Diagnose van longtuberculose met de Xpert MTB / RIF Test

Het algemene doel van deze procedure is om binnen twee uur gelijktijdig mycobacterium, tuberculosis en rifampicine-resistentie aan te tonen in opgehoest sputum of geconcentreerde sputumsedimenten. Begin met een eenvoudig, zeer effectief protocol voor de descontaminatie van de monsters. Breng vervolgens elk bewerkt monster over naar een wegwerp-expert M-T-B-R-I-F cartridge voor eenmalig gebruik, waarin de PCR-reagentia zitten en waar het PCR-proces plaatsvindt.

Plaats de cartridges in een gene expert DX-systeem en start de ultra-gevoelige HEMI-nested PCR voor de gelijktijdige detectie van Mycobacterium tuberculosis en rifampicine-resistentie. Lees ten slotte de testresultaten af en rapporteer deze aan de arts. De expert MTPR-assay is bedoeld voor gebruik met monsters van patiënten bij wie een klinisch vermoeden is van pulmonale tuberculose en die voldoen aan de criteria zoals beschreven in de begeleidende tekst.

Let op dat dit niet gebruikt mag worden voor het monitoren van de effecten van een medicamenteuze therapie. Kristal. Een technicus uit mijn laboratorium zal nu het protocol demonstreren volgens standaard twee van de internationale standaarden voor tuberculosezorg. Neem twee monsters af voor bacteriologisch onderzoek bij elke patiënt met een vermoeden van pulmonale tb.

Wijs één GeneXpert DX-systeemmodule toe voor elk testmonster en label elke cartridge met het monster-id. Breng vervolgens voor elke monsteranalyse één milliliter sputum over naar een conische schroefbuis van 15 milliliter met een andere steriele transferpipet. Voeg twee milliliter M-T-B-R-I-F monsterreagens toe.

Sluit het dopje stevig. Schud de buis 10 tot 20 keer. Laat de buis vervolgens vijf minuten rechtop staan bij kamertemperatuur na het stevig schudden van de buis.

Equilibreer opnieuw gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Controleer of alle monsters ED zijn zonder zichtbare klonters sputum. Label eerst de cartridges met het monster-ID van elk sputumsedimentmonster. Voeg aan elk sedimentmonster 1,5 milliliter M-T-B-R-I-F monsterreagens toe en breng 0,5 milliliter over naar een conische schroefnaadbuis van 15 milliliter. Plaats het deksel terug, vortex gedurende 30 seconden en zet de buis vijf minuten rechtop na een tweede keer.

Meng de monsters met een vortexmixer en laat de buisjes 10 minuten rechtop staan. Inspecteer de vloeibare monsters om te controleren of er geen klonten sputum meer aanwezig zijn. Koppel het label op de buisjes aan de overeenkomstige cartridges.

Open de cartridge pas wanneer u klaar bent om de test uit te voeren en gebruik de cartridge binnen 30 minuten na het openen van het cartridgedeksel. Aspireer met de steriele transferpipet het vloeibare monster totdat de meniscus boven de minimummarkering staat. Laad het monster langzaam in de cartridge.

Sluit het deksel van de cartridge. Start de test binnen 30 minuten na het toevoegen van het monster aan de cartridge. Schakel eerst de computer in en daarna het instrument op het bureaublad.

Dubbelklik op het gene expert DX-icoon. Log in op de systeemsoftware. Selecteer 'create test' om het dialoogvenster voor het scannen van de barcode van de cartridge te openen.

Typ vervolgens de monster-ID in en scan de barcode op de cartridge. Wanneer het venster voor het aanmaken van de test verschijnt, klikt u op 'start test' en voert u het wachtwoord in het dialoogvenster in. Open nu de deur van de instrumentmodule en plaats de cartridge.

Sluit de deur om de test te starten. Wanneer het groene licht uitgaat, is de test voltooid. Zodra het systeem de deurvergrendeling ontgrendelt, opent u de deur van de module en verwijdert u de cartridge.

Voer tot slot de gebruikte cartridges af in de juiste afvalbakken. Elke testcartridge bevat reagentia voor QPCR van rifampicine-resistentie van het Mycobacterium tuberculosis complex, evenals de passende experimentele controles. De probe check-controle verifieert de rehydratie van de reagentia, het vullen van de PCR-buis in de cartridge, de integriteit van de probe en de stabiliteit van de kleurstof.

De monsterverwerkingscurve dient als positieve controle voor de adequate verwerking van de doelbacteriën en geeft tevens de aanwezigheid van eventuele PCR-inhibitoren aan. De primers zijn ontworpen om onderscheid te maken tussen de geconserveerde wildtype-sequentie en mutaties in de kernregio van het RPOB-gen die geassocieerd zijn met RIF-resistentie. De CT-waarden zijn omgekeerd proportioneel aan de concentratie van het doel-M-T-B-D-N-A-sjabloon in het testmonster.

Het dialoogvenster met het testresultaat concludeert dat het MTB-doel-DNA is gedetecteerd en dat RIF-resistentie niet is gedetecteerd in dit patiëntmonster. Het MTB-doel-DNA is in lage concentraties gedetecteerd met een indicatie van rifampicine-resistentie. Beide controles, SPC en PCC, voldoen aan de vastgestelde acceptatiecriteria.

Dit assayresultaat wordt als ongeldig beschouwd omdat de SPC negatief is en PCR-producten afwezig zijn. Ofwel het monster is niet correct verwerkt, of de PCR is geremd. Herhaal de assay.

Zoals u in de video heeft gezien, is de test gestandaardiseerd en vereist deze slechts een matige laboratoriuminfrastructuur en training. Daarom ben ik van mening dat de expert M-T-B-R-F assay het potentieel heeft om gestandaardiseerde, sensitieve en zeer specifieke diagnostische tests voor zowel tuberculose als rifampicine-resistentie toegankelijk te maken in universele point-of-care settings.