Detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van Fotoakoestisch Flowmetry

Het doel van het volgende experiment is om de aanwezigheid van kanker te detecteren voordat er secundaire tumoren worden gevormd. Dit wordt bereikt door eerst bloedmonsters van patiënten met melanoom in stadium vier te verkrijgen en te scheiden. In een tweede stap wordt het bloed in een fotoakoestische doorstroomkamer gebracht, waardoor detectie en isolatie van melanoomcellen mogelijk is.

Vervolgens worden de gevangen cellen afgebeeld om de aanwezigheid van gedetecteerd melanoom te bevestigen. De resultaten tonen het vermogen van het systeem om melanoomcellen nauwkeurig en snel te detecteren en te isoleren op basis van foto-akoestische golfvormen en celbeeldtechnieken. Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het detecteren van circulerende melanoomcellen, zoals R-T-P-C-R, biomes Magnetic Cell Sorting en andere methoden, is dat onze methode labelvrij is en het mogelijk maakt om circulerende melanoomcellen te vangen zonder hun oppervlak te wijzigen of ze aan een substraat te bevestigen.

Om een monster voor te bereiden voor de detectie van metastaserende kanker, begint u met het afnemen van ongeveer 10 milliliters volbloed van een patiënt met kanker in stadium vier. Centrifugeer de buizen in twee vijf milliliter vacutainer-buizen gedurende 10 minuten. Bij 3000 RPM zal het bloedmonster scheiden in drie verschillende lagen. De onderste laag bestaat uit de erytrocyten.

De middelste laag, ook wel de buffy coat genoemd, bevat leukocyten en melanomcellen, en de bovenste laag bevat plasma en bloedplaatjes. Verwijder zoveel mogelijk plasma zonder de buffy coat te verstoren. Voeg 250 µL van de opaque 10 77 toe aan twee milliliter troop tubes.

Gebruik een negen inch pasteurpipet om het resterende plasma, de volledige buffylaag en de bovenste laag erytrocyten te extraheren. Zorg ervoor dat er minder dan 500 µL wordt verzameld. Breng de oplossing over in de eerder voorbereide wind Trobe-buisjes.

Het bloed zal opnieuw scheiden, maar deze keer zullen de erytrocyten worden gescheiden door de hispa, waardoor de Buffy coat eenvoudig kan worden geëxtraheerd. Gebruik een Pesa-pipet van negen inch om de gehele Buffy coat te isoleren en plaats deze in een eend orph-buis van twee milliliter. Suspendeer deze vervolgens in 1,5 milliliter PBS met 2% volume per volume tussen 20.

Om een flowkamer te construeren, begint u met een acrylcilinder van acht millimeter lang met een buitendiameter van 20 millimeter en een binnendiameter van 17 millimeter. Boor vervolgens drie gaten met een diameter van vijf millimeter door de zijkant van de cilinder, in hoeken van 90 graden ten opzichte van elkaar. Snijd daarna drie stukken polymeerslang af en plaats deze in de geboorde gaten.

Span parafilm over de onderkant van de acrylring om een waterdichte afsluiting te maken. De parafilm vormt samen met de acrylring een ondiepe kom waarin de acrylamide-oplossing wordt gehouden die de stroomkamer zal vormen. Hang een draad met een diameter van 1,6 millimeter door de stukken buis die direct tegenover elkaar liggen, waarbij u erop let dat alleen de draad zichtbaar is door het midden van de ring in het derde stuk buis.

Voeg een draad met een diameter van 1,6 millimeter in en positioneer de buis op een afstand van één millimeter van de opgehangen draad. Deze draden voorkomen dat acrylamide in de buis terechtkomt. Bereid vijf milliliters acrylamide voor.

Giet het mengsel vervolgens snel in de acrylring en vul deze tot de rand. Na enkele seconden zal de oplossing geleren. Om een mal voor de stroomkamer te maken, worden de draden voorzichtig verwijderd, waarbij erop wordt gelet dat de acrylamidegel niet wordt verstoord, zodat er een cilindrisch stroompad overblijft en een plek ontstaat om een optische vezel op het stroompad te richten.

De stroomkamer is nu klaar voor gebruik met echogel voor akoestische koppeling. Koppel een piëzo-elektrische akoestische transducer van polyvinylideenfluoride direct boven het stroompad aan de stroomkamer. Verbind de transducer via een bajonetsluiting of BNC-kabel met de ingang van een breedbandontvanger.

Verbind de uitgang van het filter met de oscilloscoop om de oscilloscoop te triggeren. Plaats een fotodiode nabij de transducer en gebruik een B NNC-kabel om deze op de oscilloscoop aan te sluiten. Trek de kleine slang van de flowkamer naar buiten totdat er een kleine luchtbel ontstaat en koppel deze aan de transducer.

Voer vervolgens de optische vezel in en vul de pocket met water om interfacesignalen te verminderen en de hoeveelheid laserlicht die op het stroompad wordt gericht te verhogen. Vanwege de numerieke apertuur van de optische vezel en de korte afstand tot het stroompad zal de laser op elk gegeven moment slechts één slug van het monster bestralen, waardoor wordt gegarandeerd dat het monster direct vóór de laser hetzelfde monster is dat de foto-akoestische signalen genereert.

Bevestig vervolgens een T-connector aan één arm van de stroomkamer en twee spuitpompen aan de andere takken van de connector. Eén spuit bevat lucht, terwijl de andere de eerder bereide celsuspensie bevat. Start daarna beide spuitpompen.

Wanneer de twee toelaatbare vloeistoffen de T-splitsing bereiken, worden ze verdeeld in homogene slugs en stromen ze langs de transducer. Bestraal het stromende monster met een nanoseconde-pulslaser om fotoakoestische golven in de melanomcellen op te wekken. Omdat melanine een breedbandige optische absorber is, kan elke zichtbare lasergolflengte worden gebruikt.

Een signaal op de oscilloscoop wanneer een slug zich bovenop de transducer bevindt, geeft aan dat de slug melanoma bevat. Volg deze door het systeem voordat deze in een opvangbuisje wordt gedeponeerd. Om monsters voor immunocytochemie voor te bereiden, worden glazen objectglazen in cytotrechters geplaatst en in de cytospin geladen voor centrifugatie, zodat de opgevangen cellen beter aan de objectglazen hechten.

Breng 100 µL 1% BSA in PBS aan in elke trechter. Centrifugeer vervolgens gedurende drie minuten bij 600 RPM. Voeg na centrifugatie de celmonsters toe voor de CyTOF-trechters en centrifugeer opnieuw gedurende drie minuten bij 600 RPM.

Spray de objectglazen met een fixatief op basis van ethanol. Was de objectglazen vervolgens twee keer gedurende 10 minuten in PBS om aspecifieke binding te blokkeren. Incubeer elk objectglas gedurende één uur bij kamertemperatuur met een mengsel van 10 µL geitenserum en 90 µL PBS.

Giet na de incubatie de slides af en voeg de primaire antilichaamoplossing toe. Elke slide moet 1% rabbit mark, één 1% mouse CD 45 en 10% goat serum in PBS bevatten; incubeer gedurende één uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was de slides vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in PBS.

Incubeer de objectglazen vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker met de juiste fluorescerende secundaire antilichamen en giet het medium van de objectglazen af. Was ze vervolgens drie keer gedurende vijf minuten in PBS. Om de kernen te kleuren, worden de cellen één minuut geïncubeerd met 0,1 µg/mL DPI. Giet daarna het medium van de objectglazen af en was ze in PBS.

Monteer ten slotte met een op hars gebaseerd monteermedium een dekglas over het celmonster, verzegel het dekglas met transparante nagellak en maak beelden met een fluorescentiemicroscoop. De fotoakoestische golfvormen van witte bloedcellen en melanomacellen worden hier links getoond. De witte bloedcellen hebben geen inherente pigmentatie, produceren geen fotoakoestische golven en manifesteren zich rechts als een vlakke lijn van elektronische ruis.

De gepigmenteerde melanomcellen produceren echter een robuuste foto-akoestische golf. Na immunocytochemische kleuring vertonen gecultiveerde melanomcellen vlekkerige signalen in het blauw; één gemarkeerde cel is in een groene overlay weergegeven voor DPI en één is gemarkeerd met CD 45 als indicator voor leukocyten. Deze figuur toont melanomcellen tussen verschillende witte bloedcellen na diens ontwikkeling.

Onze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van kankerdetectie om het fenomeen van metastase te onderzoeken, om zo zowel de detectie van kanker te verbeteren als uiteindelijk de fatale verspreiding ervan te genezen.