Name: Monitoring eiwitadsorptie met Solid-state Nanoporiën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Verken het fabriceren van solid-state nanoporiën in siliciumnitridemembranen met STEM voor het monitoren van eiwitadsorptie op enkelmoleculair niveau. Deze methode biedt inzicht in eiwit-oppervlakte-interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia in Vancouver) en Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) bedanken voor hun advies. Dit werk is deels gefinancierd door subsidies van de Amerikaanse National Science Foundation (DMR-0706517 en de DMR-1006332) en de National Institutes of Health (R01-GM088403). De nanogaatje boren werd uitgevoerd op de Electron Microscopy Facility van de Cornell Center for Materials Research (CCMR) met steun van de National Science Foundation - Materials Science and Engineering Research Centers (MRSEC) programma (DMR 0520404). De voorbereiding van de siliciumnitride membranen werd uitgevoerd aan de Cornell nanoschaal Facility, een lid van het National Nanotechnology Infrastructure Network, die wordt ondersteund door de National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

1. Vervaardiging van solid-state nanoporiën in silicium nitride membranen <ol><li> Breng de FEI Tecnai F20 S / TEM tot een versnelling spanning van 200 kV. Bij gebruik van een ander S / TEM, moet de versnelling spanning groter dan of gelijk aan 200 kV 9 </li><li> Laad een 20 nm dikke SPI siliciumnitride venster rooster in de TEM monster houder en schoon met zuurstof plasma gedurende 30 seconden om alle verontreinigingen te verwijderen uit de houder. </li><li> Laad het monster in de S / TEM en zorgen voor de vacuüm pomp naar beneden. Zodra de S / TEM heeft gepompt tot vacuüm, vinden de nitride raam in bright-field TEM-modus door te zoeken naar een heldere plein aan de Ronchigram. Zorg ervoor dat de TEM goed is uitgelijnd, maak er een nette en focus van het monster. </li><li> Schakel de S / TEM in de STEM-modus. Gebruik de HAADF (of equivalent) detector om het imago van de monster en zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd. </li><li> Stel de Monochromator op een lage waarde. Een lagere waarde van de Monochromator zorgt voor een hogere valutat van elektronen beschikbaar zijn voor het boren. Als het S / TEM heeft geen Monochromator, deze stap overslaan. </li><li> Selecteer een geschikte plek formaat voor het boren van de nanogaatje. Dit komt overeen met de diameter van de elektronen probe. Een 3 nm sonde werkt goed voor het boren van 5 nm diameter poriën. Een grotere sonde (5 nm) zal sneller boren en creëren een grotere poriën. Een kleinere sensor (1 nm) zal het langer duren om te boren en een kleinere porie. </li><li> Stel de STEM uitlijningen, indien nodig. </li><li> Focus van de nitride membraan en breng het naar een vergroting van x1.3M. Fijn scherpstellen moet worden gedaan door het toezicht op de Ronchigram. </li><li> Als er een beweging van het monster, wacht dan op het monster te stabiliseren. Dit kan tot een uur. Lege de elektronenbundel terwijl u wacht, zodat er geen schade van de nitride. </li><li> Plaats de elektronen probe op het monster en beginnen boren. </li><li> Controleer regelmatig het monster door het scannen met de HAADF detector, zowel om te controleren of de nanogaatje is dri wordtgelogen (het zal er uitzien als een donkere vlek) en om te controleren of er is geen beweging van het monster. Als het monster zweeft een beetje, de positie van het elektron sonde op meer dan de nanogaatje. </li><li> Bekijk de Ronchigram te identificeren wanneer de porie heeft gevormd. Toen in focus, het nitride film heeft een glanzende uitstraling. Dit zal verdwijnen wanneer de nanogaatje formulieren. Aanbrengen van de Ronchigram enigszins onscherp maakt het mogelijk om te zien een Fresnel franje worden geassocieerd met het nanogaatje. </li><li> Maak een beeld van de nanogaatje met de HAADF. </li><li> Doe een intensiteit profiel van de nanogaatje beeld. De diameter van de nanogaatje kan geschat worden door de donkerste gebied van het profiel. </li><li> Uitbreiding van de nanogaatje kan worden uitgevoerd door het verplaatsen van de elektron sonde langs de randen van de porie. </li><li> Zodra de nanogaatje is van de gewenste diameter, zet de S / TEM in de TEM-modus. </li><li> Breng de Monochromator om de standaard instelling en het imago van de nanogaatje met behulp van bright-field TEM om de grootte te bevestigen <strong&gt; (Afb. 1). </li></ol> 2. Bevochtiging van de solid-state nanogaatje <ol><li> De-gas gedeïoniseerd water met 1 M KCl, 10 mM kalium-fosfaat, pH 7,4. Dit kan worden gedaan door de oplossingen onder vacuüm en ze in een bad ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten. </li><li> Plaats de nanogaatje met silicium nitride chip in een 10 ml Pyrex beker. Zorg ervoor dat u de nitride raam te breken want het is zeer delicaat. Plaats het bekerglas op een kookplaat in een zuurkast en ingesteld op 100 ° C. </li><li> Reinig de nanogaatje chip met piranha oplossing met behulp van grote zorg. Voegt u eerst 3 ml zwavelzuur om de container met behulp van een glazen pipet. Vervolgens voeg voorzichtig 1 ml waterstofperoxide aan het zwavelzuur aan piranha-oplossing 14 te maken. Neem alle voorzorgsmaatregelen. </li><li> Laat de nanogaatje chip in de piranha-oplossing inwerken gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de piranha-oplossing uit de beker met behulp van een glazen pipet. Plaats deze in een juiste opslag bakje. </li><li> Fill de beker met de ontgast, gedeïoniseerd water met een schone glazen pipet. Lege beker water en herhaal minstens 5 keer. </li><li> Verwijder de nanogaatje chip met schone pincet en droog het met licht zuigen </li><li> Onmiddellijk seal de nanogaatje chip in de kamer (Fig. 2a, 2b). De chip kan worden vastgezet in de kamer door O-ringen of siliconenkit. </li><li> Vul de kamer met KCl-oplossing </li><li> Sluit de Ag / AgCl elektroden op de kamer (Fig. 2b). Elektroden kunnen worden gemaakt door het weken zilveren draad in bleekwater &#39;s nachts. </li><li> Breng een transmembraan potentiaal over de elektroden en toezicht op de huidige reactie met behulp van een Axon 200B patch-clamp versterker in de voltage-clamp-modus. </li><li> Construct een I / V (stroom-spanning) curve van de metingen. De I / V-curve moet zeer lineair bij het ​​gebruik van 1 M KCl (afb. 3). De geleiding van de nanogaatje moeten overeenstemmen met de diameter. Als de nanogaatje niet wordt weergegeven eenlineaire I / V-curve, de geleiding is te laag, of de open stroom van de nanogaatje is niet stabiel (Fig. 4a), betekent dit dat de nanogaatje niet goed bevochtigd en piranha wassen moet worden herhaald. </li></ol> 3. Monitoring eiwitadsorptie <ol><li> Het is van cruciaal belang om de controle experimenten uit te voeren met een single-nanogaatje membraan of parallel array van nanoporiën (zie hieronder) om de huidige monitor met de buffer voorwaarden ontbreekt het eiwit monster. Wij raden de volgende twee stappen: (i) het gebruik van een hoge zuiverheid niveau buffer (zuiverheid&gt; 99,9%; chromatografie-grade niveau), en (ii) het gebruik van een buffer waarvan de wisselwerking met de solid-state nanogaatje niet produceren single-channel evenementen. Daarnaast raden we het verkrijgen van een hoge zuiverheid eiwitmonster het gebruik van standaard eiwit chemie procedures. De zuiverheid van het eiwit monster moet worden gecontroleerd door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel-analyse en hoge-resolutie mass spectrometrie 15. </li><li> Voeg een gezuiverd monster van het eiwit te bestuderen in de geaard bad van de kamer. Wacht tot het monster te diffunderen door het bad. Typische concentraties van eiwit dat kan worden gemeten zijn in de tientallen nM tot uM range 7,15-21. </li><li> Breng een transmembraan potentiële spanning vooringenomenheid met de polariteit tegengesteld aan die van de totale lading van het eiwit bestudeerd. Bijvoorbeeld, BSA heeft een effectieve netto negatieve lading bij pH 7,4, en dus een positieve spanning misvatting moet worden toegepast. De aangelegde spanning creëert potentiaalgradiënt binnen de nanogaatje interieur en proteïnen van tegengestelde ladingen zal worden gedreven door tegengestelde krachten. Alleen voltage polariteiten die de eiwitten schijf in de nanogaatje zullen creëren van meetbare signalen. </li><li> Een toegepast potentieel van grootte van 200 mV moet groot genoeg zijn om de meeste eiwitten analyten te observeren. Gebeurtenissen zullen verschijnen als tijdelijke stroom doorbuigingen van de baseline (fig. 4b).Als er geen signaal wordt waargenomen, verhoogt de concentratie van het eiwit in de kamer. Hogere spanningen verbeteren van de signaal-ruisverhouding. Nitride nanoporiën kan weerstaan ​​enkele volts. </li><li> Eiwit adsorptions zal verschijnen als langlevende veranderingen in de baseline stroom van de nanogaatje (fig. 4c). </li></ol> 4. Mogelijkheden voor functionalisering van de nanoporiën Er bestaan ​​verschillende methoden voor het aanbrengen van functionele groepen aan silicium nitride 22,23. De meeste nitride films hebben een dunne oxidelaag aan de buitenkant en de blootstelling aan ozon kan een extra oxidelaag, indien nodig. Verschillende organosilanen kan worden gebruikt en zelf-geassembleerde op dergelijke lagen. Van bijzonder belang is aminosilaan, die zichzelf assembleert en kan worden gewijzigd verder (dat wil zeggen, carbonzuur en aldehyden), waardoor de inspectie van een reeks van organische oppervlakken. Na een nanogaatje is gewassen met piranha en vastgezet in de chamber, kan amine direct worden toegevoegd aan de kamer bad met een ondersteunend elektrolyt van 0,5 M TBACl (tetrabutylammonium) en watervrij MeOH (methanol) gebruikt als een oplosmiddel. Monolaag vorming kan gevolgd worden door de toepassing van een 400 mV spanning vooroordelen en de meting van de huidige daling van 23. 5. Bepaling van de schijnbare eerste orde reactie snelheidsconstante en de Langmuir adsorptie constante gebruik van parallelle nanogaatje arrays 5.1 De schijnbare eerste-orde reactie snelheidsconstanten voor absorptie en desorptie We benadrukken dat het positieve aspect van deze methodiek is de mogelijkheid om individuele adsorptions observeren op de single-molecule-niveau. De single-molecule metingen van eiwit-adsorptie op een anorganisch oppervlak kan worden opgeschaald door het gebruik van parallelle reeksen van solid-state nanoporiën. De parallelle reeks van nanoporiën is nodig omdat de noodzaak voor het testen van vele poriën op een betrouwbare statistiek te krijgens. Daartoe zou het gebruik van een nanogaatje reeks de bewaking van de individuele adsorptions evenals het meten van meerdere gebeurtenissen voor verdere analyse. Een reeks van nanoporiën in silicium nitride kan gevormd worden door de bovengenoemde protocol gewoon door het boren van meerdere gaten in het monster. Elke nanogaatje moet van vergelijkbare grootte. Arrays van nanoporiën van 6x6 of 7x7 moet voldoende zijn. Na toevoeging van eiwitten analyt in de kamer, zal de huidige verval in een exponentiële wijze, met een volgende expressie: Ik heb t = ∞ I - (I ∞ - I 0) exp (-k &#39;t) Hier, ik t, geeft de stroom bij een experimenteel tijdstip t. I 0 is de oorspronkelijke stroom die door de nanogaatje array. Ik ∞ geeft het huidige niveau bij verzadiging (dwz oneindig). K &#39;is de schijnbare eerste orde reactiesnelheid een constante, die kan worden bepaald uit ee pasvorm van de experimentele curve. Een grotere k &#39;kan worden geïnterpreteerd als een snellere adsorptie tarief. De verhouding I ∞ / I 0, ook wel de genormaliseerde verzadigingsstroom, is een dimensieloos getal tussen 0 en 1. Deze parameter is een maat voor de bezetting door de geadsorbeerde eiwit analyten. Daarom moet elk afzonderlijk experimentele conditie worden geassocieerd met twee specifieke output-parameters I ∞ / I 0 en k &#39;. Opgemerkt moet worden dat de schijnbare eerste orde adsorptie snelheidsconstanten en genormaliseerd stromen worden beïnvloed door de effectieve tijd die eiwitten binnen de nanoporiën. Deze tijd is afhankelijk van de concentratie van het eiwit analyten in bulk waterige fase 24. Daarom is extra correctie van deze nummers dient te worden uitgevoerd op basis van de effectieve tijd die besteed door de eiwitten in de nanogaatje interieur. Wij stellen voor het meten van de frequentie van de fast (translocatie) evenementen en te vermenigvuldigen met de gemiddelde verblijftijd van dergelijke gebeurtenissen. Dit geeft de gemiddelde tijd van de eiwitten besteed binnen de nanogaatje interieur per tijdseenheid. De snelheidsconstante van desorptie kan worden bepaald met behulp van een parallelle reeks van nanoporiën ook. Zodra het huidige niveau verzadiging (I ∞) bereikt, de spanning moet worden omgedraaid, zodat er geen meer eiwitten zitten gevangen in de nanoporiën. Desorptie van de afzonderlijke eiwitten zal gepaard gaan met de wijziging van de opgenomen stroom naar hogere waarden. Het tarief constant wordt dan uit de stijging van het huidige niveau. 5.2 De Langmuir adsorptie constante De absorptie van proteïne analyten op de anorganische oppervlakken van de nanoporiën is afhankelijk van de eiwit concentratie in waterige fase. Dit fenomeen is al waargenomen bij de single-molecule level 13. Als θ vertegenwoordigen<html> s de genormaliseerde verzadiging stroom (I ∞ / I 0), dan is een typisch Langmuir isotherm vergelijking wordt gegeven door de volgende uitdrukking: <img alt="Figuur 5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" /> waar C is het eiwit concentratie in de waterfase. α is de Langmuir adsorptie constant. Deze constante neemt toe met een toename in de bindingsenergie van adsorptie en met een daling van de temperatuur. De verzameling van de gegevens θ punten zal door metingen met een parallel-arrays uit bij verschillende eiwit-concentraties in waterige fase uitgevoerd. De gegevens moeten worden geanalyseerd in combinatie met andere technieken om de omvang van de aangebrachte Langmuir adsorptie constant te controleren. Daarnaast kunnen full-atomistische moleculaire dynamica simulaties 25,26 ook gebruikt worden om de interpretaties van de verkregen experimentele gegevens te helpen. titel &quot;&gt; 6. representatieve resultaten Typische resultaten voor solid-state nanoporiën zijn als volgt. De open poriën huidige moet zeer stabiel zijn, zoals te zien in Fig. 4a. De I / V kenmerken van de nanogaatje moet zeer lineair in 1 M KCl, 10 kalium-fosfaat, pH 7,4, zoals te zien in Fig. 2. De helling van een lineaire fit aan de I / V-curve zal de unitaire geleiding van de nanogaatje. De geleiding heeft een directe relatie met de nanogaatje diameter en moet overeenkomen met de vergelijking: <img alt="Figuur vergelijking" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> , Waarbij G is de geleiding van de nanogaatje, d is de diameter, l is de lengte, en σ is de geleidbaarheid van de oplossing in de kamer 14. Deze waarde moet overeenkomen met tot binnen 30%. Als het te klein is, wordt uw poriën waarschijnlijk niet bevochtigd. Met toevoeging van eiwitten, moet een snelle gebeurtenissen volgen, zoals te zien in Fig. 4b. Protein adsorptie is een langlevende huidige daling zoals weergegeven in Fig. 4c. Sommige eiwitten zijn zeer labiel en ondergaan structurele transformatie binnen de porie interieur. In dit geval zal de lange levensduur spanningsval gepaard gaan met snelle schommelingen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> Figuur 1. Solid-state nanogaatje vervaardigd met behulp van een Tecnai F20 S / TEM. De porie was geboord in STEM-modus tot een diameter van 20 nm. Het beeld werd genomen in bright-field TEM-modus. Nitride was 30 nm dik. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> Figuur 2. Kamer wordt gebruikt voor woningbouw een solid-state nanoporie in resistieve-pulse metingen. A) kamer en een silicium chip met vrijstaande nitride venster (TEM grid). De nanogaatje is geboord in het nitride voorafgaand aan het laden. Rode O-ringen worden gebruikt om een ​​goede s vormpaling over de chip, die twee baden van ionische oplossing scheidt. B) Schema van de kamer laten zien plaatsing van de oplossing baden en elektroden met betrekking tot de nanogaatje. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> Figuur 3. Typische I / V sporen voor solid-state nanoporiën van verschillende diameters. Single-channel elektrische sporen werden genomen in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanoporiën werden geboord in 30 nm dik silicium nitride. Opmerking nitride dikte van invloed op de unitaire geleiding van de nanogaatje. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> Figuur 4. Gemeten single-channel de huidige sporen en de detectie van eiwit adsorptie. A) is een single-channel elektrische trace met de open stroom van een 10 nm diameter nanogaatje. B) Huidige doorbuiging vertegenwoordigen compartimentering van de bovine serum albumine (BSA) in de interior van de nanogaatje. C) Adsorptie van BSA op het nitride oppervlak. Alle sporen zijn van dezelfde nanogaatje in 1 M KCl, 10 mM kalium-fosfaat, pH 7,4. De toegepaste transmembraan potentiaal werd +40 mV en de BSA werd toegevoegd aan de geaarde kamer bad bij een concentratie van 120 nM.

<ol><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-beam+sculpting+at+nanometre+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ion-beam sculpting at nanometre length scales.</a> Nature. 412, 166-169 (2001).</li>
<li>Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+molecules+and+configurations+in+a+solid-state+nanopore+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope.</a> Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).</li>
<li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Solid-state nanopores.</a> Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).</li>
<li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of nanopore sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).</li>
<li>Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+focusing+of+unlabelled+DNA+into+nanoscale+pores+using+a+salt+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).</li>
<li>Peng, H., Ling, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+DNA+translocation+through+a+solid-state+nanopore+by+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.</a> Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).</li>
<li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).</li>
<li>Zhao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+SNPs+using+a+synthetic+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Detecting SNPs using a synthetic nanopore.</a> Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).</li>
<li>Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+solid-state+nanopores+with+single-nanometre+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision.</a> Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).</li>
<li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistive-pulse+studies+of+proteins+and+protein%2Fantibody+complexes+using+a+conical+nanotube+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).</li>
<li>Martin, C. R., Siwy, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry.+Learning+nature%27s+way%3A+biosensing+with+synthetic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores.</a> Science. 317, 331-332 (2007).</li>
<li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adsorption-based+model+for+pulse+duration+in+resistive-pulse+protein+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).</li>
<li>Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+protein+adsoption+onto+an+inorganic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWanunu%2C+M+%22Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).</li>
<li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+molecules+and+protein-protein+interactions+using+synthetic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores.</a> Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).</li>
<li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+protein+molecules+using+nanofabricated+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Sensing protein molecules using nanofabricated pores.</a> Appl. Phys. Lett. 88, (2006).</li>
<li>Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+characterization+of+protein+molecules+by+a+solid-state+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore.</a> Appl. Phys. Lett. 91, (2007).</li>
<li>Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+Facilitated+Translocations+of+Proteins+through+Silicon+Nitride+Nanopores%3A+Conjoint+and+Competitive+Action+of+Diffusion%2C+Electrophoresis%2C+and+Electroosmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis.</a> Nano. Lett. , (2010).</li>
<li>Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+of+translocation+events+in+nanopore+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Data analysis of translocation events in nanopore experiments.</a> Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).</li>
<li>Oukhaled, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Completely+Unfolded+and+Native+Proteins+through+Solid-State+Nanopores+as+a+Function+of+Electric+Driving+Force%5BTitle%5D)+AND+%22ACS.+Nano.%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force.</a> ACS. Nano.. , (2011).</li>
<li>Yusko, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+protein+translocation+through+nanopores+with+bio-inspired+fluid+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).</li>
<li>Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+functionalization+of+silicon+nitride+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).</li>
<li>Wanunu, M., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chemically modified solid-state nanopores.</a> Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).</li>
<li>Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+individual+flexible+polymers+into+a+nanoscopic+protein+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore.</a> Biophys. J. 85, 897-910 (2003).</li>
<li>Aksimentiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+ionic+current+signatures+of+DNA+transport+through+a+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore.</a> Nanoscale. 2, 468-483 (2010).</li>
<li>Timp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+Sequencing%3A+Electrical+Measurements+of+the+Code+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life.</a> IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).</li>
<li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tailoring+for+controlled+protein+adsorption%3A+effect+of+topography+at+the+nanometer+scale+and+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).</li>
<li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+protein+adsorption%3A+surface-induced+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).</li>
<li>Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+BSA+binding+to+citrate-coated+gold+nanoparticles+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces.</a> Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).</li>
<li>Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecific+protein+adsorption+at+the+single+molecule+level+studied+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy.</a> Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).</li>
<li>Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+organization+and+cooperativity+during+nonspecific+protein+adsorption+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).</li>
<li>Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+concepts+and+phenomena+of+the+nonspecific+adsorption+of+beta-lactoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin.</a> Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).</li>
<li>Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscopy+Studies+of+Protein-Functionalized+Atomic+Force+Microscopy+Cantilever+Tips%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips.</a> Scanning. 21, 394-397 (1999).</li>
<li>Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+%27windows%27+for+nanofabricated+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures.</a> Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Giannoulis, C. S., Desai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proteins+and+fibroblasts+on+thin+inorganic+films%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci%3A+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).</li>
<li>Gustavsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensors+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci%3A+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).</li>
<li>Shirshov, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+response+of+planar+polarization+interferometer+to+molecular+layer+formation%3A+fibrinogen+adsorption+on+silicon+nitride+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface.</a> Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).</li>
<li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+layer+deposition+to+fine-tune+the+surface+properties+and+diamters+of+fabricated+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores.</a> Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).</li>
<li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li>
<li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li>
<li>Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li>
<li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Spontane adsorptie van eiwitten op solid-state oppervlakken 27-29 is van fundamenteel belang in een aantal gebieden, zoals de biochip toepassingen en het ontwerp van een nieuwe klasse van functionele hybride biomaterialen. Eerdere studies hebben aangetoond dat eiwitten geadsorbeerd aan solid-state oppervlakken geen laterale mobiliteit of significante desorptie-tarief is gebleken, en daarom eiwit-adsorptie wordt algemeen beschouwd als een onomkeerbaar en niet-specifieke proces van 30-32. Eiwitadsorp...

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td> S / TEM vereist acceleratie spanning ≥ 200kV en veld-emissie bron. </td></tr><tr><td> 20 nm dik siliciumnitride membraan venster voor TEM </td><td> SPI </td><td> 4163SN-BA </td><td></td></tr><tr><td> Axon Axopatch 200B patch-clamp versterker </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pCLAMP 10 software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Elektrofysiologie data-acquisitie en-analyse software </td></tr><tr><td> Zwavelzuur </td><td> Fisher Wetenschappelijke </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> waterstofperoxide </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td> siliconen O-ringen </td><td> McMaster-Carr </td><td> 003 S70 </td><td> U kunt ook gebruik PDMS </td></tr><tr><td> zilverdraad </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 348759 </td><td> Voor elektroden </td></tr><tr><td> SPC Technology, D sub contact, pin </td><td> Newark </td><td> 9K4978 </td><td> Voor elektroden </td></tr><tr><td> kaliumchloride </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> kalium Dibasisch </td><td> Sigma </td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td> kalium monobasisch </td><td> Sigma </td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Sylgar 184 Elastomer set. Voor het maken van kamer. </td></tr><tr><td> Kwik-Cast Sealant </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> KWIK-CAST </td><td> Snelwerkend siliconenkit </td></tr><tr><td> kookplaat </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kooi van Faraday </td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring eiwitadsorptie met solid-state nanoporiën

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Solid-state nanoporiën zijn gebruikt om metingen uit te voeren op de single-molecule niveau naar het lokale structuur en flexibiliteit van nucleïnezuren 1-6, het ontvouwen van eiwitten 7, en de bindingsaffiniteit van verschillende liganden acht te onderzoeken. Door het koppelen van deze nanoporiën om de resistieve-pulstechniek 9-12, kan dergelijke metingen worden gedaan onder een breed scala van omstandigheden en zonder de noodzaak voor etikettering 3. In de resistieve-pulse-techniek, is een ionisch zout-oplossing geïntroduceerd op beide zijden van de nanogaatje. Daarom zijn ionen verdreven uit de ene kant van de kamer naar de andere door een toegepaste transmembraan potentieel, wat resulteert in een constante stroom. Het partitioneren van een analyt in de nanogaatje veroorzaakt een goed gedefinieerde doorbuiging in de huidige, die kan worden geanalyseerd om single-molecule informatie eruit te halen. Met behulp van deze techniek kan de adsorptie van enkele eiwitten aan de nanogaatje muren worden gecontroleerd onder een breed scala aanvoorwaarden 13. Eiwit-adsorptie wordt steeds belangrijker, want als microfluïdische apparaten krimpen in omvang, de interactie van deze systemen met enkele eiwitten wordt een punt van zorg. Dit protocol beschrijft een snelle test voor eiwit binding aan nitride films, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere dunne films vatbaar voor nanogaatje boren, of om gefunctionaliseerde oppervlakken nitride. Een verscheidenheid van eiwitten kunnen worden bestudeerd onder een breed scala aan oplossingen en denaturerende omstandigheden. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt om meer fundamentele problemen met behulp van spectroscopie nanogaatje te verkennen.

Een methode van het gebruik van solid-state nanoporiën om de niet-specifieke adsorptie van eiwitten te controleren op een anorganisch oppervlak is beschreven. De methode maakt gebruik van de resistieve-puls principe, waardoor de adsorptie aan gezocht worden in real-time en op de single-molecule-niveau. Omdat het proces van enkel eiwit-adsorptie wordt ver van evenwicht, stellen wij de werkgelegenheid van parallelle arrays van synthetische nanoporiën, waardoor voor de kwantitatieve bepaling van de schijnbare eerste orde reactie snelheidsconstante van eiwitadsorptie evenals en de Langmuir adsorptie constant.

Monitoring eiwitadsorptie met Solid-state Nanoporiën

Solid-state nanoporiën zijn gebruikt om metingen op enkelvoudig-molecuulniveau uit te voeren om de lokale structuur en flexibiliteit van nucleïnezuren te onderzoeken ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van nanoporiën in kunstmatige membranen voor gebruik in studies naar proteïneabsorptie. Dit wordt bereikt door nanoporiën in een nitridemembraan te boren met behulp van een stem. Vervolgens wordt de nanoporie in een kamer geladen en bevochtigd met een ionische oplossing.Zodat de vloeistof een brug vormt van de ene kant van de nanopore naar de andere, om de nanopore klaar te maken voor experimenten. Er wordt een spanning over de nanopore aangelegd en er kan worden waargenomen dat er een ionenstroom doorheen loopt. De laatste stap is het toevoegen van proteïne aan de nanoporekamer.Het uiteindelijke observeren van langdurige blokkades in de ionenstroom door de nanopore onthult de adsorptie van eiwitten aan de wanden van de nanopore. Hallo, ik ben Dave Wicki. Ik ben een promovendus bij de afdeling natuurkunde aan de Syracuse University.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de absorptie van eiwitten op anorganische oppervlakken, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals interacties tussen eiwitten en nucleïnezuren, single-molecule spectroscopie en de studie van moleculen in beperkte ruimtes. Begin met het brengen van de stem naar een versnellingsspanning.Laad vervolgens een SPI siliciumnitride-windowgrid in de TEM-proefhouder. Reinig het grid gedurende 30 seconden met zuurstofplasma om vuil te verwijderen. Plaats de proefhouder in de TEM en wacht tot het vacuüm is opgepompt voordat het monster wordt geladen.Zoek met de brightfield TEM-modus het nitride-venster, een helder vierkant op het ruwe rogram. Zorg ervoor dat de TEM correct is uitgelijnd. Lijn vervolgens het monster uit en stel het scherp.Zet het systeem nu in STEM-modus en gebruik een hot off-detector om het monster af te beelden en de uitlijning te controleren. Stel de monochromator, indien aanwezig, in op een lage waarde, zodat er een hogere elektronenstroom beschikbaar is voor het boren. Selecteer de juiste spotgrootte om de nanopore te boren op basis van de diameter van de elektronenbundel.Zorg dat de steel is uitgelijnd. Gebruik de BROGRAM om bij de vereiste vergroting scherp te stellen op het nitridemembraan. Indien het monster beweegt, schakel dan de elektronenbundel uit (blank) en wacht tot het monster is gestabiliseerd.Dit kan tot een uur duren. Plaats, zodra het gestabiliseerd is, de elektronenbundel op het monster en begin met het boren van de nanoporie. Het boren van een nanoporie met een TM vereist veel geduld.Het is een proces waarbij nitride geleidelijk wordt weggeslagen onder een elektronenbundelprobe. Het is belangrijk om de elektronenprobe direct boven de boorplaats te houden en te bevestigen dat de nanopore volledig is geboord. Controleer de sample periodiek door te scannen met de hot off detector voordat de sample uit de TEM wordt verwijderd.Als het monster licht verschuift, pas dan de positie van de elektronenbundel aan zodat deze zich boven de nanopore bevindt. Wanneer het ROI-gram in focus is, zal de glinsterende nitridefilm verdwijnen. Wanneer de nanopore zich vormt terwijl het roky-gram buiten focus is, is de rafelige nagelrand zichtbaar.Neem een beeld op van de nanopore terwijl de verwarming is uitgeschakeld en maak een intensiteitsprofiel van het beeld. De diameter van de nanopore kan worden geschat aan de hand van het donkerste gebied van het profiel. De elektronenbundel kan worden gebruikt om de nanopore te vergroten indien nodig.Zodra de gewenste diameter is bereikt, schakelt u over naar de TEM-modus met de monochromator in de standaardinstelling. Gebruik brightfield TEM om de poriegrootte te bevestigen.Begin met het voorbereiden van ontgaste fysiologische zoutoplossing. Plaats de oplossing onder vacuüm in een sonicaatbad gedurende 20 minuten. Plaats voorzichtig de fragiele nanopore-chip met siliciumnitride in een Pyrex-bekerglas van 10 milliliter. Plaats het bekerglas vervolgens in een zuurkast op een warmteplaat.Reinig de Nanopore-chip zeer zorgvuldig met piranha-oplossing. Voeg eerst drie milliliter zwavelzuur toe aan de houder met een glazen pipette. Voeg vervolgens voorzichtig één milliliter geconcentreerd waterstofperoxide toe aan het zwavelzuur.Neem alle voorzorgsmaatregelen. Laat de nanopore-chip 10 minuten weken. Verwijder vervolgens met een glazen pipet de piranha-oplossing uit het bekerglas en voer deze op de juiste wijze af.Vul vervolgens het bekerglas met ontgaste gedeioniseerde water. Leeg het bekerglas met een schone glazen pipet en herhaal dit wassen ten minste vijf keer. Verwijder de nanopore chip met een schone pincet en droog deze door middel van lichte zuiging.Zodra deze droog is, moet de nanopore-chip onmiddellijk in de kamer worden verzegeld. De chip kan in de kamer worden vastgezet met O-ringen of siliconenkit. Vul de kamer met een kaliumchloride-oplossing.Sluit de zilver/zilverchloride-elektroden aan op de kamer. Elektroden kunnen worden gemaakt door zilverdraad een nacht in bleekmiddel te weken. Breng een transmembraanpotentiaal aan over de elektroden en monitor de stroomrespons met een patchclamp-versterker.Stel in de voltage-clamp-modus een stroom-spanningscurve op op basis van de metingen. De curve moet sterk lineair zijn. Bij gebruik van één molair kaliumchloride moet de conductantie van de nanoporie overeenkomen met de diameter ervan.Als de nanopore geen lineaire IV-curve vertoont, is de conductantie te laag of is de open stroom van de nanopore niet stabiel. Dit wijst erop dat de nanopore niet correct is verbonden en dat het piha-wassen moet worden herhaald. Het is essentieel om er zeker van te zijn dat er vloeistof in de nanopore aanwezig is.Indien deze stap niet correct wordt uitgevoerd, zal de ionenstroom door de nanopore een zeer grote ruis vertonen en zal de partitionering van eiwitten in de nanopore drastisch afnemen. Begin met het toevoegen van een gezuiverd monster van het betreffende eiwit in het geaarde bad van de kamer. Wacht tot het monster volledig is gediffundeerd.Breng een transmembraan potentiaalspanningsbias aan met een polariteit die tegengesteld is aan die van de totale lading van het bestudeerde eiwit. Een aangelegde potentiaal van 200 millivolt zou voldoende moeten zijn om waarnemingen te doen. De meeste gebeurtenissen van eiwitanalieten zullen verschijnen als kortstondige stroomafbuigingen ten opzichte van de basislijn.Indien er geen signaal wordt waargenomen, verhoog dan de concentratie van het eiwit in de kamer. Hogere voltages verbeteren de signaal-ruisverhouding en het nitride. Nanoporiën kunnen meerdere volts verdragen.Proteïneabsorpties zullen verschijnen als langdurige veranderingen in de basisstroom van de nanopore. Typische resultaten voor solid-state nanoporen zullen als volgt zijn. De open porestroom moet zeer stabiel zijn.De IV-karakteristieken van de nanopore moeten sterk lineair zijn. In één molair kaliumchloride en 10 molair kaliumfosfaat bij pH 7.4 zal de helling van een lineaire fit van de IV-curve de unittestige conductantie van de nanopore opleveren. De conductantie heeft een directe relatie met de diameter van de nanopore en moet overeenkomen met de vergelijking.Deze waarde moet binnen 30% overeenstemmen. Als de waarde te laag is, is de porie waarschijnlijk niet verbonden na toevoeging van eiwit. Snelle gebeurtenissen zouden moeten volgen; eiwitabsorptie is een langdurige daling van de stroom. Sommige eiwitten zijn zeer labiel en ondergaan structurele transformaties binnen het interieur van de porie.In dit geval zal de langdurige spanningsval gepaard gaan met snelle fluctuaties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u solid-state nanoporiën vervaardigt met behulp van een scanning transmissie-elektronenmicroscoop, en hoe u deze gebruikt voor de absorptie van gepositioneerde SA-eiwitten. Vergeet niet dat werken met piranha-oplossing uiterst gevaarlijk kan zijn; bij het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het werken in een zuurkast met handschoenen, een laboratoriumjas en een chemisch schort.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

monitoring-protein-adsorption-with-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the surface plasmon resonance, or SPR, technique for studying the interaction between two molecules using a sensor chip. The change in resonance angle and the intensity of the reflected light are detected as a function of the association and dissociation of two molecules, and this provides information about the interactions between the two molecules.

Surface Plasmon Resonance to Study Biomolecular Interactions Using a Sensor Chip

Een methodologie voor het bereiden van solid-state nanoporiën in oplossing voor biomoleculaire translocatie experimenten wordt gepresenteerd. Door het toepassen van korte pulsen van hoge elektrische velden kan de nanopore diameter beheersbaar worden uitgebreid met subnanometer precisie en zijn elektrische ruis kenmerken aanzienlijk verbeterd. Deze procedure wordt uitgevoerd in situ met behulp van standaard laboratoriumapparatuur onder experimentele omstandigheden.

Fine-tuning van de grootte en het minimaliseren van de Noise van Solid-state Nanoporiën

Surface Plasmon Resonance (SPR) is een label vrij werkwijze voor het detecteren van biomoleculaire interacties in real time. Hierin, een protocol voor een membraaneiwit: wordt receptor interactie experiment beschreven, terwijl de discussie over de voors en tegens van de techniek.

Real Time Metingen van membraaneiwit: Receptor Interacties gebruik Surface Plasmon Resonance (SPR)

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

Hier gebruiken we een polyurethaan afstembare nanopore geïntegreerd in een weerstandsbelasting puls detectie techniek nanodeeltjes oppervlaktechemie gekenmerkt via de meting van het translocatie snelheden, die kunnen worden gebruikt om het zeta potentieel van individuele nanodeeltjes bepalen.

Bepaling van de Zeta Potentiële via nanodeeltjes Translocation Snelheden door een Tunable Nanopore: Met behulp van DNA-gemodificeerde deeltjes als een voorbeeld

Een microchip fabricageproces dat plasmonische pincet opgenomen wordt hier gepresenteerd. De microchip maakt het afbeelden van een gevangen deeltje trapping maximale krachten meten.

Plasmonische Trapping en het vrijkomen van nanodeeltjes in een Monitoring Milieu

Proteasen zijn strak gereguleerde enzymen die betrokken zijn bij de fundamentele biologische processen en dysregulated protease-activiteit stations progressie van complexe ziekten zoals kanker. Doel van deze methode is het creëren van nanosensors die door het produceren van een decollete-signaal dat is aantoonbaar uit host urine en discrimineert ziekte protease activiteit in vivo meten.

Nanosensors om te detecteren Protease activiteit In Vivo Noninvasive Diagnostics

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van discrete metalen zuurstof clusters, polyoxometalates (POMs), bij de enkelvoudige molecuul limiet met behulp van een biologisch nano-gebaseerd elektronisch platform. De methode biedt een complementaire benadering van traditionele analytische chemie instrumenten die worden gebruikt in de studie van deze moleculen.

Fysische karakterisering van enkele metallische nanodeeltjes in hoge resolutie

Hier presenteren we een protocol voor de fabricage van een gesloten type draadloze nanopore-elektrode en latere elektrochemische waardering voor één nanoparticle botsingen.

Een gesloten Type draadloze Nanopore-elektrode voor het analyseren van interne nanodeeltjes

De eerste stap in het begrijpen van biomolecule-anorganische vaste fase interactie is het onthullen van fundamentele fysisch-chemische constanten die kunnen worden geëvalueerd door het vaststellen van adsorptie isothermen. Adsorptie uit de vloeibare fase wordt beperkt door kinetiek, oppervlaktecapaciteit, pH en concurrerende adsorptie, die allemaal voorzichtig moeten worden overwogen voordat u een adsorptie-experiment instelt.

Studie van korte peptide adsorptie op oplossing verspreidanannnanodeeltjes met behulp van uitputting methode

Plasmonische nanopincetten gebruiken gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie in gouden nanostructuren om afzonderlijke nanodeeltjes, waaronder eiwitten, op te vangen in een optisch veld op nanometerschaal. Veranderingen in het verstrooide signaal onthullen de aanwezigheid van eiwitten en de conformationele dynamiek, waardoor monitoring mogelijk is zonder fluorofoormodificaties of oppervlaktetethering.

Monitoring van conformationele dynamica van enkelvoudige ongemodificeerde eiwitten met behulp van plasmonische nanopincetten

Verken het fabriceren van solid-state nanoporiën in siliciumnitridemembranen met STEM voor het monitoren van eiwitadsorptie op enkelmoleculair niveau. Deze methode biedt inzicht in eiwit-oppervlakte-interacties.

Monitoring eiwitadsorptie met Solid-state Nanoporiën

Meer video's verkennen