontrole toe in buis twee. Voeg de ran vanilla firefly en de moleculaire chaperone toe. Voeg het DNA toe aan het mengsel van transfectiereagens, vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Voeg dit mengsel vervolgens toe aan de geplaatste cellen en incubeer gedurende 24 uur. Oogst de getransfecteerde cellen met trypsine; zaai cellen uit bij een confluentie van 60 tot 70% in zeswelplaten en laat deze een nacht in de incubator staan. Aspireer het medium van de getransfecteerde cellen.Voeg vervolgens één milliliter hittechokbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten. Om de de novo eiwitsynthese te stoppen, worden de deksels afgesloten met parafilmstrips en worden de cellen 30 minuten geïncubeerd in een waterbad van 45 °C. Verwijder nu de parafilm en plaats de cellen terug in de incubator voor herstel op de gespecificeerde tijdstippen.Oogst de cellen en was deze eenmaal in PBS. Voor een efficiënte cellyse wordt het celpellet snel ingevroren (snap-freeze) in vloeibare stikstof, waarna 200 microliters verdunde passieve lysisbuffer wordt toegevoegd. Verdeel dit vervolgens in triplicaten: 30 microliters van het cellysaat per putje van een 96-wells plaat.Om de transfectie-efficiëntie te evalueren, begint u met de niet-gechoqueerde referentiemonsters. Bereid voor het meten van de ran luciferase-activiteit verse 0,2 millimolar Lucifer in gly Gly buffer reactiebuffer voor, die 1 millimolar ATP en 0,2 micromolar ezine reactiebuffer bevat. Plaats de 96-wellsplaat in de luminometer en start het programma.Wallach 1420 werkstation. Plaats pomp één in de Falcon-buis met 0,2 micromolar ezine reactiebuffer. Selecteer in het menu de optie dispenseronderhoud en vink pomp één aan.Selecteer de optie vullen om de plaatindeling te bewerken. Kies de optie, bekijk het protocol en de resultaten in het menu. Selecteer het protocol.Select nu de wells die moeten worden uitgelezen. Ga terug naar de Wallach-manager en klik op start om de emissies van de monsters te meten. Ga bij 482 nanometers naar het dispenseronderhoud en selecteer 'empty and pump one' om alle resterende oplossing terug in de buis te pompen.Verplaats nu de buis naar een Falcon-buis met water en tik deze aan om door te spoelen. Ga verder door 'empty' (leeg) te selecteren. Plaats vervolgens de buis van pomp één in de reactiebuffer en de buis van pomp twee in de LUCIFERIAN-oplossing.Pas de plaatindeling aan. Selecteer 'vullen' voor pomp één en pomp twee. Selecteer vanuit het onderhoudsmenu van de dispenser het protocol en start de meting van de vuurvlieg-luciferasereactie bij een golflengte van 560 nanometers.Herhaal aan het einde van de herhaling de procedure: legen, doorspoelen, legen. Bekijk voor pomp één en pomp twee de resultaten in de Wallach 1420 Explorer. Elk experiment is gekoppeld aan een assay.Voer de gebruikersnaam, de begin- en einddatum in en exporteer de resultaten als een Excel-bestand. Voor de analyse is de eiwitvouwing direct gerelateerd aan de hersteltijd. In dit experiment worden cellen op verschillende tijdstippen na een hittestress geëvalueerd.In afwezigheid en aanwezigheid van het moleculaire chaperone. Zoals verwacht neemt het percentage herbouwde luciferase toe bij een langere hersteltijd in zowel de controles als in de cellen die zijn getransfecteerd met het moleculaire chaperone. Daarentegen vertoont een ongeldige dataset slechte R-kwadraatwaarden voor de correlatie tussen tijd en herbouw.Na deze techniek kunnen andere methoden, zoals de in vitro TPA-assay, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de inhibitie van de enzymatische activiteit van het chaperone. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het meten van intracellulaire eiwitten na een hitte-shock.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Source: Dahl, J. et al. Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a fluorescence spectrophotometer-based assay to evaluate chaperone activity on a substrate protein under acid and heat stress. It outlines the steps for monitoring substrate unfolding and aggregation through light scattering, comparing conditions with and without the chaperone.

Assessing Bacterial Chaperone Activity via Thermal Unfolding of a Model Protein

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

This video describes an in vitro fluorescence-based microplate assay to study the degradation kinetics of a fluorescently-labeled misfolded luciferase mutant protein expressed in the nuclei of transfected mammalian cells. The assay involves the treatment of cells expressing the fluorescent mutant protein with a translation inhibitor and a proteasome inhibitor to assess the proteasome-mediated degradation of the misfolded protein.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: A Technique to Monitor the Degradation Kinetics of Fluorescent Nuclear Misfolded Proteins

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor,...

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde techniek om hoogwaardige vitamine A / RBP complex en twee real-time monitoring technieken om studeren vitamine A het vervoer door STRA6, de RBP-receptor te produceren.

Real-time analyses van Retinol Vervoer door de membraan receptor van Plasma Retinol bindend eiwit

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

Leer een luciferase-gebaseerde methode om chaperon-afhankelijke intracellulaire eiwit-hervouwing na warmteschok te meten in HEK293-cellen. Deze techniek biedt een fysiologische read-out voor chaperon-activiteit.

Intracellulaire hervouwing Assay

Meer video's verkennen