Name: Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Leer hoe stamceltherapie wordt geëvalueerd in een in vitro ischemie/reperfusie model met cardiale cellen. Deze methode onderzoekt celoverleving en interacties tijdens behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door OTKA (Hongaarse Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek) D45933, T049621, TET (Hongaarse Science and Technology Foundation) A4/04, Arg-17/2006 en SIN, Bolyai, Öveges Fellowships en TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 en 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83.803. We willen graag William Gesztes bedanken voor het verstrekken van de voice-over.

1. Voorbereiden H9c2 cardiomyoblast cellen H9c2 rat cardiomyoblasts werden verkregen van ATCC (Wesel, Duitsland) en uitgebreid in hoge glucose (4,5 g / L) DMEM dat 10% foetaal runderserum, 4 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. De H9c2 myoblast cellijn is afkomstig van embryonale rat hart, wordt het gebruikt als een in vitro model voor zowel de skelet-en hartspier 8,9. Bereid 12 well plaat van H9c2 cellen: <ol><li> Verwijder kweekmedium uit petrischaal van H9c2 cellen. </li><li> Twee keer wassen cellen met 5 ml PBS en verteren met 2-3 ml 0,05% trypsine / EDTA. </li><li> Plaats Petri schaal 5 minuten in het 37 ° C incubator. </li><li> Remmen trypsine met 10 ml DMEM kweekmedium. </li><li> Spin down van de cellen bij 1200 tpm gedurende 8 minuten. </li><li> Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeer cellen in 1 ml DMEM kweekmedium en tellen cellen met behulp van hemocytometer trypan blauw kleuring.</li><li> Seed 30.000 H9c2 cellen in 2 ml DMEM per putje in een 12 wells plaat. </li><li> Plaats de plaat in de 37 ° C CO 2 incubator voor 24 uur. </li></ol> 2. Gesimuleerde ischemie / reperfusie Ischemie / reperfusie werd gesimuleerd in vitro door het uitvoeren van zuurstof glucose deprivatie (OGD) op H9c2 celculturen. Deze procedure werd uitgevoerd op het podium van de Zeiss confocale microscoop met de Pecon cel incubatie-systeem (Erbach, Duitsland), zodat de controle van de cellen tijdens de OGD. <ol><li> Verwijder medium door aspiratie van 12 wells plaat van H9c2 cellen. </li><li> Twee keer wassen cellen met PBS. </li><li> Voeg 3 ml glucose-vrij medium per well. </li><li> Plaats de plaat in de cel incubatie-systeem. </li><li> Start stikstofgas om de zuurstof te zuiveren uit het incubatie-systeem. </li><li> Wacht tot het niveau van zuurstof bereikt 0,5%, dan start de timer. 0,5% zuurstof betekent ongeveer 3 mmHg gedeeltelijke spanning. Onder voorbehoud van cellen om een50 minuten van gesimuleerde ischemie. </li><li> Aan het einde van gesimuleerde ischemie, verwijder dan de glucose-vrij medium van de cellen. </li><li> Pipetteer 2 ml normaal kweekmedium aan de wells. </li><li> Plaats de 12 wells plaat gedurende 30 minuten in de 37 ° C CO 2 incubator, dit is de &quot;reperfusie periode&quot;. </li></ol> 3. Voorbereiden rescue mesenchymale stamcellen Beenmerg van menselijke oorsprong is rekening T75 kolven en verdund met Medium Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s (DMEM) kweekmedium dat 10% foetaal kalf serum (FCS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, 4 mM L-glutamine en 1 g / l glucose. De flessen werden geïncubeerd bij 37 ° C in een volledig vochtige atmosfeer van 5% CO 2 gedurende 3 dagen. Na de incubatietijd van de BMSCs gehandeld op grond van het oppervlak van de kolven en de resterende onderdelen van het beenmerg werden geëlimineerd door wassen met PBS. De gebruikte BMSCs waren tussen 1 en 5 passages in de experimenten. De Idenheid van de cellen werd bevestigd door de aanwezigheid van lijn-specifieke celoppervlaktemerkers met flowcytometrie. Hematopoietische aantal regels-specifieke oppervlakte merkers (CD34, CD45) en mesenchymale oppervlakte merkers (CD73, CD90, CD105 en CD166) werden onderzocht. Tijdens de gesimuleerde ischemie, voorbereiden rescue mesenchymale stamcellen voor transplantatie. <ol><li> Verdun de fluorescente kleurstof Vybrant DiD in verhouding 1:200 in DMEM kweekmedium. </li><li> Aspireren medium van de reddings-cellen en voeg 300 ul DMEM met Vybrant DiD. </li><li> Plaats Petri schaal gedurende 30 minuten in de 37 ° C CO 2 incubator. </li><li> Verwijder kweekmedium uit petrischaal van mesenchymale stamcellen. </li><li> Twee keer wassen cellen met 5 ml PBS en verteren met 2-3 ml 0,05% trypsine / EDTA. </li><li> Plaats Petri schaal 5 minuten in het 37 ° C incubator. </li><li> Remmen trypsine met 10 ml DMEM kweekmedium. </li><li> Spin down van de cellen bij 1200 tpm gedurende 8 minuten. </li><li> Na het verwijderen van de Supernatant, hersuspenderen cellen in 1 ml DMEM kweekmedium en tellen cellen met behulp van hemocytometer trypan blauw kleuring. </li><li> Na 30 minuten aan het einde van de reperfusie toe te voegen 20.000 mesenchymale stamcellen per goed aan de postischemic H9c2 cardiale myoblasten. </li><li> Plaats co-cultuur van cellen in de 37 ° C CO 2 incubator voor 24 uur. </li></ol> 4. Analyse met confocale microscopie Na de gesimuleerde ischemie / reperfusie schade worden cellen geïncubeerd in een normale kweekmedium voor 24 uur. <ol><li> Na 24 uur spoelen cellen tweemaal met PBS. </li><li> Vlekken op de cellen in 500 pi live / dood kleurstof oplossing gedurende 30 minuten (5 nM en 400 nM calceïne Ethidium-homodimeer-2 in PBS) (5x10 4 cellen / ml). </li></ol> De evaluatie van de confocale beelden voor levende en dode cellen geselecteerd door morfologie en fluorescentie kunnen worden uitgevoerd met de ImageJ software (National Institutes of Health, USA). In het geval van co-culturen, kan MSC&#39;s worden onderscheiden van H9c2 cellen als gevolg van hun Vybrant DiD cel etikettering. De verhouding van dode cellen kan worden geëvalueerd in vier onafhankelijke gezichtsveld (objectieve 10x) voor elke cultuur in een blinde manier 10. H9c2 cardiomyoblasts gekweekt op 42 mm glas dekglaasjes kan ook worden onderzocht met time lapse video-microscopie tijdens en na ischemie / reperfusie schade met behulp van de cel incubatie systeem van de confocale microscoop. Cel-cel interacties zoals celfusie en de vorming van intercellulaire nanobuisjes kunnen worden bestudeerd in de tijd. 5. Analyse met flowcytometrie Na de gesimuleerde ischemie / reperfusie schade worden cellen geïncubeerd in een normale kweekmedium voor 24 uur. <ol><li> Na 24 uur, de oogst van de cultuur media. Het is erg belangrijk aan het kweekmedium verzamelen ook omdat sommige dode cellen zou kunnen hebben losgemaakt van de cultuur schotel oppervlak tijdens de 24 uur incubatieTIE. </li><li> Twee keer wassen cellen met PBS en verteren met 0,05% trypsine-EDTA. </li><li> Remmen trypsine met DMEM kweekmedium. </li><li> Spin down van de cellen en de geoogste kweekmedium op 1200 RPM (ongeveer 150-200g) gedurende 8 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant. </li><li> Hang de cellen in 500 pi live / dood kleurstof oplossing gedurende 30 minuten (5 nM en 400 nM calceïne Ethidium-homodimeer-2 in PBS) (5x10 4 cellen / ml). </li><li> Overdracht cellen om cytometrie buizen stromen. </li><li> Start de CellQuest Pro software. </li><li> Voor het instellen van de flowcytometer voor metingen, voorbereiden controlemonsters van levende en dode cellen. <ol class="lalpha"><li> Plaat H9c2 cellen bij een dichtheid van 3x10 4 in 12-well platen, zoals beschreven in punt 1. </li><li> Bereid levende cellen controles met enkele trypsinisation zoals beschreven in punt 1. </li><li> Bereid dode cel controles door de behandeling met 10 uM H 2 O 2 voor 1 uur. </li><li> Na trypsinisation, resuspend levende en dode cellen controles in 500 pi live / dead kleurstof oplossing (5 nM calceïne-AM en 400 nM Ethidium-homodimeer-2 in PBS). </li></ol></li><li> De instrumentele instellingen moeten worden aangepast, zodat de levende cellen calceïne positieve en ethidium homodimeer negatief, terwijl de dode cellen worden calceïne negatief en ethidium homodimeer positief. </li><li> Het percentage van deze populaties kan worden uitgedrukt als bars op een grafiek en statistische analyse kan worden uitgevoerd op deze waarden. </li><li> Het meten van de verschillende experimentele groepen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Onze resultaten laten zien dat toegevoegde mesenchymale stamcellen zou het overleven van postischemic hartcellen te verbeteren. Confocale microscopie beelden onthuld direct cel-cel interacties, zoals de gedeeltelijke membraan verbinding of intercellulaire nanobuisjes, die waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de waargenomen bescherming 10. Deze nanobuisjes overspanning over afstanden van enkele cel diameters, en hun diameter zijn tussen de 200 en 500 nm (witte pijlen). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Nanobuis formatie tussen de cellen. Nanotube vorming van (witte pijl) werd waargenomen tussen Vybrant DIO gelabeld cardiomyoblasts en Vybrant DiD gelabelde mesenchymale stamcellen. Flowcytometrie analyse toonde de bevolking te overleven en necrotische cardiomyoblasts en mesenchymale stamcellen. Interessant is dat we ook waargenomen een derde, &#39;gewond&#39; cardiomyoblast celpopulatie die calceïne bevatte, maar bevatte ook de indicator van de dode cellen, ethidium homodimeer (Figuur 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Representatieve dot-plot van de verschillende celpopulaties na gesimuleerde ischemie. De evaluatie van de verschillende experimenten showed dat de toevoeging van mesenchymale stamcellen te postischemic H9c2 cardiomyoblast aanzienlijk verhoogd het percentage levende cellen ten opzichte van de cardiale myoblasten alleen gekweekte na ischemie (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. . Effect van stamcel behandeling op postischemic cardiomyoblasts Percentage van levende cellen werd significant verlaagd na gesimuleerde ischemie in vergelijking met controle (controle vs IR-model: 90.36 ± 2.60 vs 10,52 ± 0,48, *** p&gt; 0,001), die toenam na de toevoeging van mesenchymale stamcellen (IR-model versus IR + BMSC: 10.52 ± 0.48 vs 25,21 ± 2,13, *** p&gt; 0,001). De gegevens zijn gemiddelden ± SEM. Statistische analyse van de gegevens werd uitgevoerd met behulp van one-way variantie analyse met meerdere vergelijking bericht Tukey&#39;s hoc test.

<ol><li>Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Therapy+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).</li>
<li>Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+bone+regeneration-Bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).</li>
<li>Gaipa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-based+CD133%2B+cells+isolation+maintains+progenitor+angiogenic+properties+and+enhances+standardization+in+cardiovascular+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).</li>
<li>Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+human+stem+cell+therapeutic+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medicine%22%5BJournal%5D)">New perspectives in human stem cell therapeutic research.</a> BMC medicine. 7, 29-29 (2009).</li>
<li>Mazhari, R., Hare, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+mesenchymal+stem+cells+in+cardiac+repair%3A+potential+influences+on+the+cardiac+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).</li>
<li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).</li>
<li>Sardao, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+of+H9c2+myoblasts+exposed+to+tert-butylhydroperoxide--characterization+of+morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death.</a> BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).</li>
<li>Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+biochemical%2C+and+electrophysiological+characterization+of+a+clonal+cell+%28H9c2%29+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart.</a> Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).</li>
<li>Cselenyak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+rescue+cardiomyoblasts+from+cell+death+in+an+in+vitro+ischemia+model+via+direct+cell-to-cell+connections%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections.</a> BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).</li>
<li>Sauvant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+in+vitro+model+system+for+investigation+of+reperfusion+damage+after+renal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).</li>
<li>Namas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Induced+Overexpression+of+BNIP3+is+Not+Dependent+on+Hypoxia-Inducible+Factor+1alpha+in+Mouse+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes.</a> Shock. 36, 196-196 (2011).</li>
<li>Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2FReoxygenation+Up-Regulated+the+Expression+of+Death+Receptor+5+and+Enhanced+Apoptosis+in+Human+Hepatocyte+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line.</a> Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).</li>
<li>Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+neuronal+cell+death+in+acute+and+delayed+in+vitro+ischemia+%28oxygen-glucose+deprivation%29+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).</li>
<li>Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+a+revolution+in+therapeutics--recent+advances+in+stem+cell+biology+and+their+therapeutic+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).</li>
<li>Angoulvant, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+conditioned+media+attenuates+in+vitro+and+ex+vivo+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury.</a> J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).</li>
<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
<li>Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-receptor-mediated+protection+of+cerebral+endothelial+cell+viability+and+mitochondrial+function+after+ischemic+insult+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De aangetoonde protocol is een in vitro benadering van de veel meer complexe kwestie van stamceltherapie in myocard infarct, met alle voordelen en nadelen van een dergelijk model. Uiteraard kan het geen afspiegeling van het complex (bijvoorbeeld immunologische) evenementen die plaatsvinden tijdens en na het hartinfarct, maar kan zich richten op de directe effecten van de toegevoegde cellen op het postischemic cellen. De effecten van gesimuleerde ischemie op H9c2 cardiomyoblasts sterk afhankelijk van het tijdstip van OGD...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> calceïne-AM </td><td> Molecular Probes </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> ethidium homodimeer-2 </td><td> Molecular Probes </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Vybrant DiD </td><td> Molecular Probes </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het apparaat </td><td> Vennootschap </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Pecon cel incubatie systeem voor Zeiss microscopen </td><td> Pecon GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Equipment.

stamceltransplantatie in een in vitro gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamceltransplantatie protocollen vinden hun weg naar de klinische praktijk 1,2,3. Beter resultaat, waardoor de protocollen robuuster, en het vinden van nieuwe bronnen voor de implanteerbare cellen zijn de focus van recent onderzoek 4,5. Onderzoek naar de effectiviteit van de cel therapieën is niet een gemakkelijke taak en zijn nieuwe instrumenten nodig om de mechanismen betrokken bij het ​​behandelingsproces zes onderzoeken. We ontwierpen een experimenteel protocol van ischemie / reperfusie in om het observeren van cellulaire verbindingen en zelfs subcellulaire mechanismen tijdens ischemie / reperfusie schade en na stamceltransplantatie mogelijk te maken en de effectiviteit van celtherapie te evalueren. H9c2 cardiomyoblast cellen werden geplaatst op celcultuur platen 7,8. Ischemie werd gesimuleerd met 150 minuten in een glucose-vrij medium met zuurstof niveau lager dan 0,5%. Daarna werden de normale media en zuurstof niveaus opnieuw naar reperfusie te simuleren. Na zuurstof glucose ontbering,de beschadigde cellen werden behandeld met de transplantatie van gelabelde menselijke beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen toe te voegen aan de cultuur. Mesenchymale stamcellen de voorkeur in klinische studies, omdat ze gemakkelijk te bereiken met minimaal invasieve chirurgie, gemakkelijk uitbreidbaar en autologe. Na 24 uur co-teelt, werden cellen gekleurd met calceïne en ethidium-homodimeer onderscheid te maken tussen levende en dode cellen. Deze opzet liet ons toe om de intercellulaire verbindingen met behulp van confocale fluorescentie microscopie te onderzoeken en om de overleving van postischemic cellen door flowcytometrie kwantificeren. Confocale microscopie toonde de interacties van de twee celpopulaties zoals celfusie en de vorming van intercellulaire nanobuisjes. Flowcytometrie analyse bleek drie clusters van beschadigde cellen die kunnen worden uitgezet in een grafiek en statistisch geanalyseerd. Deze populatie kunnen afzonderlijk worden onderzocht en conclusies kunnen worden getrokken over deze gegevens over de effectiviteit van de gesimuleerdetherapeutische aanpak.

Laten we zien hoe het opzetten van een<em&gt; In vitro</em&gt; Ischemie / reperfusie model en hoe het effect van de stamceltherapie op postischemic cardiale cellen te evalueren.

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Protocollen voor stamceltransplantatie vinden hun weg naar de klinische praktijk1,2,3. Om betere resultaten te behalen, de protocollen robuuster te maken en ...

Uit het hart afgeleide cellen worden op celkweekplaten geplaatst voor gesimuleerde ischemie. Het reperfusiemodel voor ischemie wordt bereikt door 150 minuten in een glucosevrij medium te verblijven, terwijl het zuurstofgehalte onder 0,5% ligt. Deze ischemische periode leidt tot het krimpen en opbollen van de meeste cellen. Vervolgens worden normale media en zuurstofgehaltes herintroduceerd om reperfusie te simuleren.Mesenchymale stamcellen worden toegevoegd en samen met de beschadigde cellen gekweekt. Na 24 uur cocultivatie worden de cellen gekleurd met calcium en Ethereum homodimeer om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen; een confocale microscoop laat duidelijk twee celpopulaties en hun interacties zien. Flowcytometrie-analyse onthult drie clusters van beschadigde cellen, die in een grafiek kunnen worden uitgezet en statistisch kunnen worden geanalyseerd. Protocollen voor stamceltransplantatie vinden hun weg naar de klinische praktijk; het behalen van betere resultaten, het robuuster maken van de protocollen en het vinden van nieuwe bronnen voor implanteerbare cellen vormen de focus van recent onderzoek.Het onderzoeken van de effectiviteit van celtherapieën is geen eenvoudige taak en er zijn nieuwe instrumenten nodig om de mechanismen die betrokken zijn bij het behandelingsproces te bestuderen. Wij hebben een experimenteel protocol ontworpen om de observatie van cellulaire verbindingen en zelfs subcellulaire mechanismen mogelijk te maken tijdens ischemie, perfusieschade en na stamceltransplantatie. Onze ontwerpcriteria behelzen een volledig in vitro systeem, waarin uitsluitend de gastheer- en donorcellen aanwezig zijn.Zo is het geïsoleerd van het omringende weefsel. Continue meting van de celviabiliteit vóór, tijdens en na het letsel gedurende maximaal 24 uur. En een duidelijke identificatie van beide celpopulaties, zodat het lot van de getransplanteerde cellen kan worden gevolgd.Om dit doel te bereiken, hebben we een protocol opgezet van zuurstof- en glucosedeprivatie, algemeen afgekort als OGD, gevolgd door een reoxygenatieperiode. Als gastcellen hebben we C2-cellen van negen dagen oud gekozen via een bekende rode cardiomyoblasten-cellijn. Na OGD werden de beschadigde cellen ondersteund door transplantatie van uit het beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen door deze aan de cultuur toe te voegen.Deze opstelling stelde ons in staat om de intercellulaire verbindingen te onderzoeken met behulp van confocale microscopie en om de overlevingskans van beschadigde cellen te kwantificeren via flowcytometrie. Laten we aan de slag gaan en kijken hoe we dit doen. Verwijder het kweekmedium van de H nine C two cellen.Was de cellen twee keer met PBS en verteer ze met 0,05%trypsin EDTA in de petrischalen gedurende vijf minuten. Rem de trypsine in een incubator van 37 °C met DMEM-kweekmedium. Centrifugeer de cellen bij 1200 RPM gedurende acht minuten.Nadat het supernatant is verwijderd, worden de cellen geresuspendeerd in 1 mL DMEM-kweekmedium. Tel de cellen met een cytometer met behulp van trypaanblauw-kleuring. Zaai 30.000 H9-cellen per putje in een 12-wells plaat. Plaats de plaat gedurende 24 uur in een incubator bij 37 °C en CO₂. Verwijder het medium door aspiratie en was de cellen twee keer met PBS.Voeg drie millimeter glucosevrij medium toe. Plaats de plaat in het celincubatiesysteem. Start de stikstofgasstroom om de zuurstof uit het incubatiesysteem te verdrijven.Wacht tot het zuurstofgehalte 0,5% bereikt. Start vervolgens de timer; 0,5% zuurstof komt overeen met een partiële spanning van ongeveer drie millimeter kwik. Stel de cellen 150 minuten bloot aan gesimuleerde ischemie. Tijdens de ischemie raken cellen los van het oppervlak en begint hun membraan op te bollen. We hebben vastgesteld dat elke populatie een iets andere tijdsduur nodig heeft, totdat een 60 tot 80% van het celbeeld wordt bereikt.Daarom raden we aan om te beginnen met de tweede R-incubatie. Als dit onvoldoende is, kan de tijd van OGD worden verlengd. In ons geval hebben C2-cellen van negen weken oud doorgaans 150 tot 170 minuten OGD nodig aan het einde van de gesimuleerde ischemie.Verwijder het glucosevrije medium bij de cellen en pipetteer normaal cultuurmedium in de wells. Plaats de 12-wells plaat gedurende 30 minuten in de 37 °C CO₂-incubator. Dit is de reperfusieperiode.Bereid tijdens de gesimuleerde ischemie de rescue-cellen voor op transplantatie. Verdun de fluorescerende kleurstof, vibrant DID, in een verhouding van 1:200 in DMEM-kweekmedium. Aspireer het medium van de rescue-cellen en voeg 300 µL DMEM met vibrant toe; plaats de Petri-schalen gedurende 30 minuten in de 37 °C CO₂-incubator.Na 30 minuten aan het einde van de reperfusie werden duizend mesenchymale stamcellen per well toegevoegd aan de post-ischemische H9C2 cardiale myoblasten. De initiële stappen zijn gelijk aan het uitplaten van H9C2: twee keer wassen met PBS, trypsiniseren en tellen. Plaats de co-cultuur van cellen gedurende 24 uur in de 37 °C koolstofdioxide-incubator.Na 24 uur wordt het kweekmedium en de adherente cellen uit de wells geoogst met behulp van ization. Het is zeer belangrijk om ook het kweekmedium op te vangen, omdat sommige dode cellen tijdens de incubatie van 24 uur kunnen zijn losgekomen van het oppervlak van de kweekschaal.Suspendeer de cellen in 500 µL live, dead, die-oplossing, 5 $\mu$M calcium en 400 $\mu$M Ethereum-homodimeer in PBS, met een concentratie van 5 × 10⁴ cellen per mL. In het geval van coculturen worden mesenchymale stamcellen onderscheiden van H9C2-cellen door de respectievelijke fluorescente celmarkering. Op deze manier is het mogelijk om celfusie en cel-op-cel-contactplaatsen te detecteren.De ratio van dode cellen kan worden geëvalueerd in vier onafhankelijke gezichtsvelden, gebruikmakend van een 10x objectief voor elke cultuur in een geblindeerde procedure, wat een reproduceerbaar resultaat voor de cel telling oplevert. Breng de cellen over naar flowcytometrie-buisjes. Start de cell Quest Pro-software om de flowcytometer in te stellen voor de meting.Bereid controlemonsters van levende en dode cellen voor. Levende cellen worden gekweekt bij dezelfde dichtheid onder normale omstandigheden en worden gekleurd met calcium. Dode cellen worden voorbereid door een behandeling van één uur met 10 micromole waterstofperoxide, gekleurd met Ethereum homodimeer, en op dezelfde wijze geoogst. De instrumentinstellingen moeten worden aangepast zodat de levende cellen calcium-positief en Ethereum homodimeer-negatief zijn.Hoewel de dode cellen calcium-negatief en Ethereum-homodimeer-positief zijn, kan het percentage van deze populaties worden weergegeven als staven in een grafiek en kan er een statistische analyse op deze waarden worden uitgevoerd. We stelden vast dat de toevoeging van gezonde stamcellen de ratio van overlevende cellen in de populatie verhoogt. Opvallend genoeg observeerden we ook dat de cellen die na de beschadiging gered waren, gescheiden konden worden (ge-gate) van zowel de dode cellen als de cellen die in leven bleven.Wij zijn van mening dat deze populatie verdere onderzoeken rechtvaardigt. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe gesimuleerde ischemie-experimenten met in vitro stamceltransplantatie op een gestandaardiseerde manier kunnen worden uitgevoerd. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten. Mocht u technische vragen hebben, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen. Wij staan klaar om u te helpen.

stem-cell-transplantation-an-vitro-simulated-ischemiareperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De chirurgische procedure voor de levering van embryonale stamcel-afgeleide endotheelcellen van de ischemische achterbeen is aangetoond, met niet-invasieve tracking door bioluminescentie imaging.

Embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

Een muismodel van cerebrale ischemie-reperfusie is gevestigd te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. We distally de rechts midden cerebrale slagader en rechts gemeenschappelijke halsslagader afbinden en bloedstroom herstellen na 10 of 40 min van ischemie.

Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie

Hier beschrijven we een pre-klinisch diermodel voor het bestuderen van de pathofysiologie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie. Dit gratis Skin flap model op basis van de oppervlakkige caudal epigastrische vaten in de rat kan ook de evaluatie van verschillende therapieën en verbindingen mogelijk maken om schade door ischemie-reperfusie letsel te neutraliseren.

Een pre-klinische rat model voor de studie van ischemie-reperfusie letsel in reconstructieve microchirurgie

We hebben getracht een varkensmodel van hartfalen op te stellen dat werd veroorzaakt door linker slagaderblokkades en snelle pacing om het effect en de veiligheid van intramyocardiale toediening van stamcellen voor celgebaseerde therapieën te testen.

Vaststelling van een varkensmodel van post-myocard hartinfarct voor stamcelbehandeling

Stamcellen worden voortdurend onderzocht als mogelijke behandelingen voor personen met myocardiale schade, maar hun verminderde levensvatbaarheid en retentie in gewond weefsel kan hun werkzaamheid op lange termijn beïnvloeden. In dit manuscript beschrijven we een alternatieve methode voor stamcellevering in een murinemodel van ischemie reperfusieletsel.

Vertraagde intramyocardial levering van stamcellen na Ischemie Reperfusie Letsel in een Murine Model

Ruimtelijke afstand is een belangrijke parameter bij het beoordelen van hypoxie / reoxygenatieletsel in een co-cultuurmodel van afzonderlijke endotheel- en cardiomyocytencellagen, wat voor het eerst suggereert dat het optimaliseren van de co-culturele ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming.

Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen

Dit artikel beschrijft ischemie-reperfusie (I / R) modellering in een 3-daags kuikenembryo met behulp van een spinale naald aangepaste haak om de I / R-ontwikkeling en -behandeling beter te begrijpen. Dit model is eenvoudig, snel en goedkoop.

Generatie van Haak Ischemie-Reperfusie Model met behulp van een driedaagse ontwikkelende kuiken embryo

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

Het protocol heeft tot doel methoden te bieden voor encefalomyosynangiose - enting van een vasculaire temporalis-spierflap op het piale oppervlak van ischemisch hersenweefsel - voor de behandeling van niet-moyamoya acute ischemische beroerte. De werkzaamheid van de aanpak bij het verhogen van angiogenese wordt geëvalueerd met behulp van een voorbijgaand midden-hersenslagader occlusiemodel bij muizen.

Een model voor encefalomyosynangiose behandeling na middelste cerebrale arterie occlusie-geïnduceerde beroerte bij muizen

Hier beschrijven we een in vitro protocol om hypoxie/reoxygenatieschade te modelleren in de sterk metabole proximale tububulaire epitheelcellen. Dit model is ontworpen om schade veroorzaakt door metabole stress te induceren, die kan worden gemeten door de expressie van proximale tubuli-schademarkers en de beoordeling van de mitochondriale ademhalingsfunctie.

Modellering van hypoxie/reoxygenatieschade in proximale tubulära epitheelcellen

Leer hoe stamceltherapie wordt geëvalueerd in een in vitro ischemie/reperfusie model met cardiale cellen. Deze methode onderzoekt celoverleving en interacties tijdens behandeling.

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Meer video's verkennen