Name: Detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van Fotoakoestisch Flowmetry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer circulerende melanoomcellen detecteren en isoleren met fotoakoestische flowmetrie voor vroege kankerdiagnostiek. Deze labelvrije methode identificeert cellen snel zonder hun oppervlakte-eigenschappen te veranderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de steun van de Afdeling Biologische Engineering en de Christopher S. Bond Life Sciences Center van de Universiteit van Missouri. Wij erkennen subsidies uit Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 en NIH R21CA139186-0. We danken ook de Life Sciences Undergraduate Research Opportunity Program aan de Universiteit van Missouri, de Universiteit van Missouri Moleculaire Cytologie Core, en de Universiteit van Missouri College of Engineering voor financiële steun.

1. Bloedmonster voorbereiding <ol><li> Trek ongeveer 10 ml volbloed van een Fase IV kankerpatiënt in twee 5 ml vacutainers. </li><li> Centrifugeer de buizen tien minuten bij 3000 omwentelingen per minuut (rpm). </li><li> Het bloedmonster wordt gescheiden in drie verschillende lagen: de onderste laag bestaat uit de erytrocyten, de middelste laag, ook wel de buffy coat, bevat leukocyten en melanoom cellen, en de bovenste laag bevat plasma en bloedplaatjes. Verwijder zoveel plasma mogelijk zonder verstoring van de buffy coat. </li><li> Plaats 250 pi van Histopaque 1077 in twee 1 mL Wintrobe buizen. </li><li> Met behulp van een 9 &quot;Pasteur pipet, extract van de resterende plasma, de gehele buffycoat, en zelfs de bovenste laag van de erytrocyten, en zorg ervoor dat &lt;500 pi te verzamelen. </li><li> Plaats de oplossing bovenop de Histopaque laag en centrifugeer de Wintrobe tubes in 15 ml conische buizen gedurende 10 minuten bij 3000 rpm. </li><li> Het bloed zal opnieuwapart, maar deze keer van de erytrocyten wordt gescheiden door de Histopaque, zorgen voor gemakkelijke extractie van de buffy coat. Gebruik een 9 &quot;Pasteur pipet om de hele buffycoat te verkrijgen en te plaatsen in een 2 ml eppendorfbuisje. </li><li> Hang de buffy coat in 1,5 ml PBS met 2% v / v Tween 20. </li></ol> 2. Flow Chamber Bouw <ol><li> Verkrijgen van een acryl-cilinder, 20 mm buitendiameter, 17 mm inwendige diameter, en 8 mm hoog. Boor drie gaten met een diameter van 5 mm door de zijkant van de cilinder op 90 graden hoeken van elkaar. Knip drie stukken van polymeer buis (1,6 mm inwendige diameter, 5 mm buitendiameter) en plaats ze in de geboorde gaten. </li><li> Stretch Parafilm over de bodem van de acryl ring om een ​​waterdichte afdichting te maken. De Parafilm vormt een ondiepe kom met de acryl ring en houdt de acrylamide-oplossing die een stromingskamer zal vormen. </li><li> Schorsing van een 1,6 mm diameter draad door de stukken van de buis, die tegenoverelkaar, zorg ervoor dat de draad alleen al is zichtbaar door het midden van de ring. Vul het derde stuk van de buis met een diameter van 1,6 mm draad en de positie van de buis 1 mm afstand van de geschorste draad. Deze draden te voorkomen dat acrylamide bij het invoeren van de slang. Na de acrylamide stolt, de draden worden uitgepakt, waardoor een cilindrische stroom pad en een plek om een ​​optische vezel positie richt zich op de stroom weg. </li><li> Voeg 5 ml van de bereide acrylamide [20 g acrylamide (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml gedestilleerd water] om een ​​kleine beker. Meet 0,02 g ammoniumpersulfaat (Sigma) en voeg deze toe aan de beker. Meng met een roer bar voor 3 minuten. Voeg 20 ul tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) om de beker. Snel giet het mengsel in de acryl ring, vullen naar de top. Na een paar seconden, zal de oplossing gel, waardoor een stromingskamer mal. Trek de draden uit, en zorg ervoor dat u de acrylamide gel verstoren. De stroom chamber is nu klaar voor gebruik. </li></ol> 3. Fotoakoestische flowmetry set-up <ol><li> Akoestisch echtpaar een polyvinylideenfluoride piëzo-elektrische akoestische transducer (Panametrics) om een ​​stromingskamer met behulp van echografie gel direct boven de stroom weg. </li><li> Met behulp van een Bayonet Neill-Concelman (BNC) kabel, sluit de transducer op de ingang van een RITEC breedband-ontvanger-640A (lowpass filter: out, highpass filter: 1 MHz, imput impedantie: 50 Ohm, versterking: 35 dB). Verbind de uitgang van het filter om de oscilloscoop (Tektronix TDS 2024B). Om leiden tot de oscilloscoop, is een fotodiode (Thorlabs) opgezet in de buurt van de transducer en is aangesloten op de oscilloscoop met behulp van een BNC-kabel. </li><li> Een t-connector (Small Parts) is bevestigd aan een arm van de stroming kamer. Twee spuit pompen (Braintree Scientific) zijn verbonden met de andere takken van de connector. Een spuit bevat de lucht, terwijl de andere bevat de celsuspensie bereid in deel 1. Stel het debiet aan100 ul / minuut. </li><li> Pak de kleine slang van de stroming kamer totdat er een zakje van de lucht vormen, en plaats een 1 mm diameter kern optische vezel met een 0,37 numerieke opening in dat slot. Vul de zak met water te gebruiken interface signalen te verminderen en de hoeveelheid van laserlicht worden toegepast om de stroom weg. Door de numerieke apertuur van de optische vezel en de korte afstand tot de stroom weg, zal de laser slechts bestralen een slok van het monster op een gegeven moment, ervoor te zorgen dat het monster direct voor de laser is het hetzelfde monster te creëren fotoakoestische signalen. De laser energie moet ongeveer 28 mJ / cm 2 zijn met een puntgrootte van 7 mm 2. </li><li> Draai beide spuit pompen op. Toen de twee niet-mengbare vloeistoffen de t-splitsing te bereiken zullen ze worden opgedeeld in homogene slakken en de stroom langs de transducer. </li><li> Bestralen de vloeiende monster met een nanoseconde gepulste laser fotoakoestische golven in de melanoom cellen te genereren. Als melanine is een broadben optische absorptie, kan elke zichtbare laser golflengte worden gebruikt. </li><li> Als er een signaal wordt weergegeven op de oscilloscoop als een slak is de top van de transducer, de slak bevat melanoom, en kunnen worden bijgehouden door middel van het systeem tot dropping in een verzameling flacon. </li></ol> 4. Immunocytochemie <ol><li> Neem de gevangen slakken op een Cytospin 4 Centrifuge (Thermo Scientific) om ze te bevestigen aan glazen dia&#39;s. Plaats glazen dia&#39;s in Cytofunnels (Shandon EZ Single Cytofunnel met Brown Filter Card Thermo Scientific) en laad ze in de Cytospin 4 Centrifuge. Doe 100 ul van 1% Bovine Serum Albumine (Sigma) in PBS in ieder trechter en centrifugeer op 600 toeren per minuut gedurende 3 minuten om te helpen de gevangen cellen zich aan het glas dia&#39;s. </li><li> Na het centrifugeren, voeg de cel monsters naar het Cytofunnels en centrifugeer bij 600 omwentelingen per minuut gedurende 3 minuten. Vervolgens spuit de dia&#39;s met een ethanol op basis van fixeermiddel. </li><li> Was de dia&#39;s in PBS gedurende 10 minuten twee keer. </li><li&gt; Om niet-specifieke binding te blokkeren, incubeer elke dia met een mengsel van 10 ul van Goat Serum (Sigma) en 90 pi PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Na de incubatie, giet de dia&#39;s en incubeer met het primaire antilichaam-oplossing gedurende 1 uur in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. Elke dia moet bevatten 1% MART-1 antilichaam opgewekt bij konijnen, 1% CD-45 antilichaam opgewekt in de muis, 10% Geit serum, en 89% PBS. </li><li> Na de incubatie, was de dia&#39;s in PBS gedurende 10 minuten drie keer. </li><li> De dia&#39;s worden dan geïncubeerd in een tweede antilichaam oplossing, die fluorofoor is gebonden aan de antilichamen. Het mengsel bevat 0,05% geit anti-konijn antilichaam, 0,05% geit anti-muis antilichaam, 0,1% geit serum, en 99% PBS. De dia&#39;s worden geïncubeerd in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Na de incubatie, giet het wassen van de objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten drie keer. </li><li> Om vlek voor een kern, Incubeer de cellen met 0,1 ug / ml DAPI (Invitrogen) voor1 minuut. Dan decanteren de dia&#39;s en wassen in PBS. </li><li> Monteer een dekglaasje over de cel monster met behulp van 20 ul van een hars op basis van montage media per dia. Dicht het dekglaasje met duidelijke nagellak aan de dia te bewaren. Nu de dia&#39;s zijn klaar om te worden afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Fotoakoestische golfvormen van witte bloedcellen en melanoomcellen worden hier weergegeven. De witte bloedcellen, die geen inherente pigmentatie, produceren geen fotoakoestische golven en zich manifesteren als een vlakke lijn van elektronische ruis (links). De gepigmenteerde melanoom cellen levert een robuuste fotoakoestische golf (rechts). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Na immunocytochemische kleuring, gekweekte melanoomcellen zien DAPI signalen in blue terwijl MART1 is gemarkeerd in het groen. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Overlay beelden voor DAPI en MART1, zoals in figuur 2, met CD45 als een indicator van leukocyten, dit figuur toont melanoomcellen tussen verschillende witte bloedcellen.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li>
<li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li>
<li>Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).</li>
<li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li>
<li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li>
<li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li>
<li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li>
<li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li>
<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

John A. Viator is oprichter en voorzitter van Viator Technologies Inc, een bedrijf opgericht om fotoakoestische technologieën te commercialiseren voor de verbetering van de menselijke gezondheid.

Het detecteren van CTC is nog steeds een onderzoek intensief gebied met zeer weinig klinische toepassingen te wijten aan het moeilijke probleem van het isoleren van de zeldzame tumor cellen. Veel andere technieken worden geëvalueerd voor CTC detectie, met inbegrip RT-PCR, microfluïdische cel vast te leggen, immunomagnetische vangen, en andere methoden 8-12. Echter, fotoakoestische detectie van CMC&#39;s toont belofte want het is vrij label en biedt een snelle en accurate manier om klein, licht absorberende deeltjes op te vangen. Het protocol beschreven om witte bloedcellen te isoleren is zeer efficiënt, maar toch een laag aantal rode bloedcellen aanwezig in het monster. Deze rouge contaminerende cellen ook laserlicht te absorberen, maar op een sterk verminderd niveau. Om ervoor te zorgen de rode bloedcellen niet bemoeien met onze melanoom detectiesysteem, werden vijf gezonde patiënten monsters ingevoerd door het systeem en niemand gaf een signaal, wat aangeeft dat de rode bloedcellen aanwezig zijn bij lage concentraties voldoendebuiten beschouwing gelaten. Een reeks van concentratie studies zijn uitgevoerd met behulp van gekweekte melanoomcellen en het fotoakoestische flow systeem is gevoelig tot 1 cel / ul (ongepubliceerde gegevens) bewezen. Deze studies zijn aan de gang en zal binnenkort onder meer proeven met kankerpatiënten monsters. Dit fotoakoestische techniek wordt ook geëvalueerd voor gebruik in niet-gepigmenteerde CTC, zoals borst-en prostaatkanker door het aanbrengen van exogene chromoforen. Wij hebben voorbereidende werk met behulp van gouden nanodeeltjes op kanker cells13. Deze testen hebben aangetoond dat nanodeeltjes kunnen de nodige optische absorptie te verstrekken aan fotoakoestische golven te genereren. De resterende technische uitdaging is om dergelijke deeltjes selectief hechten aan kankercellen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van fotoakoestisch flowmetry

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulerende tumorcellen (CTC&#39;s) zijn de cellen die zijn gescheiden van een macroscopische tumor en de verspreiding door het bloed en de lymfe systemen om zaad secundaire tumoren 1,2,3. CTC zijn indicatoren van gemetastaseerde ziekte en hun detectie in bloedmonsters kunnen worden gebruikt om kanker te diagnosticeren en monitoren van een patiënt respons op therapie. Aangezien de CTC zijn zeldzaam, bestaande uit ongeveer een tumorcel te midden van miljarden van normale bloedcellen in gevorderde kankerpatiënten, hun opsporen en kwantificeren is een moeilijke taak. We gebruik maken van de aanwezigheid van pigment in de meeste melanoom cellen te genereren fotoakoestische of laser-geïnduceerde ultrasone golven in een aangepaste flowcytometer voor de detectie van circulerende melanoom cellen (CMC&#39;s) 4,5. Dit proces houdt in het scheiden van een volbloed monster met behulp van centrifugeren en het verkrijgen van de witte bloedcellen laag. Indien aanwezig in volbloed, zal CMC scheiden met de witte bloedcellen als gevolg van soortgelijke dichtheid. Deze cellen worden geresuspendeerd infosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïntroduceerd in de flowmeter. In plaats van een continue stroom van het bloed celsuspensie, we geïnduceerde twee fase stroming in om deze cellen te vast te leggen voor verdere studie. In twee fase stroming, twee niet-mengbare vloeistoffen in een microfluïdische systeem aan op een kruispunt en vormen afgewisseld slakken van vloeibare 6,7. PBS zwevende witte bloedcellen en de lucht vormen microliter slakken die opeenvolgend worden bestraald met laserlicht. De toevoeging van een oppervlakte-actieve stof van de vloeibare fase laat uniform slug vorming en de gebruiker kan verschillende afmetingen slakken te creëren door het veranderen van het debiet van de twee fasen. Slakken van lucht en naaktslakken van PBS met witte bloedcellen bevatten geen licht absorberen en dus, produceren geen fotoakoestische golven. Echter, naaktslakken van de witte bloedcellen die zelfs enkele CMC&#39;s bevatten absorberen laserlicht en produceren hoogfrequente geluidsgolven. Deze slakken die fotoakoestische golven te genereren worden afgezonderd en verzameld voor cytochemische kleuring voor verificatie van CMC&#39;s.

We hebben een flowcytometer met behulp van laser-geïnduceerde echografie op te sporen circulerende melanoom cellen als een vroege indicator van gemetastaseerde ziekte.

Detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van Fotoakoestisch Flowmetry

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn cellen die zich hebben losgemaakt van een macroscopische tumor en zich via het bloed- en lymfestelsel hebben verspreid om ...

Het doel van het volgende experiment is om de aanwezigheid van kanker te detecteren voordat er secundaire tumoren worden gevormd. Dit wordt bereikt door eerst bloedmonsters van patiënten met stadium vier melanoom te verkrijgen en te scheiden. Als tweede stap wordt het bloed in een fotoakoestische flowkamer geïntroduceerd, waardoor detectie en isolatie van melanoomcellen mogelijk worden.Vervolgens worden de gevangen cellen afgebeeld om de aanwezigheid van gedetecteerd melanoom te bevestigen. De resultaten tonen het vermogen van het systeem om melanoomcellen nauwkeurig en snel te detecteren en te isoleren op basis van foto-akoestische golfvormen en celbeeldtechnieken. Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het detecteren van circulerende melanoomcellen, zoals R-T-P-C-R, biomagnetische celselectie en andere methoden, is dat onze methode labelvrij is en het mogelijk maakt om circulerende melanoomcellen te vangen zonder hun oppervlak te wijzigen of ze aan een substraat te bevestigen.Om een monster voor te bereiden voor de detectie van metastatische kanker, begint u met het afnemen van ongeveer 10 milliliters volbloed van een patiënt met kanker in stadium vier. Centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten in twee vacutainers van vijf milliliter. Bij 3000 RPM zal het bloedmonster scheiden in drie verschillende lagen. De onderste laag bestaat uit de erytrocyten.De middelste laag, ook wel de buffy coat genoemd, bevat leukocyten en melanomcellen, en de bovenste laag bevat plasma en bloedplaatjes. Verwijder zoveel mogelijk plasma zonder de buffy coat te verstoren. Voeg 250 µL van his opaque 10 77 toe aan tweemilliliter troop tubes.Gebruik een pastelpipet van negen inch om het resterende plasma, de gehele buffylaag en de bovenste laag erytrocyten te extraheren. Zorg ervoor dat er minder dan 500 µL wordt verzameld. Breng de oplossing over in de eerder voorbereide wind Trobe-buisjes.Het bloed zal opnieuw scheiden, maar deze keer zullen de erytrocyten worden gescheiden door de hispa, waardoor de Buffy coat eenvoudig kan worden geëxtraheerd. Gebruik een Pesa-pipet van negen inch om de gehele Buffy coat te isoleren en plaats deze in een eend orph-buis van twee milliliter. Suspendeer deze vervolgens in 1,5 milliliter PBS met 2% volume per volume tussen 20.Om een stroomkamer te construeren, begint u met een acryl cilinder van acht millimeter lang met een buitendiameter van 20 millimeter en een binnendiameter van 17 millimeter. Boor vervolgens drie gaten van vijf millimeter diameter door de zijkant van de cilinder in hoeken van 90 graden ten opzichte van elkaar. Snijd daarna drie stukken polymeerslang en plaats deze in de geboorde gaten.Span parafilm over de onderkant van de acrylring om een waterdichte afsluiting te maken. De parafilm vormt samen met de acrylring een ondiepe kom waarin de acrylamide-oplossing wordt opgevangen om een stroomkamer te vormen. Span een draad met een diameter van 1,6 millimeter door de stukken buis die direct tegenover elkaar staan, waarbij u erop let dat alleen de draad zichtbaar is door het midden van de ring in het derde stuk buis.Voeg een draad met een diameter van 1,6 millimeter in en positioneer de buis op één millimeter afstand van de opgehangen draad. Deze draden voorkomen dat acrylamide in de buisjes terechtkomt. Bereid vijf milliliters acrylamide voor.Giet het mengsel vervolgens snel in de acrylring en vul deze tot aan de bovenkant. Na enkele seconden zal de oplossing geleren. Trek de draden voorzichtig uit om een mal voor de stroomkamer te maken, waarbij u erop let dat de acrylamidegel niet wordt verstoord, zodat er een cilindrisch stroompad overblijft en een plek om een optische vezel te positioneren die op het stroompad is gefocust.De stromingskamer is nu klaar voor gebruik met ultrasone gel voor akoestische koppeling. Koppel een polyvinylideenfluoride-piëzo-elektrische akoestische transducer rechtstreeks boven het stroompad aan de stromingskamer. Verbind de transducer via een bajonetsluiting of BNC-kabel met de ingang van een breedbandontvanger.Verbind de uitgang van het filter met de oscilloscoop om de oscilloscoop te triggeren. Plaats een fotodiode nabij de transducer en sluit deze met een B NNC-kabel aan op de oscilloscoop. Trek de kleine slang van de doorstroomkamer naar buiten totdat er een kleine luchtbel ontstaat en koppel deze aan de transducer.Voeg vervolgens de optische vezel in en vul de pocket met water om interfacesignalen te verminderen en de hoeveelheid laserlicht die op het stroompad wordt gericht te vergroten. Vanwege de numerieke apertuur van de optische vezel en de korte afstand tot het stroompath zal de laser op elk gegeven moment slechts één slug van het monster bestralen, waardoor wordt gegarandeerd dat het monster direct vóór de laser hetzelfde monster is dat de foto-akoestische signalen genereert.Bevestig vervolgens een T-stuk aan één arm van de stroomkamer en twee spuitpompen aan de andere takken van het T-stuk. Eén spuit bevat lucht, terwijl de andere de eerder bereide celsuspensie bevat. Start vervolgens beide spuitpompen.Wanneer de twee toelaatbare vloeistoffen de T-splitsing bereiken, worden ze verdeeld in homogene slugs en stromen ze langs de transducer. Bestraal het stromende monster met een nanoseconde-pulslaser om fotoakoestische golven in de melanomcellen op te wekken. Aangezien melanine een breedbandige optische absorber is, kan elke zichtbare lasergolflengte worden gebruikt.Een signaal op de oscilloscoop wanneer een slug zich bovenop de transducer bevindt, geeft aan dat de slug melanoma bevat. Volg deze door het systeem voordat deze in een opvangbuisje wordt gedeponeerd. Om monsters voor immunocytochemie voor te bereiden, worden glazen objectglazen in cyto-trechters geplaatst en in de cytospin geladen voor centrifugatie, zodat de opgevangen cellen beter aan de objectglazen hechten.Doe 100 µL 1% BSA in PBS in elke trechter. Centrifugeer vervolgens gedurende drie minuten bij 600 RPM. Voeg na centrifugatie de celmonsters toe aan de CyTOF-trechters en centrifugeer opnieuw gedurende drie minuten bij 600 RPM.Spray de objectglazen met een fixatief op ethanolbasis. Was de objectglazen vervolgens tweemaal 10 minuten in PBS om aspecifieke binding te blokkeren. Incubeer elk objectglas gedurende één uur bij kamertemperatuur met een mengsel van 10 microliters geitenserum en 90 microliters PBS.Giet na de incubatie de slides af en voeg de primaire antilichaamoplossing toe. Elke slide moet 1% konijnen-markering, één 1% muis CD 45 en 10% geiten serum in PBS bevatten; incubeer dit gedurende één uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was de slides vervolgens drie keer gedurende 10 minuten in PBS.Incubeer de preparaten vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker met de juiste fluorescerende secundaire antilichamen en giet het overschot weg. Was de preparaten vervolgens drie keer gedurende vijf minuten met PBS. Om de kernen te kleuren, worden de cellen gedurende één minuut geïncubeerd met 0,1 µg/mL DPI. Giet daarna het overschot weg en was de preparaten met PBS.Monteer tot slot met een op hars gebaseerd montagemedium een dekglas over het cellmonster, verzegel het dekglas met transparante nagellak en maak beelden met een fluorescentiemicroscoop. De fotoakoestische golfvormen van witte bloedcellen en melanomcellen worden hier links weergegeven. De witte bloedcellen, die geen inherente pigmentatie hebben, produceren geen fotoakoestische golven en manifesteren zich als een vlakke lijn van elektronische ruis aan de rechterkant.De gepigmenteerde melanomcellen produceren echter een sterke foto-akoestische golf. Na immunocytochemische kleuring vertonen gekweekte melanomcellen vlekkerige signalen in het blauw; één gemarkeerde cel is groen gemarkeerd in de overlay-afbeeldingen voor DPI, en één is gemarkeerd met CD 45 als indicator voor leukocyten. Deze figuur toont melanomcellen tussen verschillende witte bloedcellen na de ontwikkeling.Onze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van kankerdetectie om het fenomeen van metastase te onderzoeken, om zo zowel de kankerdetectie te verbeteren als uiteindelijk de fatale verspreiding ervan te genezen.

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the technique of isolating CD133 negative and positive melanoma stem cells from a primary melanoma cell line using magnetic-activated cell sorting. The CD133 positive melanoma CSCs are further studied to understand the mechanisms of melanoma tumorigenesis.

Melanoma Stem Cell Isolation: A Method to Obtain CD133 Positive and Negative Melanoma Cells Using Magnetic-activated Cell Sorting

In this video, we present a photoacoustic flow cytometric detection of ovarian cancer cells bearing nanoparticles in a circulating in vitro flow chamber. This non-invasive technique successfully identifies circulating tumor cells in a flow system utilizing a contrast agent.

In Vitro Photoacoustic Flow Cytometry: A Non-invasive Flow Photoacoustic Technique to Detect Nanoparticle-bearing Circulating Ovarian Cancer Cells

Source: Kalva, S. K., et al., Pulsed Laser Diode-Based Desktop Photoacoustic Tomography for Monitoring Wash-In and Wash-Out of Dye in Rat Cortical Vasculature. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for using photoacoustic imaging to observe changes in the cortical vessels of an anesthetized rat. The process includes baseline imaging, dye injection, and analysis of dye absorption and clearance during wash-in and wash-out.

Photoacoustic Monitoring of Dye Movement in Cortical Blood Vessels

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

We beschrijven twee complementaire methoden met behulp van de fluorescentie ubiquitinatie celcyclus indicator (FUCCI) en beeldanalyse of flowcytometrie om cellen in de binnenste G1-gearresteerde en buitenste proliferatieve regio's van 3D-sferoïden te identificeren en isoleren.

Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

Hier presenteren we een protocol om materiaal te schatten en oppervlakte optische eigenschappen met behulp van de fotoakoestische effect gecombineerd met een totale interne reflectie. Deze techniek vervallende veld-gebaseerde Fotoakoestiek kan worden gebruikt om een ​​fotoakoestische meetsysteem materialen 'dikten, bulk en dunne film brekingsindices schatting maken en staand hun optische eigenschappen.

Evanescent Field Gebaseerd Fotoakoestiek: Optical Property Evaluatie aan oppervlakken

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Een protocol wordt gepresenteerd voor het detecteren van circulerende ovariële tumorcellen met behulp van een op maat gemaakte photoacoustic flow systeem en gerichte foliumzuur-afgetopte koper sulfide nanodeeltjes.

Ovariële kanker detectie met Photoacoustic flow Cytometrie

Dit artikel beschrijft een workflow van technieken die worden gebruikt voor het testen van nieuwe kandidaat-mediatoren van melanoommetastase en hun werkingsmechanisme (s).

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerpen van een multiplex immunofluorescentie-antilichaampaneel voor op DNA-barcodes gebaseerde beeldvorming van muizen FFPE-melanoomweefsels. We beschrijven ook een pijplijn voor beeldanalyse met behulp van open-source tools voor het genereren van ruimtelijke proteomics-inzichten in de immuunmicro-omgeving van de muizenmelanoomtumor.

Op DNA-barcode gebaseerde multiplex immunofluorescentiebeeldvorming om FFPE-monsters van genetisch geherprogrammeerd muizenmelanoom te analyseren

Leer circulerende melanoomcellen detecteren en isoleren met fotoakoestische flowmetrie voor vroege kankerdiagnostiek. Deze labelvrije methode identificeert cellen snel zonder hun oppervlakte-eigenschappen te veranderen.

Detectie en isolatie van circulerende melanoom cellen met behulp van Fotoakoestisch Flowmetry

Meer video's verkennen