Name: Germ Cell Transplantation en de testis weefsel Xenografting in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer kiemceltransplantatie en testisweefselxenografting in muizen voor reproductiebiologisch onderzoek. Deze technieken identificeren spermatogoniale stamcellen en bestuderen zaadcelontwikkeling in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk van de auteurs laboratorium werd ondersteund door USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) en Alberta innoveert - Health Solutions.

DEEL A. Germ cel transplantatie bij muizen 1. Voorbereiding van de ontvanger muizen <ol><li> Ontvangers moeten immunologisch tolerant (hetzij genetisch aangepast aan donoren of immuun-deficiënte) aan de donor testis cellen. </li><li> De afnemers moeten worden hetzij van nature, zonder spermatogenese (bijv. W / W v muizen) of helemaal leeg van endogene kiemcellen. Germ cel depletie kan worden bereikt door bestralen of chemotherapeutische medicijnen zoals Busulfan. In dit protocol beschrijven we de methode voor het bereiden ontvangende muizen met busulfan. </li><li> Behandel de ontvangers op 4-6 week van leeftijd door ip injectie van busulfan. De optimale dosis van busulfan is stam afhankelijk. In veel gebruikte ontvanger stammen, een dosis van 40-50 mg / kg is voldoende om endogene kiemcellen (bijv. 44 mg / kg voor naakt muizen, 50 mg / kg voor B6/129 F1 ontvangers). Afbrekende </li><li> Los Busulfan poeder in DMSO en voeg dan een gelijk volume van steriel gedistilleerd water to maken een eindconcentratie van 4 mg / ml. Houd de oplossing warm bij 35-40 ° C voor gebruik om de neerslag van Busulfan te voorkomen. Gooi oplossing als neerslag wordt waargenomen. </li><li> Na de behandeling met busulfan, zodat ten minste een maand voor het gebruik van ontvangers. Ontvangers kunnen gebruikt worden tussen 1 maand en 3 maanden na de behandeling met busulfan. </li></ol> 2. Voorbereiding van micro-injectie pipetten <ol><li> Kies borosilicaatglas pipetten (capillaire buizen) met een 1.0 mm buitendiameter, een 0,75 mm binnendiameter, en een lengte van 3 inch. </li><li> Siliconize glazen pipetten met Sigmacote afspoelen pipetten met methanol en föhnen. </li><li> Trek de pipetten met een pipet trekker. Verschillende pipet trekker machines hebben verschillende instellingen dan ook een paar instellingen te testen. Algemeen kan een instelling vergelijkbaar met die gebruikt voor de vervaardiging enucleatie pipetten werken. </li><li> Voorafgaande Breek de pipetpunten onder stereomicroscoop te gebruiken tot een diameter van ongeveer 50 micrometer te bereikenaan het uiteinde. </li></ol> 3. Voorbereiding van de donor cellen voor transplantatie <ol><li> Choise van donorstam is afhankelijk van de studeerde experimentele vraag. Indien kwantificering van de spermatogenese wordt gebruikt als eindpunt, het gebruik van donoren met een gemakkelijk herkenbare genetische merker zoals de Lac-Z (bijv. B6.129S7-GT (ROSA) 26Sor / J van Jackson Laboratory) of GFP (bijv. C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J van Jackson Laboratory). </li><li> Bereid 7 ml van collagenase in DMEM bij 1 mg / ml, 4 ml trypsine-EDTA (0,25% trypsine plus 1 mM EDTA), en 2 ml van DNase in DMEM bij 7 mg / ml. Dit bedrag is voor de vertering 2 donor muis testes. </li><li> Aseptisch Verzamel testes en verwijder de tunicaalbuginea. Spread testes voorzichtig met fijn pincet te vergemakkelijken enzymatische spijsvertering. </li><li> Transfer tubuli in collagenase, incuberen bij 37 ° C gedurende 5-10 min en schud vaak. </li><li> Tweemaal Was tubuli door spinnen (200-300 g voor 3 min) en opnieuw suspenderen in PBS w / o Ca 2 + + </li><li> Opnieuw te schorten tubuli in trypsine-EDTA en schud totdat ze plakkerig en troebel is. Monitor de vertering van pijpjens bij 37 ° C zoals het dient binnen 1-2 min. </li><li> Voeg DNase en goed schudden. Incubeer gedurende 1-2 min. </li><li> Voeg 3 ml van FBS aan de actie van enzymen stoppen. </li><li> Filter celsuspensie met behulp van een nylon mesh met 40-70 micrometer poriegrootte naar cel / weefsel brokken te verwijderen. </li><li> Verzamel cellen bij 600 g gedurende 5 min en resuspendeer cellen in een kleine hoeveelheid DMEM (&lt;100 ul). </li><li> Tel cellen en het volume op een gewenste uiteindelijke concentratie (meestal 100 x 10 6). Blijf celsuspensie op ijs vóór gebruik. </li><li> Elke Busulfan-behandelde muizen testis zal gevuld worden met slechts 10-15 pi van celsuspensie. Vanwege potentiële afval en lekkage, beogen met 30-50 pi per testis hebben. </li></ol> 4. Transplantatie procedure (figuur 1) <ol><li> Verdoof ontvangers volgende goedgekeurde protocollen. </li><li> Plaats in dorsaledecubitus en chirurgisch de voorbereiding van de buikstreek. Maak een ~ 1 cm middellijn incisie in de buikwand naar de buikwand bloot te leggen. Til buikwand met behulp van kleine tang op het punt van de witte lijn om te voorkomen dat per ongeluk verwonden buikorganen, en om een ​​~ 0,5 cm insnijding maken op de middellijn van de buikwand naar de peritoneale holte bloot te gaan. </li><li> Gebruik een iris een tang om de buikwand te houden, en gebruik een ander paar iris tang te zoeken naar de vetkussentjes aan de bijbal en de testis in de buikholte. Trek het vet pad uit tot de testis is exteriorized en de testis slagader en bijbal zijn duidelijk zichtbaar. Werk op een testis op een moment. </li><li> Leg een dun steriel laken gemaakt van autoclaaf fiches onder de dikke pad / testis voor een betere visuele identificatie (optioneel). De incisiefolie werkt ook te vangen vloeistof. </li><li> Voeg een druppel trypan blauw kleurstof in de celsuspensie en zorgvuldig de celsuspensie te laden in de polyethyleenlene slang aangesloten op een 1 ml spuit. Bevestig de getrokken pipet in de slang en voorzichtig de celsuspensie te ver in de pipet door het toepassen van druk op de spuit. </li><li> Identificeer de efferente kanalen (dat de testis te sluiten op de bijbal) en voorzichtig vetweefsel te verwijderen rond de kanalen. Ga voorzichtig te werk als de leidingen en het membraan om hen heen zijn doorschijnend. </li><li> Voorzichtig de pipet in te voegen in een kanaal in de bundel van de efferente leidingen, voorzichtig draad een paar mm in de richting van de testis. </li><li> Terwijl het vermijden van het verplaatsen van de injectie pipet, te bereiken voor de spuit, zachtjes druk de zuiger van de spuit om ervoor te zorgen dat de schorsing uitmondt in de rete testis en testes te vullen beginnen. </li><li> De injectie snelheid en doorstroming van celsuspensie wordt geregeld door druk van de duim. Vermijd plotselinge toename van de druk; toezicht op de beweging van suspensie in tubuli. </li><li> Stop de injectie bijna alle oppervlakte-tubuli zijn gevuld voordat de testis begint te BECome ischemische. </li><li> Zet de testis naar de buikholte. Herhaal de procedure op de contralaterale testis. Hecht de buikwand met 6-0 zijden hechtdraad en sluit de huid met metalen wond clips. Monitor muizen op een warming-pad tot volledig herstel. </li></ol> 5. Analyse van de ontvanger testes <ol><li> Laat 2-4 maanden na de transplantatie voor de analyse. </li><li> Euthanaseren van de ontvanger muis op basis van dierlijke zorg en gebruik van richtlijnen en het verzamelen van de testis en epididymis in PBS. Wanneer een Lac-Z transgene donorstam is gebruikt, kan de epididymis worden gebruikt als een positieve kleuring beheersing als het heeft endogene beta-galactosidase activiteit. </li><li> Voor detectie van donor cellen door Lac-Z kleuring, bevestig de testis gedurende 1-2 uur bij 4 ° C in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Spoel 3 x 30 min bij kamertemperatuur in lacZ spoelen buffer. </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C in lacZ kleuroplossing. Testis kan worden gebeitst als een geheel of na dispergerende tubuli. </li><li> Fix en op te slaan in 10% neutraal gebufferde formaline. Indien delen zijn nodig neutrale snel rood als contra-vlek. </li></ol> DEEL B. Ectopische xenografting bij muizen (Van Dobrinski en Rathi 2008 15, en Rodriguez-Sosa et al.. 2011 16). 1. Het verzamelen van donorweefsel <ol><li> Verkrijgen testis weefsel door castratie of biopsie van een donor man. </li><li> Plaats testis in PBS of biopten in kweekmedium, handhaven van de steriele omstandigheden. </li><li> Houd de verzamelde weefsel op het ijs en het transport naar het laboratorium. </li></ol> 2. Voorbereiding van donorweefsel <ol><li> Voer in de weefselkweek kap om de steriliteit te behouden. </li><li> Was beide testikels in ijskoud PBS met antibiotica twee tot drie keer alvorens het in een cultuur-schotel met PBS. In het geval van biopten, was testis fragmenten twee tot drie keer met ijskoude cultuur medium met antibiotica door het draaien op 150 gram voor 2 min en resuspenderen in verse ijskoude kweekmedium. </li><li> Voor intact testes, verwijder tunica vaginalis door het maken van een incisie langs het oppervlak en de extrusie van de testis. Verwijderen uit testis alle bijlage structuren (zaadstreng, bijbal, bindweefsel). Ze wast testes in koude PBS en de overdracht in een cultuur-schotel met PBS. </li><li> Verwijder voorzichtig het tunicaalbuginea van de testis met behulp van een scalpel en een schaar. Als de testis erg klein is, kan de tunica worden verwijderd door knijpen de testismassa uit de tunica via een kleine incisie gemaakt op een uiteinde terwijl u de tunica met een paar kleine forceps aan de andere kant. </li><li> Afhankelijk van de grootte van de testis ofwel de hele testis weefsel kan worden versneden in kleine stukjes van ongeveer 1 - 2 mm 3 in maat met gebogen pincet en een scalpel blade, of grote stukken testis weefsel kan eerst verwijderd uit de testis en vervolgens gesneden in kleinerestukken. Dit alles dient te gebeuren in ijskoud kweekmedium en onder steriele omstandigheden in een kleine cultuur schotel (60 x15 mm). </li><li> Breng de voorbereide weefsel fragmenten te ijskoud kweekmedium in kleine cultuur-gerechten op ijs tot enten. </li></ol> 3. Castratie van de ontvanger muis <ol><li> Verdoof de muis zoals hierboven en voor te bereiden steriele chirurgische veld door het knippen van de haren (niet noodzakelijk in naakt muizen), bestrijken met 70% ethanol en Betadine-oplossing. </li><li> Maak een 0,5 -1 cm ventrale middellijn incisie in de huid van de buikwand bloot te leggen. </li><li> Voorzichtig bloot te leggen van de testis, de testis slagader en bijbal, zoals beschreven in PARTA, 4,2-4,3. </li><li> Maak de staart van de epidydimis uit de gubernaculum door stompe dissectie. </li><li> Ligeren van de testiculaire slagader, en de zaadleider, samen met het bloedvat met zijde, en het gedeelte geligeerde structuren door te snijden tussen de testis en de ligatuur. </li><li> Herhaal de procedure voor de secoND testis. </li><li> Hecht het buikwand met een of twee chirurgische steken. </li><li> Sluit de incisie in de huid met een of twee Michel clips. </li></ol> 4. Ectopische xenografting <ol><li> Plaats de muis in ventrale decubitus en bereid je een steriel chirurgisch veld op zijn rug als hierboven. </li><li> Afhankelijk van hoeveel grafts worden ingevoegd (algemeen 4-8/mouse), maken ~ 0.5 cm lang huidincisies aan weerszijden van het midden lijn van de rug van de muis. </li><li> Gebruik een tang om een ​​rand van de huid incisie te houden, en een onderhuidse holte door plagen elkaar het bindweefsel met een schaar. </li><li> Met behulp van een iris een tang plaats een stukje testis weefsel diep in de onderhuidse holte, die de grens van de huid incisie met een andere iris tang. </li><li> Sluit de incisie in de huid met een clip Michel en houd muis op verwarmingskussen tot het begint te herstellen van anesthesie. </li><li> Breng de muis naar een kooi met extra isolatie en cover en monitor tot muizen zijn volledig hersteld. </li></ol> 5. Het verzamelen van testis xenografts voor analyse en sperma oogsten <ol><li> Euthanaseren de host muis op basis van dierlijke zorg en gebruik van richtlijnen, en maak een middellijn incisie in de huid op de rug huid die loopt van de staart tot aan de nek en open huid. Dit onthult de grafts die hetzij worden kunnen op het subcutane weefsel of aan de huid. </li><li> Verwijder voorzichtig het enten met een paar pincet en een schaar. </li><li> Record aantal grafts hersteld, de grootte en het gewicht van de individuele transplantaten. </li><li> Haal de zaadblaasjes uit de buik van de muis en het opnemen van hun gewicht als een indicatie van de productie van testosteron door de geënte weefsel. </li><li> Voor histologische analyse <ol class="lalpha"><li> Suspend xenografts in monsterflesje bevattende Bouin's oplossing (of andere fixatief) in een volume op ~ 10x die van de xenograft, en label injectieflacon gepast. </li><li> Broedennacht in de koelkast, gevolgd door het wassen van minstens 3 keer in 70% ethanol met tussenpozen van 24 uur bij voorkeur. </li><li> Ga voor de verwerking en de inbedding in paraffine. </li></ol></li><li> Voor sperma oogsten <ol class="lalpha"><li> Was xenotransplantaten door het draaien van hen neer op 300 g gedurende 1 minuut en resuspenderen in kweekmedium met antibiotica. </li><li> Snijd grafts in kleine stukjes en gehakt zorgvuldig met de tang in een weefselkweek schotel met 3 - 5 ml kweekmedium. </li><li> Filter gehakt weefsel door middel van de 40 micrometer cel zeef. </li></ol></li></ol> DEEL C. representatieve resultaten 1. Germ celtransplantatie Als de getransplanteerde donor cel suspensie bevat spermatogoniale stamcellen het dragen van een genetische marker, zoals de LacZ transgen, kolonisatie van donor SSC's in de ontvangende testis kunnen worden gevisualiseerd door X-gal kleuring als kenmerkende blauwe segmenten van de seminiferous tubuli na 2-3 maanden na de transplantatie 3 (figuur 2A). Een goed gevestigde kolonie moeten een lange donkerblauwe strook van geheel gevuld segmenten met twee of meer lagen blauwe cellen dichter bij het centrum, en relatief zwakkere gebrandschilderde regio aan beide eindigt waar een netwerk van single, gepaarde of kleine groepen blauwe cellen blijkt 3 (figuur 2B). Een dwarsdoorsnede van de donkerblauwe seminiferous regio moet uitwijzen gevestigde en goed georganiseerde spermatogenese met blauwe kiemcellen in verschillende stadia differentiatie (figuur 2C). 2. Testis weefsel xenografting De levensvatbaarheid van testis weefsel na de transplantatie is omgekeerd evenredig met de ontwikkelingsfase van de donor; het beste resultaat wordt verkregen wanneer weefsel van pasgeboren mannen wordt gebruikt, terwijl de volwassen weefsel vertoont een sterke neiging tot degenereren en afsterven 17-21. Algemeen xenograft succes af naarmate donor weefsel ondergaat meiosis van de eerste golf van de spermatogenese. Tijd om volledige ontwikkeling van de onvolwassen donorweefsel en volledige spermatogenese is soortspecifiek, en vaak iets korter in vergelijking met de testes in situ. Het aantal van de tubuli seminiferi met volledige spermatogenese is variabel afhankelijk van de soort. Terwijl in schapen, geiten en varkens dat aantal groter is dan 50%, in vee en katten het is minder dan 15% 14 (Figuur 3). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Germ cel transplantatie procedure. Plaats ontvangers in dorsale decubitus na de anesthesie en maak een ~ 0.4-inch middellijn incisie in de buikwand (A). Expose testis door intrekking van het vet pad aan de epididymis en testis en leg een dun steriel laken onder de dikke pad / testis voor een betere visuele identificatie (B). Plaats de testis en epididymis, zodat de efferente kanalen begraven in de dikke pad te onderscheiden zijn (C, D, E). Identiteit van de efferente leidingen en zacht vet weefsel te verwijderen rond de kanalen. Een stuk gekleurd papier of plastic kan worden geplaatst onder de leidingen voor betere visualisatie (G). Breken of de pipet tip malen volgens de grootte van de leidingen en load celsuspensie in de pipet (H). Voorzichtig de pipet in te voegen in een kanaal in de bundel van de efferente leidingen, voorzichtig draad een paar mm in de richting van de testis (de pijl in de H geeft de richting van de pipet injectie en threading). Een testis met succesvolle injectie in de testes wordt weergegeven (I). Ts: testis; Ep: bijbal. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve resultaten voor kiemcellen transplantatie A) Een geïnjecteerd testis gekleurd met X-gal. De blauwe segmenten van de testes vertegenwoordigen gevestigde kolonies van transgene donor SSC's (LacZ transgen). B) Hogere vergroting van een SSC kolonie op 3 maanden na de transplantatie. The donkerblauwe gebied in het centrum vertegenwoordigt volledige spermatogenese en de lichtblauwe regio's aan de uiteinden vertegenwoordigen groeiende uitbreiding van de kolonie. C) Een histologische deel van de donkerblauwe seminiferous (3 maanden na de transplantatie) toont goed georganiseerd spermatogenese. Scale bars in B en C zijn 200 micrometer en 30 urn, respectievelijk. (Cijfers aangepast van Annu Rev Cell Dev Biol 2008;. 24:263-86 en Biol Reprod 1999 Jun;. 60 (6) :1429-36). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Ectopische xenografting van onrijpe testis weefsel van grote dieren in immunodeficiënte muizen. Fragmenten van onvolwassen donor testis (~ 1 mm 3) getransplanteerd onder de dorsale huid van immunodeficiënte muizen (A) in staat zijn om te overleven en de muis gonadotrofinen reageren. Als gevolg, testis tissue ondergaat volledige ontwikkeling, inclusief vorming van bevruchting bevoegde sperma (B). Zodra testis xenotransplantaten worden verzameld (C)ze kunnen worden gebruikt voor analyse of om sperma (D) verkrijgen voor ICSI (E) en embryo productie (F). Bars gelijke 50 pm (B, E en F) of 10 micrometer (D). (Modified van Rodriguez-Sosa en Dobrinksi 2009 14).

<ol><li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).</li>
<li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).</li>
<li>Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+and+kinetics+of+mouse+donor+spermatogonial+stem+cell+colonization+in+recipient+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes.</a> Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).</li>
<li>Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+produced+by+retroviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).</li>
<li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgenic+rats+through+the+male+germline+using+lentiviral+transduction+and+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).</li>
<li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).</li>
<li>Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cells+dictate+spermatogonial+stem+cell+niches+in+the+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).</li>
<li>Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+efficiency+and+proliferation+kinetics+of+male+germ+line+stem+cells+following+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice.</a> Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).</li>
<li>Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+essential+for+self-renewal+and+expansion+of+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).</li>
<li>Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+genes+important+for+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).</li>
<li>Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+transplantation+and+testis+tissue+xenografting+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals.</a> Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).</li>
<li>Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+germ+cells+from+rabbits+and+dogs+into+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes.</a> Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).</li>
<li>Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+from+neonatal+mammalian+testes+grafted+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice.</a> Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+testis+tissue+xenografting%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recent developments in testis tissue xenografting.</a> Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).</li>
<li>Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobrinski%2C+I+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodriguez-Sosa%2C+JR+%22Fertility+Preservation%3A+Emerging+Technologies+and+Clinical+Applications%22">Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications</a>. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).</li>
<li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+fate+and+seminiferous+tubule+development+in+bovine+testis+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts.</a> Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).</li>
<li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+development+in+equine+testis+tissue+xenografted+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice.</a> Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).</li>
<li>Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+donor+age+on+success+of+spermatogenesis+in+feline+testis+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility%2C+and+Development%22%5BJournal%5D)">Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).</li>
<li>Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenografting+of+adult+mammalian+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Xenografting of adult mammalian testis tissue.</a> Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).</li>
<li>Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+survival+of+adult+human+testicular+tissue+as+ectopic+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft.</a> Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).</li>
<li>Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta1-+and+alpha6-integrin+are+surface+markers+on+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).</li>
<li>Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD9+is+a+surface+marker+on+mouse+and+rat+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).</li>
<li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+niche+microenvironment+on+spermatogonial+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).</li>
<li>Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Plzf+in+maintenance+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells.</a> Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).</li>
<li>Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV5+is+required+for+continuous+spermatogenesis+in+adult+mice+and+may+mediate+blood+testes+barrier+function+and+testicular+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).</li>
<li>Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+transplantation+of+porcine+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Preservation and transplantation of porcine testis tissue.</a> Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).</li>
<li>Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cold+storage+and+cryopreservation+of+immature+non-human+primate+testicular+tissue+on+spermatogonial+stem+cell+potential+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts.</a> Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).</li>
<li>Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+testicular+tissue+from+infant+monkeys+after+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice.</a> Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).</li>
<li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

1. Germ celtransplantatie Germ celtransplantatie vormt het enige functionele assay voor ondubbelzinnige bevestiging van de aanwezigheid van spermatogoniale stamcellen (SSC&#39;s) in een cel populatie. Alleen SSC&#39;s kunnen naar huis aan en de SSC niche in de kelder membraan en koloniseren initiëren donor-afgeleide spermatogenese. Germ celtransplantatie maakte het mogelijk om te studeren en SSC&#39;s te manipuleren in een ongekende manier. De techniek is gebruikt om transgene dieren te produc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Collagenase (type IV) </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td></tr><tr><td> DNasel </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypaan blauwe vlek </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td></tr><tr><td> Nylon mesh cel zeef </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.340 (40 pm) 352350 (70μm) </td></tr><tr><td> Busulfan </td><td> Sigma </td><td> B2635 </td></tr><tr><td> Dunwandige glazen capillairen </td><td> Wereld precisie-instrument </td><td> TW 100-3 </td></tr><tr><td> BD intramedic plyethylene buis (PE100) </td><td> BD </td><td> CA-63018-725 </td></tr><tr><td> Ethicon 6-0 Silk Suture </td><td> Ethicon </td><td> 706G </td></tr><tr><td> Wond clips </td><td> BD </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Sigma </td><td> B4252 </td></tr><tr><td> Kaliumferrocyanide </td><td> Sigma </td><td> P9387 </td></tr><tr><td> Kaliumferricyanide </td><td> Sigma </td><td> P3667 </td></tr><tr><td> magnesium chloride </td><td> Sigma </td><td> 208337 </td></tr><tr><td> natrium deoxycholaat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma </td><td> 18896 </td></tr></tbody></table>

germ cell transplantation en de testis weefsel xenografting in muizen

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ celtransplantatie is ontwikkeld door Dr Ralph Brinster en collega&#39;s van de Universiteit van Pennsylvania in 1994 1,2. Deze baanbrekende studies toonden aan dat micro-injectie van kiemcellen van vruchtbare donor muizen in de testes van de onvruchtbare ontvangende muizen resulteert in een donor-afgeleide spermatogenese en sperma productie door de ontvanger dier 2. Het gebruik van donor mannen dat het bacteriële β-galactosidase gen toegestaan ​​identificatie van donor-afgeleide spermatogenese en de overdracht van de donor haplotype aan het nageslacht door ontvangende dieren 1. Verrassend, na transplantatie in het lumen van de tubuli seminiferis, getransplanteerde kiemcellen konden van de luminale compartiment verplaatsen naar de kelder membraan waar spermatogonia zich bevinden 3. Het is algemeen aanvaard dat alleen SSC&#39;s kunnen de nis en herstellen spermatogenese bij de ontvanger testis koloniseren. Daarom kiemceltransplantatie zorgt voor een functionele benadering van de stamcel niche in de testis te bestuderen en vermeende spermatogoniale stamcellen te karakteriseren. Tot op heden is kiemcel transplantatie gebruikt om de basis stamcelbiologie toe te lichten, om transgene dieren produceren door middel van genetische manipulatie van geslachtscellen voorafgaand aan de transplantatie 4,5 tot Sertoli cel-kiemcel interactie 6,7, SSC homing en kolonisatie 3 te bestuderen, 8, evenals SSC zelfvernieuwing en differentiatie 9,10. Germ celtransplantatie is ook mogelijk in grote soorten 11. In deze, de belangrijkste toepassingen zijn het behoud van de vruchtbaarheid, de verspreiding van de elite van de genetica bij dieren, en het genereren van transgene dieren als de studie van de spermatogenese en SSC biologie met deze techniek is logistiek moeilijker en duurder dan in knaagdieren. Transplantatie van kiemcellen van grote soorten in de testes van muizen resulteert in colonization van donor cellen en spermatogonia expansie, maar niet in hun volledige differentiatie vermoedelijk wegens onverenigbaarheid van de ontvanger somatische cel compartiment met de kiem cellen van fylogenetisch verre species 12. Een alternatieve benadering is de transplantatie van kiemcellen van grote soorten samen met hun omringende somatische compartiment. We hebben eerst gemeld in 2002, dat kleine fragmenten van testis weefsel van onvolwassen mannetjes getransplanteerd onder de dorsale huid van immunodeficiënte muizen in staat zijn om te overleven en te ondergaan volle ontwikkeling met de productie van de bevruchting bevoegde sperma 13. Sindsdien testis weefsel xenografting is gebleken om succesvol te zijn in vele soorten en naar voren gekomen als een waardevol alternatief voor de testis ontwikkeling en spermatogenese van de grote dieren in muizen 14 te bestuderen.

Protocollen voor kiemcellen transplantatie en testis weefsel xenografting worden beschreven. Germ celtransplantatie resulteert in een donor-afgeleide spermatogenese in de ontvangende testes en vertegenwoordigt een functionele reconstitutie test voor de identificatie van spermatogoniale stamcellen (SSC&#39;s). Testis weefsel xenografting reproduceert testis ontwikkeling en spermatogenese van verschillende soorten donor in de ontvangende muizen.

Germ Cell Transplantation en de testis weefsel Xenografting in Muizen

Kiemceltransplantatie werd in 1994 ontwikkeld door dr. Ralph Brinster en collega's aan de University of Pennsylvania1,2. Deze baanbrekende studies ...

In deze video worden twee verwante technieken gedemonstreerd. De eerste is transplantatie van spermatogoniale stamcellen of SSC-transplantatie, en de tweede is test these tissues.Xenograft. SSC-transplantatie wordt gebruikt om spermatogenese op te wekken vanuit de SSC's van een donor in de testikels van een ontvanger.Dit wordt bereikt door een celsuspensie te bereiden van donor睾丸 of gekweekte cellen die SSC's bevatten van een donor met een identificeerbare transgene marker zoals GFP of LAC Z. Vervolgens worden de testis van het ontvanger곳mannelijk naar buiten gebracht. De ontvanger is behandeld zodat zijn testis ontdaan zijn van kiemcellen. De EENT-eendjes van het mannelijke ontvangerdier worden vervolgens geïsoleerd en geïnjecteerd met donorcellen die zijn gemengd met taan.Blauwe kleurstof. Uiteindelijk vindt kolonisatie van het seminifere epitheel van de ontvanger plaats. Kolonisatie van de tubuli seminiferi door kiemcellen van de donor is zichtbaar twee tot drie maanden na transplantatie, in dit voorbeeld waargenomen via xal-kleuring van de testikels van de ontvanger, wat de kolonisatie van lack Z-expresserende donorcellen aantoont.De tweede techniek die in deze video wordt gede

germ-cell-transplantation-and-testis-tissue-xenografting-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode voor het betrouwbaar enten van luciferase-gemerkte menselijke maligne perifere zenuwschede tumorcellen in de heupzenuw van immunodeficiënte muizen wordt beschreven. Het gebruik van bioluminescentie imaging om een ​​goede invoering van de tumor enten en criteria voor willekeurige scheiding van dieren in studiegroepen aan te tonen worden ook besproken.

Orthotope Xenografting van de Mens Luciferase-label maligne perifere zenuwschede tumorcellen voor In vivo Het testen van de kandidaat-therapeutische middelen

Een eenvoudige methode voor het afleiden van en onderhouden van SSC en stamceltransplantatie lijnen van volwassen muizen wordt hier gepresenteerd. De werkwijze gebruikt voedingscellen afkomstig van de somatische cel compartiment van de volwassen muis testis. Deze techniek is voor het gemeenschappelijk muizenstammen, inclusief transgene, knock-out en knock-in muizen.

Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC&#39;s) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.

Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen

De gevestigde techniek om primaire invasieve orthotoop blaaskanker xenotransplantaten te enten vereist laparotomie en mobilisatie van de blaas. Deze procedure toebrengt significante morbiditeit op de muizen, technisch uitdagend en tijdrovend. Daarom hebben wij een hoge precisie, percutane benadering gebruik te maken van echografie begeleiding.

Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts

Dit manuscript beschrijft een methode die wordt gebruikt om xenografts (PDX's) van prostaatkankerpatiënten te genereren vanuit circulerende tumorcellen (CTC's). Het genereren van PDX-modellen uit CTC's biedt een alternatief experimenteel model om prostaatkanker te bestuderen; de meest vaak gediagnosticeerde tumor en een frequente doodsoorzaak door kanker bij mannen.

Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Complexe menselijke ziekten kunnen lastig zijn om te modelleren in traditionele laboratoriummodel systemen. Hier beschrijven we een chirurgische benadering om de menselijke spierziekte te modelleren door de transplantatie van menselijke skeletspier biopsieën in immunodeficiënte muizen.

Het uitvoeren van menselijke skeletspieren xenografts in Immunodeficiënte muizen

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke huid kan worden geënt op niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketen receptor (NSG) muizen. Een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van de menselijke huid voor transplantatie, de voorbereiding van muizen voor transplantatie, transplantatie van de menselijke huid van gespleten dikte en de herstelprocedure na de transplantatie zijn opgenomen in het rapport.

Xenograft huidmodel om menselijke immuunresponsen in vivo te manipuleren

Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.

Muis Ronde Spermatide Injectie

Leer kiemceltransplantatie en testisweefselxenografting in muizen voor reproductiebiologisch onderzoek. Deze technieken identificeren spermatogoniale stamcellen en bestuderen zaadcelontwikkeling in vivo.

Germ Cell Transplantation en de testis weefsel Xenografting in Muizen

Meer video's verkennen