Name: Hele Animal Perfusie Fixatie voor knaagdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer een snelle perfusiefixatiemethode voor rattenhersenweefsel met 4% paraformaldehyde onder fysiologische druk. Deze techniek zorgt voor uniforme fixatie en optimale weefselpreservatie voor immunohistochemische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Centrum voor Neurale Communicatie Technologie (CNCT), een P41 Resource Center gefinancierd door het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) en ondersteund door de National Institutes of Health (NIH).

1. Bereid Fixatief (Zie tabel Fixatief en buffers.) 2. Bereid Perfusie Buffers (Zie tabel Fixatief en buffers.) 3. Bereid Apparaten en Anesthesie <ol><li> Met behulp van het waterbad, warme perfusie buffer tot 37 ° C. Plaats uitlaatklep in een bekerglas gevuld met buffer. Vul een 50 ml spuit met buffer en hechten aan fixeermiddel buizen. Herhaaldelijk Spoel slang door verdrijven of intrekking van de buffer. </li><li> Maak de lijn met buffer totdat alle luchtbellen in de slang worden geëlimineerd. Het is cruciaal voor het succes van een perfusie niet om luchtbellen te hebben in een van de lijnen. </li><li> Verwijder de spuit en sluit de 4% paraformaldehyde fixatief (kamertemperatuur) container. Om luchtbellen in de slang einde te vermijden, knijp de buis, terwijl het plaatsen van de buis in de container zodat er een druppel buffer steekt vanaf het einde to contact opnemen met de vloeistof oppervlak in de container. </li><li> Sluit de uitlaatpoort (naald einde). Draai buffer afsluiter (blauw) om dezelfde positie als het fixeermiddel klep (wit). Hierdoor kunnen vloeien voort uit de buffer lijn alleen. </li><li> Open de uitlaatpoort en herhaal stap A1 tot en met A3 voor het vullen van de buffer lijn. Nadat alle luchtbellen dicht geëlimineerd de uitlaatpoort, verwijder de spuit en sluit de buffer container, waarbij zorg niet om luchtbellen te introduceren in de slang. </li><li> Test systeem voor het vermogen om onder druk te houden door het pompen van het rubber manometer blub. Er is doorgaans enige weerstand vanwege de compressie van de lucht in het systeem. </li><li> Stel een operatie tools om voor eenvoudige toegang. Vul perfusie naald met buffer de mogelijkheid luchtbellen te verwijderen. </li><li> Voorafgaand aan chirurgie, wordt een ketamine / xylazine mengsel (tot 80 mg / kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine) toegediend intraperitoneale injectie (27 gauge naald en 1 cc spuit). Extra toediening verdoving wordt uitgevoerd als nodig tijdens elke bewerking een chirurgische vlak van anesthesie handhaven. </li></ol> 4. Perfusie Chirurgie <ol><li> Als het dier eenmaal heeft bereikt een chirurgische vlak van anesthesie, plaats het op de ondiepe bak gevuld met crushed ijs. (Gebruik teen pinch-reactie methode om de diepte van anesthesie te bepalen. Dieren moeten niet reageren voordat u verder gaat). </li><li> Maak een 5-6 cm laterale incisie door de omhulling en buikwand net onder de ribbenkast. Haal voorzichtig de lever van het middenrif. </li><li> Maak een kleine incisie in het membraan met behulp van de gebogen, stompe schaar. De positie en de druk van de vinger kan helpen bij het vermogen om het membraan te snijden. </li><li> Verdere membraan incisie langs de gehele lengte van de ribbenkast van de pleura-holte bloot te leggen. </li><li> Plaats gebogen, stompe schaar langs een zijde van de ribben zorgvuldig verplaatsen van de longen en een cut door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen. Maak een vergelijkbare snee in de contralaterale zijde. </li><li> Het opheffen van de borstbeen weg, knip zorgvuldig elk weefsel aan te sluiten op het hart. Klem de punt van het borstbeen met de hemostat en plaats de hemostaat over het hoofd. Wanneer goed uitgevoerd, de thymus tilt uit de buurt van het hart, samen met het borstbeen, die een duidelijk beeld van de grote schepen. </li><li> Maak een kleine incisie aan de achterste eind van de linker ventrikel met behulp van iris schaar. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <ol start="8"><li> Laat een 15-gauge bot-of olijf-tip perfusie naald door de snede hartkamer in de aorta ascendens. De tip moet zichtbaar zijn door de wand van de aorta, en mag niet bij de aortaboog waar de arm en de halsslagaders uiteen. </li><li> Gebruik een hemostaat naar het hart vast te klemmen, dit stelt de naald en voorkomt lekkage. Desgewenst kan de gemodificeerde hemostat worden gebruikt om de aorta klemmen rond de naald (deze hemostats blijven totdat ontleding begint, maar weggelaten toekomstige illustraties voor de duidelijkheid). </li><li> Tot slot maken een incisie het recht van het dier atrium met iris een schaar om zo groot op een stopcontact mogelijk te maken zonder beschadiging van de dalende aorta. Op dit punt is het dier klaar om te worden doorbloed is. </li></ol> 5. Perfusie <ol><li> Open en sluit uitlaatpoort om de naald basis zorg ervoor dat u eventuele luchtbellen te introduceren. </li><li> Pomp de manometer lamp een druk van 80 mm Hg snel en gelijkmatig. Houd deze druk in de buffer infusie periode. Start de timer. </li><li> Pas de naald hoek. De hoek van de naald is cruciaal voor het bereiken van een maximaal debiet (let op de stroom veranderen met instelbare hoek). </li><li> Schakel de buffre afsluiter (blauw) als buffer is bijna klaar (200 ml). De vloeistof moet worden uitgevoerd duidelijk. De verrekening van de lever is een indicator van een goede doorbloeding. De lever moet duidelijk zijn op dit punt. Geef de tijd voor uw administratie. </li><li> Fixatie bevingen in acht worden genomen binnen een paar seconden: dit moet worden beschouwd als de ware tijd van fixatie. Geef de tijd voor uw administratie. </li><li> De druk kan geleidelijk te verhogen tot maximaal 130 mm Hg 2 een constante stroom te behouden. </li><li> Sluit de uitlaatklep zodra de fixatief is bijna klaar. Geef eindtijd voor uw administratie. </li><li> De rat moet stijf zijn in dit stadium. </li><li> De gebruikte paraformaldehyde moet worden verzameld en opgeslagen voor verwijdering volgens de voorschriften van uw instelling. </li></ol> 6. Dissection 4,11 <ol><li> Verwijder de kop met een schaar. </li><li> Maak een middellijn incisie langs de integument van de nek naar de neus en blootschedel. </li><li> Snij de resterende nekspier, zodat de basis van de schedel wordt blootgesteld, verwijder eventueel resterende spieren met behulp van schaar of rongeurs. </li><li> Plaats het scherpe uiteinde van een paar iris schaar in de foramen magnum enerzijds goed glijdende de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel. </li><li> Maak vervolgens een snede uit te breiden tot de verste rand van de achterste schedel oppervlak. Maak een identieke snee in de contralaterale zijde. Gebruik de rongeurs op te ruimen de schedel rond de kleine hersenen. </li><li> Schuif de schaar langs het binnenoppervlak van de schedel de tip loopt van de dorsale distale achterste hoek van de distale frontale rand van de schedel, op te tillen het mes u snijden van hersenbeschadiging voorkomen. Herhaal aan de andere kant. </li><li> Met behulp van rongeurs schil de dorsale zijde van de schedel uit de buurt van de hersenen. Snij de zijkanten van de schedel met rongeurs ook. </li><li> Met behulp van een spatel, verbreken de olfactorische bollen en nerveus aansluitinggen langs het ventrale oppervlak van de hersenen. </li><li> Voorzichtig te plagen de hersenen uit de buurt van het hoofd, trimmen elke dura die nog steeds de hersenen verbindt met de schedel met behulp van iris schaar. </li><li> Verwijder de hersenen en plaats het in een flesje fixatief bevattende vloeistof minstens 10x het volume van de hersenen zelf. Zwenk de flacon af en toe. </li></ol> 7. Post-fixatie &amp; Opslag <ol><li> Houd de hersenen in fixeermiddel voor 24 uur bij 4 ° C, wervelende af en toe. </li><li> Na 24 uur was de hersenen met fosfaat gebufferde zoutoplossing door uitwisseling van het medium 3 keer en wervelende telkens. </li><li> Hersenen kan vervolgens worden opgeslagen in fosfaat gebufferde zoutoplossing of HBHS met natriumazide en bewaard bij 4 ° C. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Een eerste indicator van het succes van de perfusie is de clearing van de extremiteiten, zoals de neus, oren en poten en interne organen zoals de thymus en de lever (IHC World).Bruto inspectie van de hersenen toont het bloedvat leegte van bloed (wit tot lichtgeel uiterlijk). Dit zal ook het geval in weefselcoupes bestemmen voor de kleuring en immunohistochemie. De laatste indicator van het resultaat van de perfusie is de toestand van de ultrastructuur in het weefsel. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Bereid Fixatief: </td></tr><tr><td> Bereid 8% paraformaldehyde voorraad </td></tr><tr><td><ol><li> Voeg 40 g paraformaldehyde tot 500 ml dH 2 O. Verwarm de oplossing tot 60 - 65 ° C onder roeren (niet meer dan 65 ° C, dit kan afbreuk het succes van de immunohistochemische procedure). </li><li> Om de oplossing te verwijderen, zet het vuur lager en voeg 2-3 ml van 1,0 M NaOH met een druppelaar. </li><li> Filter en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereid 0,2 M natriumfosfaat buffer, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Voor de monobasisch voorraad, voeg 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O tot en met 1 L dH 2 O. </li><li> Voor de dibasisch voorraad, voeg 28,4 g Na 2 HPO 4 tot 1 liter dH 2 O. </li><li> Voeg 810 ml van de monobasisch voorraad tot 190 ml van de dibasisch voorraad. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereid 4% paraformaldehyde Fixatief </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Voeg gelijke delen 8% paraformaldehyde in voorraad hebben voor 0,2 M natriumfosfaatbuffer </li><li> Opmerking: deze correctie wordt het best vers bereid, niet meer dan 72 uur van tevoren. </li></ol></td></tr><tr><td> Bereid Perfusie en opslag Buffers: </td></tr><tr><td> Bereid fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L dH 2 O </li><li> 9 g NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg Na 2 HPO 4 </li><li> Controleer de pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES gebufferde Hanks Solution (HBHS) met natriumazide pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml dH 2 O </li><li> 7,5 g NaCl, </li><li> 0,3 g KCl </li><li> 0,06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g Dextrose / glucose </li><li> 2,4 g 10 mm Hepes </li><li> 0,1 g MgCl2 6 delen dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 7 delen dH 2 O </li><li> 0,165 g CaCl 2 2 delen dH 2 O </li><li> 90 mg NaN3 </li><li> Controleer de pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Voorbereiding van Fixatief en buffers. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figuur 1. </strong&gt; Perfusie met gelabelde Inrichting componenten. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figuur 2. Voorbereiding van de perfusie Apparatuur I. Begin met het fixeermiddel lijn. Spoel de slang van luchtbellen en vul met buffer door snel verdrijven of intrekking van de buffer in de spuit en door de lijn. Sluit de afsluiter op de naald einde uit. Plaats de fixatief lijn in het fixeermiddel fles zonder dat er luchtbellen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figuur 3. Voorbereiding van de perfusie Apparatuur II. 1. Open klep op de naald eind. 2. Draai buffer afsluiter (blauw) in de stand voor flow. 3. Spoel de slang van luchtbellen en vul met buffer door snel verdrijven of intrekking van de buffer met de spuit. 4. Sluit klep op de naald eind. Plaats slang in de buffer fles. Test de druk om te controleren of het systeem correct verzegeldly door het oppompen van de manometer lamp en het kijken naar de meter. Het apparaat is nu klaar voor de perfusie procedure. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figuur 4. Perfusie Apparatuur positie voor buffer levering. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figuur 5. Perfusie Chirurgie I. a) Maak een laterale incisie door de omhulling en buikwand. b) Maak een insnijding in het middenrif en dwars door het membraan het blootstellen van het hart. Merk evenwijdige sneden aan weerszijden van de ribben aan het sleutelbeen. c) klem de punt van het borstbeen met de hemostat en plaats de hemostaat over het hoofd. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figuur 6. Perfusie Chirurgie II. a) Voer de perfusie naald door de snede hartkamer in de aorta ascendens. b) Bevestig deperfusie naald gebruik een set hemostats naar het hart vast te klemmen. Een tweede set van gewijzigde hemostaat kan ook worden gebruikt om de aorta klemmen rond de naaldpunt te voorkomen lekkage. Met behulp van iris schaar een kleine incisie aan het achterste eind van de linker hartkamer. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figuur 7. Perfusie met Buffer Pomp de manometer lamp om de druk in de regel te maken. Open de klep (1) en bevestig deze aan de naald hub. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Pomp de manometer lamp een druk van 80 mm Hg en houden deze druk gedurende de buffer infusie. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figuur 8. Perfusie met een fixatief Als buffer is bijna klaar (200 ml) schakelt de buffer ventiel (1), zodat voor het fixeermiddel te stromen. De druk kan geleidelijk worden verhoogd tot eenmaximaal 130 mm Hg. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Figuur 9. Dissection I. a) verwijderen van de kop met een paar schaar. b) maakt een sneetje in de huid langs de middellijn van de nek naar de neus en bloot de schedel. c) gekozen uit de resterende nekspier zodat de basis van de schedel blootgesteld. Houd het hoofd, zodat de grote opening in de schedel oppervlak (foramen magnum) toegankelijk is. Steek de scherpe punt van een paar van iris schaar in het foramen magnum en maak een snede. Herhaal deze manoeuvre voor de contralaterale zijde. Gebruik de rongeurs op te ruimen de schedel rond de kleine hersenen. <img alt="Figuur 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figuur 10. Dissection II. a) de schuif schaar langs het binnenoppervlak van de schedel. Til op de punt als u snijden om schade aan de hersenen te voorkomen. Herhaal hetzelfde voorandere kant. Weg Gebruik rongeurs schil de schedel van de hersenen. b) illustratie met de schedel verwijderd en de hersenen blootgesteld. c) het gebruik een spatel om de olfactorische bollen en zenuwverbindingen te verbreken op de meest voorste locatie van de hersenen. Leid de spatel te breken langs de onderkant van de hersenen om verbindingen te verbreken voor het gemak van verwijderen. Verwijder de hersenen en plaats het in een flesje fixatief.

<ol><li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li>
<li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats%3A+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li>
<li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li>
<li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li>
<li>Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li>
<li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li>
<li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+WF+%22Vertebrate+dissection%22">Vertebrate dissection</a>. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).</li>
<li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Monitoring+in+the+Rat%3A+Comparison+of+Monitoring+in+the+Ventricle%2C+Brain+Parenchyma%2C+and+Cisterna+Magna%22%5BJournal%5D)">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Aanvullende opmerkingen voor een succesvolle operatie: <ol><li> Zodra het membraan wordt overtreden, voorafgaan snel hypoxie en hypercapnie zal onomkeerbare fysiologische veranderingen die verdere analyse kunnen beïnvloeden te starten. </li><li> Wanneer de naald en vastgeklemd wordt de restdruk druk bloed naar de bodem van de naald (Flashback). In feite kan grotere dieren krachtig te verdrijven bloed. Het is essentieel dat tenminste bloed de basis van de naald bereiken voorkomen dat er luchtbellen dat een obstakel voor perfusie zal vullen. Als er geen bloed wordt waargenomen op de naald basis, verwijder de naald en opnieuw vullen met buffer door het aanbrengen van het aan de uitlaatpoort van de perfusie rig. Als buffer is uitgevoerd door de tip, kan de naald worden teruggeplaatst in het hart. </li><li> Juiste plaatsing van de naald in de aorta kritisch is, dient het niet doorlopen tot aan de aorta-boog. </li><li> Als er meerdere perfusies vinden plaats is het niet nodig to setup vanaf het begin elke keer. De gebruiker dient te beschikken over de juiste volume voor zowel de buffer en fixatief in elke fles (200mls dier / oplossing). De flessen worden gevuld indien nodig. Het belangrijkste aspect om te overwegen is het verwijderen van de perfusie lijn die loopt van de setup om het dier (output klep). Na de voltooiing van een perfusie, deze lijn zal 4% paraformaldehyde in hebben. Verwijder de slang uit de buffer fles en gebruik maken van een 50 ml injectiespuit gevuld met water te spoelen het fixeermiddel. Zorg ervoor dat de uitlaatklep wordt geplaatst in een inzameling van afval beker voor goede afvoer van het paraformaldehyde. Herhaal dit drie keer. Vul met buffer met behulp van dezelfde methode als beschreven in 2.3. </li><li> Deze methode voor bevestiging zeer flexibel met de mogelijkheid om zowel buffer en fixeermiddel andere fixeermiddelen (zoals die voor EM) wijzigen volgens de vereisten van het experiment. </li><li> Het systeem wordt ook vaak gebruikt voor de extractie van levend weefsel. Hiervoorwerkwijze gebruikt men slechts de levering van buffer alleen (de buffer fles terwijl aan hele systeem wordt in een ijs emmer en het fixeermiddel fles is ingesteld als leeg maar gesloten). Dit verzekert een koude buffer perfusie de optimale druk. Vanuit het systeem kan worden aangepast aan de infusie van fixeerbaar kleurstoffen door het toevoegen van de kleurstof rechtstreeks aan de buffer (indien de hoeveelheid geen probleem is) of een spuit met een minimale hoeveelheid buffer / kleurstofoplossing tussen de buffer - fixatief stap. </li><li> Bij gieten vasculaire de drukcontrole buffer stap is cruciaal maar door de viscositeit en stollen aard van de gietoplossing hetzij een 50 ml spuit worden gebruikt voor directe steun of een wegwerp secundaire bevestiging aan de inrichting (slang, klep en vasthouden container) aan interface met het huidige systeem gebruikt worden. Onze laboratoria &#39;vasculaire casting ging vooraf aan het ontwerp en de productie van de perfusie apparaat. Daarom kunnen we geen STaten dat de druk metingen zullen een nauwkeurige meting bij de levering site. De nummers kunnen worden aangepast om een ​​succesvolle aflevering van viskeuze vloeistoffen te bereiken. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Uitrusting </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Verdoving: </td></tr><tr><td> Ketamine / xylazine mengsel (bedwelmend kunnen per laboratorium / instelling) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ml flacon </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Chirurgie: </td></tr><tr><td> Punt van de naald, 27 GA x 1,25 &quot; </td><td> Materieel Services </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Grote stomp / stomp gebogen schaar (~ 14,5 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Rechte iris schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standaard pincet </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Paar fijn (Graefe) pincet </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 grote hemostat tang - gebogen of rechte (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 standaard hemostat tang - rechte gekartelde (14 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 gewijzigd hemostat (met 15-gauge gat neergelegd via de tip) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-gauge stomp of olijf-tip naald (perfusie naald) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusie: </td></tr><tr><td> HyPerfusion of equivalente &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ondiepe glas of kunststof bak, ongeveer 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Crushed ijs </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waterbad (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Timer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml spuit </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pair van standaard scherp / stomp rechte schaar (~ 12 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Medium gebogen of rechte rongeurs (14-16 cm) of de schedel botverwijdering tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Rechte iris schaar (~ 9 cm) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-spatel (double 2 &quot;platte uiteinden een afgeronde, een conisch 1/8&quot;) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Post-Fixatie en opslag: </td></tr><tr><td> 50 ml glazen flacon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml HEPES Gebufferde Hanks Solution (HBHS) met natriumazide (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

hele animal perfusie fixatie voor knaagdieren

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Het doel van fixatie is om snel en gelijkmatig weefsel te bewaren in een leven-achtige toestand. Terwijl het plaatsen van weefsel direct in fixatief werkt goed voor kleine stukjes weefsel, grotere exemplaren, zoals de intacte hersenen vormen een probleem voor onderdompeling fixatie, omdat de fixeermiddel niet alle regio&#39;s van het weefsel te bereiken met dezelfde snelheid 5,7. Vaak als reactie op hypoxie beginnen vóór het weefsel kan worden bewaard 12. Het voordeel van direct perfuseren fixatief door het vaatstelsel is dat de chemische snel kan bereiken elke hoek van het organisme met behulp van de natuurlijke vasculaire netwerk. Om de bloedsomloop te gebruiken het meest effectief, moet erop worden gelet te evenaren fysiologische druk 3. Het is belangrijk op te merken dat fysiologische druk afhankelijk van de gebruikte soort. Technieken voor perfusie fixatie variëren, afhankelijk van het weefsel vast te stellen en hoe het weefsel zullen worden verwerkt volgende fixatie. In deze videoBeschrijven we een goedkope, snelle, beheerste en gelijkmatige fixatie procedure met behulp van 4% paraformaldehyde doorbloed via het vasculaire systeem: door het hart van de rat om de best mogelijke bescherming van de hersenen voor immunohistochemie te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek (versus zwaartekracht gevoerde systemen) is het circulatiesysteem is het meest effectief benut.

Hier beschrijven goedkope, snelle, beheerste en gelijkmatige fixatie procedure met 4% paraformaldehyde geperfuseerd via het vasculaire systeem: door het hart van de rat de best mogelijke bescherming van de hersenen te verkrijgen.

Hele Animal Perfusie Fixatie voor knaagdieren

Het doel van fixatie is om weefsel snel en uniform in een levensgetrouwe staat te conserveren. Hoewel het direct plaatsen van weefsel in fixatief goed werkt voor kleine ...

Het algemene doel van deze procedure is om onze perfusiefixatietechniek te demonstreren, waarbij de nadruk ligt op het gebruik van fysiologische drukken om rattenhersenweefsel correct te conserveren voor immunohistochemische procedures. Eerst worden het gebruik en de opstelling van het perfusieapparaat gedemonstreerd. Vervolgens worden de benodigde instrumenten voor zowel de perfusiechirurgie als de verwijdering van de hersenen verzameld, en wordt het diep genarceerde dier in een ondiepe bak met gecrusht ijs geplaatst.Er wordt een laterale incisie van vijf tot zes centimeter gemaakt door het integument en de buikwand, net onder de ribbenkast. Het hart wordt blootgelegd en het dier wordt geperfuseerd. De laatste stap is het verwijderen van de hersenen en deze in een flesje fixatiumiddel te plaatsen met een volume dat ten minste 10 keer groter is dan dat van de hersenen zelf.Het algemene doel van deze procedure is om onze perfusie-fixatietechniek te demonstreren, waarbij de nadruk ligt op het gebruik van fysiologische druk om rattenhersenweefsel correct te preserveren voor immunohistochemie. We beginnen met het klaarmaken van de perfusie-opstelling. Dit zal ongeveer 10 minuten duren. Gebruik een spuit van 50 milliliter om de fixatielijn herhaaldelijk door te spoelen en te reinigen met buffer totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.Voor het succes van een perfusie is het essentieel dat er geen luchtbellen in de leidingen aanwezig zijn. Dit wordt bereikt door de uitlaatklep in een bekerglas met buffer te plaatsen. Sluit nu de uitlaatklep.Verwijder vervolgens de buis uit de spuit terwijl u deze samenknijpt, zodat er een druppel buffer aan het uiteinde blijft hangen. Plaats de gevulde buis, met de inlaat voor het fixatiemiddel, in een fles met 200 milliliters paraldehyde-fixatiemiddel per dier. Let er hierbij op dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd.Draai de dop vast en zorg ervoor dat de afdichting goed aansluit. Als deze niet correct is geplaatst, zal de druk binnen het gesloten systeem niet behouden blijven. Plaats de fles in de perfusie-opstelling.Stel de doorstroming in vanaf alleen de bufferlijn door de uitlaatpoort te sluiten en het buffervalve in dezelfde positie te draaien als het fixatievalve. Open de uitlaatpoort en spoel de bufferlijn door, zoals eerder is gedaan voor de fixatielijn. Zodra de lijn is doorgespoeld, plaatst u de slang in de bufferfles.Test vervolgens het vermogen van het systeem om druk vast te houden. Door in de rubberen manometerbal te knijpen, zal er weerstand voelbaar zijn. Als laatste voorbereiding.Vul de perfusienaald met buffer om de introductie van lucht te voorkomen. Het systeem is nu klaar voor perfusie. Nadat een mengsel van ketamine en xylazine is toegediend en het chirurgische vlak van anesthesie via de teenknijpmethode is gecontroleerd, wordt de volledig geanestheseerde rat op een ondiepe schaal met geplette ijsblokjes geplaatst.Ga niet verder voordat het dier volledig is geanestheseerd. Begin de operatie met een laterale incisie van vijf tot zes centimeter door het integument en de buikwand, net onder de ribbenkast. Scheid de lever voorzichtig van het diafragma.Maak een kleine incisie in het diafragma met de gebogen botte schaar. De positie en druk van uw vinger kunnen helpen bij het doorknippen van het diafragma. Zet de incisie in het diafragma voort over de gehele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte bloot te leggen.Plaats gebogen botte scharen langs één zijde van de ribben, verplaats de longen voorzichtig en maak een snede door de borstkas tot aan het sleutelbeen. Maak vervolgens een soortgelijke snede aan de contralaterale zijde. Til nu het borstbeen op en trim voorzichtig al het weefsel dat het met het hart verbindt.Klem de punt van het borstbeen vast met de hemostat en plaats de hemostat over de kop. De thorax moet worden opgetild, waardoor de grote vaten duidelijk zichtbaar worden. Maak met irisscharen een kleine incisie in het posterieure uiteinde van de linker ventrikel.Voer een stompe perfusienaald van 15 gauge of een naald met een olijfvormige punt door het ingesneden ventrikel in de ascienden aorta. De punt moet zichtbaar zijn door de wand van de aorta en mag de aortaboog niet bereiken, waar de arteria brachialis en de arteria carotis uiteenlopen. Klem het hart met een hemostat om de naald te fixeren en lekkage te voorkomen.Gebruik tot slot de irisschaar om een grote opening in het rechteratrium te maken. Let erop dat de aorta descendens niet beschadigd raakt. Op dit punt is het dier klaar om geperfundeerd te worden.Koppel de perfusienaald in het rechteratrium aan de uitlaatpoort zonder luchtbellen te introduceren en open de uitlaatpoort. Pomp vervolgens snel en gelijkmatig de manometerebal op tot een druk van 80 millimeter kwik. Handhaaf deze druk gedurende de gehele periode van de bufferinfusie.Start nu een timer. Pas de hoek van de naald aan tot de stroom het sterkst is, en schakel het buffervalve om zodra de buffer bijna op is. De vloeistof zal helder beginnen te lopen wanneer de lever is geperfuseerd.Dit is een indicatie van een goede perfusie en het tijdstip waarop de lever klaart, moet zeer snel worden genoteerd. Na deze gebeurtenis zullen fixatiebevingen waarneembaar zijn. Geef dit aan als het tijdstip van de werkelijke fixatie. Om een constante stroomsnelheid te behouden, kan de druk geleidelijk worden verhoogd tot maximaal 130 millimeters kwik.Zodra het fixatiemiddel bijna volledig is verbruikt, sluit u de uitlaatklep en noteert u het tijdstip. De rat moet nu stijf zijn. De organen van de rat kunnen nu worden geoogst. Om de hersenen te verwijderen, begint u de dissectie van de gefixeerde rat door de kop met een guillotine te verwijderen.Maak vervolgens een midline-incisie langs het integument van de nek tot aan de neus en leg de schedel bloot met een schaar, oraal. Trim het resterende nekspierweefsel weg zodat de basis van de schedel zichtbaar is. Plaats het scherpe uiteinde van een irisschaar in het foramen magnum aan één zijde en schuif de schaar voorzichtig langs het binnenoppervlak van de schedel.Maak vervolgens een incisie die doorloopt tot aan de distale rand van het posterieure schedeloppervlak. Maak een identieke incisie aan de contralaterale zijde. Gebruik daarna rongeurs om de schedel rondom het cerebellum te verwijderen.Schuif de punt van de schaar voorzichtig langs het binnenoppervlak van de schedel, van de dorsale distale posterieure hoek naar de distale frontale rand. Voorkom beschadiging van de hersenen door de punt van het blad omhoog te tillen. Herhaal deze handeling aan de tegenovergestelde zijde.Pel vervolgens met een pincet het dorsale oppervlak van de schedel van de hersenen af. Trim ook de zijkanten van de schedel weg met een pincet. Sever nu met een spatel de bulbi olfactorii en de zenuwverbindingen langs het ventrale oppervlak van de hersenen en scheid voorzichtig de hersenen van de kop.Knip met een irisschaar alle dura door die de hersenen met de schedel verbindt. Zodra de hersenen zijn verwijderd, plaatst u deze in een vial met fixeer cairan met een volume dat ten minste 10 keer groter is dan het volume van de hersenen zelf. Bewaar de vial 24 uur lang bij vier graden Celsius.Was na 24 uur de hersenen 3 keer met PBS door voorzichtig te walsen. De hersenen kunnen vervolgens worden bewaard in PBS of Hanks-gebalanceerde zoutoplossing. Met natriumazide kunnen de hersenen gedurende drie maanden worden bewaard bij vier graden Celsius.Niet gesneden. Eenmaal beheerst, kan de volledige perfusie in vijf tot acht minuten worden voltooid.

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video describes a procedure for mouse liver perfusion through the portal vein using collagenase solution prior to isolating liver cells.

In Vivo Murine Liver Perfusion: A Method to Infuse the Rodent Liver with Solution via the Portal Vein

Hier presenteren we een histologische methode voor het vastleggen, etikettering, optisch opruimen, en het afbeelden van de intacte hersenen weefsel-interface rond chronisch geïmplanteerde Microdevices in knaagdieren hersenweefsel. Resultaten van de technieken die deze methode bruikbaar voor het begrijpen van de invloed van verschillende penetrerende brain-implantaten hun omringende weefsel.

Intact Histologische Karakterisering van Brain-geïmplanteerde Microdevices en het omringende weefsel

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Hier presenteren we twee nieuwe methodologieën, psPACT en mPACT, voor het bereiken van maximale optische transparantie en latere microscopische analyse van weefsel therapieën in het intact knaagdier hele CNS.

Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.

Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen

Een protocol wordt beschreven voor in situ perfusie van het onderlichaam van de muis, met inbegrip van de blaas, de prostaat, geslachtsorganen, bot, spier en voethuid.

Oprichting van In Situ Closed Circuit Perfusie van onderbuikorganen en achterpoten bij muizen

Dit protocol beschrijft een nieuwe rAAV-gebaseerde transient enhancer-reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om enhancer-gedreven expressie in vivo in het muizenbrein te induceren.

AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Een handige zwaartekracht-gevoede perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis wordt gepresenteerd. Immunofluorescentie detectie van gefosforyleerd α-synucleïne wordt aangetoond in een muismodel van de ziekte van Parkinson. Dit werk beschrijft ook uitgebreid de transcardiale perfusie, dissectie, weefselbevriezing / inbedding en bevroren sectiestappen.

Een zwaartekracht-gevoede transcardiale perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis

Dendritische stekels zijn postsynaptische compartimenten van de meeste excitatoire synapsen. Veranderingen in de morfologie van de dendritische wervelkolom treden op tijdens neurologische ontwikkeling, veroudering, leren en vele neurologische en psychiatrische aandoeningen, wat het belang van betrouwbare analyse van de dendritische wervelkolom onderstreept. Dit protocol beschrijft het nauwkeurig en reproduceerbaar kwantificeren van de morfologie van de dendritische wervelkolom met behulp van...

Kwantificering van de dendritische wervelkolom met behulp van automatische driedimensionale neuronreconstructiesoftware

Leer een snelle perfusiefixatiemethode voor rattenhersenweefsel met 4% paraformaldehyde onder fysiologische druk. Deze techniek zorgt voor uniforme fixatie en optimale weefselpreservatie voor immunohistochemische analyse.

Hele Animal Perfusie Fixatie voor knaagdieren

Meer video's verkennen