Monitoring eiwitadsorptie met Solid-state Nanoporiën

Het algemene doel van deze procedure is om nanoporiën in kunstmatige membranen te creëren voor gebruik in eiwitabsorptiestudies. Dit wordt bereikt door nanoporiën in een nitridemembraan te boren met behulp van een stang. Vervolgens wordt de nanopore in een kamer geladen en met een ionische oplossing bevochtigd.

Zodat vloeistof een brug vormt van de ene kant van de nanopore naar de andere om de nanopore klaar te maken voor experimenten. Er wordt een spanning over het nanopore aangelegd en een stroom van ionen kan worden waargenomen die erdoorheen passeert. De laatste stap is het toevoegen van eiwit aan de Nanopore kamer.

Uiteindelijk het waarnemen van langdurige blokkades in de ionenstroom door de nanopore onthult de absorptie van eiwitten aan de zijden van de Nanopore. Hallo, ik ben Dave Wicki. Ik ben een afgestudeerde student in het Department of Physics aan de Syracuse University.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de absorptie van eiwitten op anorganische oppervlakken. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals eiwit-, nucleïnezuurinteracties, enkele molecuul voor spectroscopie, en de studie van moleculen in beperkte ruimtes. Begin met het brengen van de stang naar een versnellingsspanning.

Laad vervolgens een SPI-siliciumnitride vensterrooster in de TEM-steekproefhouder. Reinig het rooster met zuurstofplasma gedurende 30 seconden om puin te verwijderen. Voordat u de steekproef laadt, laadt u de steekproefhouder in de TEM en laat u de vacuüm naar beneden pompen.

Gebruik de brightfield TEM-modus om het nitride venster te vinden, een helder vierkant op het ruwe rogram. Zorg ervoor dat de TEM goed is uitgelijnd. Richt en focus vervolgens de steekproef.

Schakel nu het systeem in STEM-modus en gebruik een hot off detector om de steekproef te beeld en de uitlijning ervan te controleren. Stel de monochroom indien aanwezig in op een lage waarde, waardoor er een hogere stroom van elektronen beschikbaar is voor boren. Selecteer de juiste spotgrootte om de Nanopore te boren op basis van de diameter van de elektronenstraal.

Met de stang uitgelijnd. Gebruik de BROGRAM om perfect te focussen op het nitridemembraan bij de vereiste vergroting. Als er enige beweging van de steekproef is, zet de elektronenstraal uit en wacht tot de steekproef is gestabiliseerd.

Dit kan tot een uur duren. Eenmaal gestabiliseerd, plaats de elektronenstraal op de steekproef en begin met het boren van de nanopore. Het boren van een nanopore met een TM vereist geduld en ontrouw.

Het is een proces waarbij nitride geleidelijk wordt verstrooid onder een elektronenstraal sonde. Het is belangrijk om de elektronenstraal direct boven de boorplaats te houden en te bevestigen dat de nanopore volledig is geboord. Voordat u de steekproef uit de TEM verwijdert, controleert u de steekproef periodiek door te scannen met de hot off detector.

Als de steekproef enigszins drijft, pas dan de positie van de elektronenstraal aan om boven de nanopore te zijn. Met de ROI gram in focus, zal de fonkelende nitridefilm verdwijnen. Wanneer de nanopore zich vormt met de roky gram uit focus, is de fray nail rand zichtbaar.

Beeld de nanopore af met de hot off en maak een intensiteitsprofiel van het beeld. De diameter van de nanopore kan worden geschat door de donkerste regio van het profiel. De elektronenstraal kan worden gebruikt om de nanopore te vergroten indien nodig.

Wanneer deze de vereiste diameter heeft. Schakel over naar TEM-modus met de monochroom in de standaardinstelling. Gebruik brightfield TEM om de poriegrootte te bevestigen.

Begin met het voorbereiden van degas di saline. Plaats de oplossing onder vacuüm en in een bad sonicator gedurende 20 minuten. Plaats voorzichtig de fragiele Nanopore bevattende siliciumnitride Chip in een 10 milliliter Pyrex beker. Plaats vervolgens in een afzuigkap de beker op een hot plate.

Maak de Nanopore chip zeer voorzichtig schoon met piranha-oplossing. Voeg eerst drie milliliter zwavelzuur toe aan de container met behulp van een glazen pipet. Voeg vervolgens voorzichtig een milliliter hoog waterstofperoxide toe aan het zwavelzuur.

Neem alle voorzorgsmaatregelen. Laat de nanopore chip 10 minuten weken. Verwijder vervolgens met een glazen pipet de piranha-oplossing uit de beker en doe deze op de juiste manier weg.

Vul vervolgens de beker met Degas gedeïoniseerd water. Gebruik een schone glazen pipet om de beker van water te legen en herhaal dit wassen minstens vijf keer. Verwijder met schone pincetten de nanopore chip en droog deze door lichte zuiging.

Eenmaal droog, verzegel de nanopore chip onmiddellijk in de kamer. De chip kan in de kamer worden bevestigd met O-ringen of siliconenkit. Vul de kamer met kaliumchloride-oplossing.

Verbind de zilver, zilverchloride elektroden met de kamer. Elektroden kunnen worden gemaakt door zilverdraad een nacht in bleekmiddel te weken. Leg een transmembraanpotentiaal over de elektroden aan en monitor de stroomrespons met behulp van een patch clamp versterker.

In de voltage clamp modus, construeer een stroom-spanningscurve van de metingen. De curve moet zeer lineair zijn. Bij gebruik van één molaar kaliumchloride, moet de geleidbaarheid van de nanopore overeenkomen met zijn diameter.

Als de nanopore geen lineaire IV-curve vertoont, is de geleidbaarheid te laag of is de open stroom van de nanopore niet stabiel. Dit geeft aan dat de nanopore niet goed is gelast en dat het piha-wassen moet worden herhaald. Zorg ervoor dat er vloeistof in de nanopore zit, is essentieel.

Als deze stap niet goed wordt uitgevoerd, zal de ionienstroom door de nanopore zeer grote ruis vertonen en zal de verdeling van eiwitten in de nanopore drastisch worden verminderd. Begin met het toevoegen van een gezuiverd steekproef van het eiwit van belang in het geaarde bad van de kamer. Wacht tot de steekproef grondig is gediffundeerd.

Breng een transmembraanpotentiaal spanningsbias aan met polariteit tegenover die van de totale lading van het eiwit dat wordt bestudeerd. Een toegepaste potentiaal van 200 millivolt zou groot genoeg moeten zijn om te observeren. De meeste eiwit analyyt gebeurtenissen zullen verschijnen als