Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Uit het hart afgeleide cellen worden op celkweekplaten geplaatst voor gesimuleerde ischemie. Het reperfusiemodel voor ischemie wordt bereikt door 150 minuten in een glucosevrij medium te verblijven, terwijl het zuurstofgehalte onder 0,5% ligt. Deze ischemische periode leidt tot het krimpen en opbollen van de meeste cellen. Vervolgens worden normale media en zuurstofgehaltes herintroduceerd om reperfusie te simuleren.

Mesenchymale stamcellen worden toegevoegd en samen met de beschadigde cellen gekweekt. Na 24 uur cocultivatie worden de cellen gekleurd met calcium en Ethereum homodimeer om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen; een confocale microscoop laat duidelijk twee celpopulaties en hun interacties zien. Flowcytometrie-analyse onthult drie clusters van beschadigde cellen, die in een grafiek kunnen worden uitgezet en statistisch kunnen worden geanalyseerd. Protocollen voor stamceltransplantatie vinden hun weg naar de klinische praktijk; het behalen van betere resultaten, het robuuster maken van de protocollen en het vinden van nieuwe bronnen voor implanteerbare cellen vormen de focus van recent onderzoek.

Het onderzoeken van de effectiviteit van celtherapieën is geen eenvoudige taak en er zijn nieuwe instrumenten nodig om de mechanismen die betrokken zijn bij het behandelingsproces te bestuderen. Wij hebben een experimenteel protocol ontworpen om de observatie van cellulaire verbindingen en zelfs subcellulaire mechanismen mogelijk te maken tijdens ischemie, perfusieschade en na stamceltransplantatie. Onze ontwerpcriteria behelzen een volledig in vitro systeem, waarin uitsluitend de gastheer- en donorcellen aanwezig zijn.

Zo is het geïsoleerd van het omringende weefsel. Continue meting van de celviabiliteit vóór, tijdens en na het letsel gedurende maximaal 24 uur. En een duidelijke identificatie van beide celpopulaties, zodat het lot van de getransplanteerde cellen kan worden gevolgd.

Om dit doel te bereiken, hebben we een protocol opgezet van zuurstof- en glucosedeprivatie, algemeen afgekort als OGD, gevolgd door een reoxygenatieperiode. Als gastcellen hebben we C2-cellen van negen dagen oud gekozen via een bekende rode cardiomyoblasten-cellijn. Na OGD werden de beschadigde cellen ondersteund door transplantatie van uit het beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen door deze aan de cultuur toe te voegen.

Deze opstelling stelde ons in staat om de intercellulaire verbindingen te onderzoeken met behulp van confocale microscopie en om de overlevingskans van beschadigde cellen te kwantificeren via flowcytometrie. Laten we aan de slag gaan en kijken hoe we dit doen. Verwijder het kweekmedium van de H nine C two cellen.

Was de cellen twee keer met PBS en verteer ze met 0,05%trypsin EDTA in de petrischalen gedurende vijf minuten. Rem de trypsine in een incubator van 37 °C met DMEM-kweekmedium. Centrifugeer de cellen bij 1200 RPM gedurende acht minuten.

Nadat het supernatant is verwijderd, worden de cellen geresuspendeerd in 1 mL DMEM-kweekmedium. Tel de cellen met een cytometer met behulp van trypaanblauw-kleuring. Zaai 30.000 H9-cellen per putje in een 12-wells plaat. Plaats de plaat gedurende 24 uur in een incubator bij 37 °C en CO₂. Verwijder het medium door aspiratie en was de cellen twee keer met PBS.

Voeg drie millimeter glucosevrij medium toe. Plaats de plaat in het celincubatiesysteem. Start de stikstofgasstroom om de zuurstof uit het incubatiesysteem te verdrijven.

Wacht tot het zuurstofgehalte 0,5% bereikt. Start vervolgens de timer; 0,5% zuurstof komt overeen met een partiële spanning van ongeveer drie millimeter kwik. Stel de cellen 150 minuten bloot aan gesimuleerde ischemie. Tijdens de ischemie raken cellen los van het oppervlak en begint hun membraan op te bollen. We hebben vastgesteld dat elke populatie een iets andere tijdsduur nodig heeft, totdat een 60 tot 80% van het celbeeld wordt bereikt.

Daarom raden we aan om te beginnen met de tweede R-incubatie. Als dit onvoldoende is, kan de tijd van OGD worden verlengd. In ons geval hebben C2-cellen van negen weken oud doorgaans 150 tot 170 minuten OGD nodig aan het einde van de gesimuleerde ischemie.

Verwijder het glucosevrije medium bij de cellen en pipetteer normaal cultuurmedium in de wells. Plaats de 12-wells plaat gedurende 30 minuten in de 37 °C CO₂-incubator. Dit is de reperfusieperiode.

Bereid tijdens de gesimuleerde ischemie de rescue-cellen voor op transplantatie. Verdun de fluorescerende kleurstof, vibrant DID, in een verhouding van 1:200 in DMEM-kweekmedium. Aspireer het medium van de rescue-cellen en voeg 300 µL DMEM met vibrant toe; plaats de Petri-schalen gedurende 30 minuten in de 37 °C CO₂-incubator.

Na 30 minuten aan het einde van de reperfusie werden duizend mesenchymale stamcellen per well toegevoegd aan de post-ischemische H9C2 cardiale myoblasten. De initiële stappen zijn gelijk aan het uitplaten van H9C2: twee keer wassen met PBS, trypsiniseren en tellen. Plaats de co-cultuur van cellen gedurende 24 uur in de 37 °C koolstofdioxide-incubator.

Na 24 uur wordt het kweekmedium en de adherente cellen uit de wells geoogst met behulp van ization. Het is zeer belangrijk om ook het kweekmedium op te vangen, omdat sommige dode cellen tijdens de incubatie van 24 uur kunnen zijn losgekomen van het oppervlak van de kweekschaal.

Suspendeer de cellen in 500 µL live, dead, die-oplossing, 5 $\mu$M calcium en 400 $\mu$M Ethereum-homodimeer in PBS, met een concentratie van 5 × 10⁴ cellen per mL. In het geval van coculturen worden mesenchymale stamcellen onderscheiden van H9C2-cellen door de respectievelijke fluorescente celmarkering. Op deze manier is het mogelijk om celfusie en cel-op-cel-contactplaatsen te detecteren.

De ratio van dode cellen kan worden geëvalueerd in vier onafhankelijke gezichtsvelden, gebruikmakend van een 10x objectief voor elke cultuur in een geblindeerde procedure, wat een reproduceerbaar resultaat voor de cel telling oplevert. Breng de cellen over naar flowcytometrie-buisjes. Start de cell Quest Pro-software om de flowcytometer in te stellen voor de meting.

Bereid controlemonsters van levende en dode cellen voor. Levende cellen worden gekweekt bij dezelfde dichtheid onder normale omstandigheden en worden gekleurd met calcium. Dode cellen worden voorbereid door een behandeling van één uur met 10 micromole waterstofperoxide, gekleurd met Ethereum homodimeer, en op dezelfde wijze geoogst. De instrumentinstellingen moeten worden aangepast zodat de levende cellen calcium-positief en Ethereum homodimeer-negatief zijn.

Hoewel de dode cellen calcium-negatief en Ethereum-homodimeer-positief zijn, kan het percentage van deze populaties worden weergegeven als staven in een grafiek en kan er een statistische analyse op deze waarden worden uitgevoerd. We stelden vast dat de toevoeging van gezonde stamcellen de ratio van overlevende cellen in de populatie verhoogt. Opvallend genoeg observeerden we ook dat de cellen die na de beschadiging gered waren, gescheiden konden worden (ge-gate) van zowel de dode cellen als de cellen die in leven bleven.

Wij zijn van mening dat deze populatie verdere onderzoeken rechtvaardigt. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe gesimuleerde ischemie-experimenten met in vitro stamceltransplantatie op een gestandaardiseerde manier kunnen worden uitgevoerd. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten. Mocht u technische vragen hebben, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen. Wij staan klaar om u te helpen.