Name: Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Leer een Cre-LoxP-recombinatiemethode om celfusie in vivo te detecteren met luminescentiebeeldvorming in muizen. Deze techniek maakt real-time tracking van fusieproducten mogelijk voor onderzoek naar stamcelbiologie en kanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Peiman Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) bedanken voor ruim het verstrekken van de H1 MSC&#39;s, en Dr Tim Hacker, Dr Gouqing Song en mevrouw Jill Koch van de Universiteit van Wisconsin Cardiovasculaire Fysiologie Core Faciliteit voor het uitvoeren van de muis operaties. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation door middel van een Graduate Research Fellowship aan Brian Freeman en NIH R21 HL089679.

1. Donor celtransfectie <ol><li> Oogst mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s, afgeleid van H1 embryonale stamcellen gedoneerd door Dr Peiman Hematti, als alternatief, elk celtype van elke soort hypothese te fuseren in vivo kunnen worden gebruikt) bij 70 - 80% samenvloeiing met 1X trypsine (Mediatech, Manassas VA) gedurende 5 minuten. Inactiveer trypsine met α-MEM compleet medium (antibiotica vrij, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zorgvuldig aspireren supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml 1X PBS en te tellen cellen met behulp van een hemacytometer. </li><li> Transfer 1.5 x 10 6 cellen om een 1,5 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zorgvuldig aspireren supernatant. Resuspendeer pellet in 300 ui van R Buffer (Neon Transfectie System, Invitrogen) en 6 ug (2 ug / 5,0 x 10 5 cellen) van de p231 pCMVe-betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). Plaats 3 mL van E Buffer (InvitrOgen) in de elektroporatie docking port per protocol van de fabrikant (Neon Transfectie System, Invitrogen). </li><li> Transfer cel-plasmide oplossing voor een 100 ul Neon pipet en electroporate met een pulsduur van 20 ms en een omvang van 1500 volt. Plaats geëlektroporeerd cellen in een 15 ml conische buis met 9,7 ml α-MEM compleet medium. </li><li> Herhaal stap 1.5 nog twee keer en het zwembad getransfecteerde cellen tot een totaal volume van 10 ml te verkrijgen. Voeg de 10 ml celsuspensie (1,5 x 10 6 cellen) om een T175 fles met 10 ml α-MEM compleet medium. Levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie is ongeveer 30%, tot een opbrengst van circa 4,5 x 10 5 levensvatbare cellen per T175. </li><li> Verandering α-MEM complete medium 24 uur na transfectie. </li><li> Oogst getransfecteerde cellen bij 70 - 80% samenvloeiing (~ 2 - 3 dagen na elektroporatie). Voer celgetal met behulp van een hemacytometer en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1,0 x 10 6cells/50 ul van α-MEM compleet medium. Minimaliseren van de tijd door te brengen cellen in suspensie tot celdood alvorens terug te brengen tot injectie. </li></ol> 2. Intramyocardial Injectie <ol><li> Induceren verdoving door isofluraan (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, St. Joseph, MO) van transgene muizen ontwikkeld om constitutief te uiten Cre recombinase in elke cel (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). </li><li> Verwijder het haar van de borst regio met behulp van tondeuses of chemische hair remover. </li><li> Intuberen met een 18 gauge katheter (Becton Dickinson &amp; Co, Franklin Lakes NJ) en leg ze op de muis ventilator op 120 tot 130 ademhalingen per minuut, met een slagvolume van 150 ul. </li><li> Maak laterale incisie in de vierde intercostale ruimte waardoor een thoracotomie. </li><li> Visualiseren van het hart, maken twee 25 pi injecties van getransfecteerde cel suspensie op met een 1 ml spuit (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) en 28 gauge naald (Bectop Dickinson &amp; Co, Franklin Lakes NJ). Om het gemak van de intramyocardial injectie en het voorkomen van overmatige schade aan het orgaan, buig de naald kop ~ 90 graden. </li><li> Na de injectie, gebruik van resorbeerbare hechtingen (bijvoorbeeld Vicryl) aan de ribben en de spieren lagen te sluiten. Hechtdraad de huid gesloten met 4-0 nylon of zijde. </li><li> Laat de muis om te herstellen van anesthesie en extuberen. </li><li> Controlegroep moet Cre muizen die medium injecties alleen, Cre muizen die dezelfde concentratie van ongetransfecteerde cellen en wild-type muizen die getransfecteerde cellen (als alternatief, Cre muizen die getransfecteerde cellen niet gevoelig voor zekering). </li></ol> 3. Biophotonic Imaging <ol><li> Vijf tot vijftien minuten voor beeldvorming, intraperitoneaal (IP) injecteren 10 pi per gram van de muis lichaamsgewicht van 15 mg / ml D-Luciferine (Remklauw Life Sciences, Hopkinton, MA). </li><li> Veroorzaken anesthesie op muizen via isofluraan op 4% voor inductie eend 1 - 2% voor onderhoud. </li><li> Plaats muizen liggende in de beeldvorming doos met gezichtsmasker toedienen van 1 - 2% isofluraan voor onderhoud anesthesie (Xenogen Biophotonic Imaging System, Hopkinton, MA). Meerdere muizen kunnen gelijktijdig worden afgebeeld. Afbeelding sham control muis met experimentele muizen voor een eenvoudige vergelijking van de chemiluminescentie-signaal. </li><li> Met behulp van Living Image software (Xenogen), stel de juiste belichting tijd (meestal 60 sec, zie resultaten). Set gebied van het beeld aan muizen fit en houd gebied consequent door beeldvorming op veranderingen in de gevoeligheid te voorkomen. Zet onderwerp hoogte van 4,5 cm. </li><li> Verwerven luminescentie-intensiteit signaal dat overeenkomt met de muis of muizen binnen het zicht veld en op te slaan ongewijzigde beeldbestanden. Beelden verwerken op de achtergrond signaal overeenkomt met een controle of ongemanipuleerde muis te verwijderen. Intensiteit waarden boven achtergrond komen overeen met gefuseerde cellen in het dier. Intensiteit analyse kan worden uitgevoerd met behulp van Living Image software (Xenogen) of open source software voor beeldanalyse. Typically, een regio van belang (ROI) is geselecteerd om de intensiteit gegevens te vergelijken tussen dieren en experimenten. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Voor het bepalen van de gevoeligheid van de Xenogen Biophotonic Imaging System, een cellijn, die constitutief uitdrukt luciferase (231-LUC-D3H1, Xenogen) werd geleverd aan het myocard van C57/Bl6 muizen (Jackson Laboratory). Cellen werden ingespoten bij concentraties van 1 x 10 6, 1 x 10 3, of 1 x 10 1-cellen. Zes uur na de levering cel, werden de muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met luciferine en beeld gebracht met behulp van de Xenogen systeem. Een specifiek signaal kon worden gedetecteerd met 1.000 cellen (2 van 6 muizen afgebeeld, figuur 2), maar detectie werd betrouwbaarder met 10.000 cellen (6 van 6 muizen afgebeeld). Belangrijk is dat dit onderzoek diende ook om een ​​ruwe correlatie tussen het aantal luciferase-expressie cellen en intensiteit van het signaal vast te stellen. <p class="jove_content"&gt; Om het nut van de beschreven protocol in het opsporen en volgen van celfusie te tonen, werden MSC&#39;s getransfecteerd met het loxP-Stop-loxP-Luciferase plasmide (Addgene) en die aan de hartspier van Cre-expressie muizen. Ongeveer een week na de levering cel, werden de muizen eerste beeld gebracht met behulp van de Xenogen systeem zonder D-luciferine injectie. Zoals verwacht, zonder dat de enzymatische substraat, was er geen intensiteit signaal wordt gedetecteerd (Figuur 3). Vervolgens werd D-luciferine intraperitoneaal geïnjecteerd en een signaal dat overeenkomt met luciferase steunintensiteit en dus celfusie werd aangetroffen in twee van de vier geteste muizen. Een soortgelijk signaal was gedetecteerd een week later (figuur 3), wat suggereert MSC-gekoppelde fusie producten kunnen worden gehandhaafd in vivo. In dit geval, de studie werd beëindigd om voor de evaluatie van het hart en het omringende weefsel, maar men kon Envision op langere termijn analyses en vaker beeldvorming om het onderhoud, de proliferatie spoor eend misschien migratie van fusie-producten in muizen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van Technique to Cell Fusion detecteren in vivo. Als fusie tussen Cre expressie muis cellen en getransplanteerde cellen die een floxed luciferase plasmide optreedt, luciferase wordt uitgedrukt. Luciferase kan worden gedetecteerd door het injecteren van de enzymatische substraat, D-luciferine, in de muis en vervolgens beeldvorming van de muis met behulp van een Xenogen Biophotonic Imaging System (Aangepast uit 19) <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig2.jpg" /> Figuur 2. Gevoeligheid van detectie van luciferase-expressie cellen in hartweefsel met biofotonische beeldvorming. Een cel lijn die constitutief uitdrukt luciferase (231-LUC-D3H1, Xenogen) werd geleverd aan de intramyocardial ruimte van C57/Bl6 muizen op verschillende totale cel nummers. Representatieve beelden van muizen receiving 1 x 10 6, 1 x 10 3 en 1 x 10 1 cellen (van links naar rechts) worden weergegeven, werd de beeldvorming uitgevoerd ongeveer 6 uur na de injectie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig3.jpg" /> Figuur 3. Kwantificering van in vivo Luminescentie Indicatieve van Cell Fusion. MSC&#39;s werden getransfecteerd met de loxP-Stop-loxP-Luciferase plasmide en geleverd aan de hartspier van Cre-expressie muizen. Ongeveer een week en twee weken na aflevering cel, werden Cre muizen beeld gebracht met behulp van de Xenogen Biophotonic Imaging Systeem om de intensiteit van de luminescentie indicatie van celfusie te meten. (A) Overlay van de foto en de intensiteit van de luminescentie van sham en muizen 1-4 (van links naar rechts) 17 dagen na aflevering cel. (B) intensiteit van luminescentie van sham en muizen 1-4 (van links naar rechts) 17 dagen na aflevering cel. Een regio van belang werd geselecteerd (geel) die overeenkomt met de plaats van injectie en intensiteit levels werden bepaald met behulp van ImageJ (gratis source) software 20. (C) intensiteit van de luminescentie werd genormaliseerd tot dezelfde regio van de rente op sham muis voor alle experimentele condities. Op een week, muizen 3 en 4 toonde een positieve luminescentiesignaal suggereert spontane fusie van een muis getransplanteerd cel en MSC. Het signaal bleef in de muis 3 op twee weken. Voor het bepalen van orgaan-specifieke lokalisatie van het signaal dat overeenkomt met de muis 3, was de borstholte blootgesteld en primaire organen uitgesneden en afgebeeld. (D) Overlay van de foto en de intensiteit van de luminescentie van muis 3. Let op lokalisatie van intensiteit signaal in de dunne darm. (E) intensiteit van de luminescentie van muis 3. (F) Overlay van de foto en de intensiteit van de luminescentie van sham muis. (G) intensiteit van luminescentie van sham muis.

<ol><li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBernirschke%2C+KKP+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. New York. (2000).</li>
<li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li>
<li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li>
<li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+debris%2C+oxidative+stress+and+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li>
<li>Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+of+cells+between+species+yields+transdifferentiation+and+retroviral+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo.</a> FASEB. J. 18, 548-550 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+hematopoietic+cells+generate+cardiomyocytes+at+a+low+frequency+through+cell+fusion%2C+but+not+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation.</a> Nat. Med. 10, 494-501 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li>
<li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li>
<li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li>
<li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+%28Kap%29-luciferase+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li>
<li>Weir, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophotonic+imaging+in+HO-1.luc+transgenic+mice%3A+real-time+demonstration+of+gender-specific+chloroform+induced+renal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity.</a> Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).</li>
<li>Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+bioluminescent+Brucella+melitensis+mutants+GR019+%28virB4%29%2C+GR024+%28galE%29%2C+and+GR026+%28BMEI1090-BMEI1091%29+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice.</a> Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li>
<li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li>
<li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li>
<li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li>
<li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+tissue+transplantation+in+rats%3A+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li>
<li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li>
<li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De methode die hier beschreven staat, voor de eerste keer, discrete identificatie en temporele analyse van de celfusie in organismen, met inbegrip van kleine dieren. De aanpak combineert Cre-loxP recombinatie met daaropvolgend biofotonische beeldanalyse. De aanpak is vatbaar voor het bijhouden van niet alleen de cel-cel fusie, maar ook virus-cel fusie en zo kan nuttig zijn voor het bijhouden van virale infecties. Beeldanalyse is snel en het is mogelijk om de afbeelding meerdere kleine dieren tegelijk. Detectie v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Neon Transfectie System </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> MPK5000 </td><td></td></tr><tr><td> Neon 100 ul Kit </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> MPK10025 </td><td> Bevat R en E Buffer </td></tr><tr><td> a-MEM poeder </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum (FBS) </td><td> Hyclone, Logan UT </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J </td><td> Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME </td><td> 006054 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine 10X </td><td> Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ </td&gt; <td> MT-25-054-Cl </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferine </td><td> Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Xenogen Biophotonic Imaging System </td><td> Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA </td><td> IVIS Spectrum </td><td></td></tr><tr><td> Natrium Biocarbonate </td><td> Sigma Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S6014-500G </td><td></td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> Invitrogen, Carlsbad, Californië </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr></tbody></table>

een cre-lox p recombinatie aanpak voor de detectie van celfusie in vivo</em

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Het vermogen van twee of meer cellen van hetzelfde type te fuseren is gebruikt in meercelligen doorheen de evolutie van vele complexe organen, waaronder het skelet spieren, botten en placenta vormen. Hedendaagse studies tonen fusie van cellen van hetzelfde type verleent verbeterde functie. Bijvoorbeeld, wanneer de trofoblast cellen van de placenta zekering te vormen van de syncytiotrophoblast, de syncytiotrophoblast is beter in staat om voedingsstoffen en hormonen in de moeder en foetus barrière dan niet-gefuseerde trophoblasts 1-4 vervoer. Meer recente studies laten zien fusie van cellen van verschillende types kunnen lot van de cel direct. De &#39;terugkeer&#39; of wijziging van lot van de cel door een fusie werd ooit gedacht worden beperkt tot celkweek systemen. Maar de komst van de stamceltransplantatie geleid tot de ontdekking door ons en anderen die stamcellen kunnen met somatische cellen zekering in vivo en dat fusie vergemakkelijkt stamcellen differentiatie 5-7. Zo, celfusie is een gereguleerd proces capable van de bevordering van cel overleving en differentiatie en dus kan worden van essentieel belang voor de ontwikkeling, het herstel van weefsels en zelfs de pathogenese van de ziekte. Het beperken van de studie van de cel fusie, is het gebrek aan geschikte technologie 1) nauwkeurig te identificeren fusie producten en 2) volgen fusie-producten in de tijd. Hier presenteren we een nieuwe benadering voor zowel de beperkingen aan te pakken via inductie van bioluminescentie bij fusie (figuur 1);. Bioluminescentie kan worden gedetecteerd met een hoge gevoeligheid in vivo 8-15 We maken gebruik van een construct dat codeert voor de vuurvlieg luciferase (Photinus pyralis) gen geplaatst grenzend aan een stopcodon geflankeerd door loxP sequenties. Bij de cellen die dit gen fuseren met cellen die het Cre recombinase eiwit, de loxP sites zijn gesplitst en het stopsignaal wordt weggesneden waardoor de transcriptie van luciferase. Omdat het signaal is induciBLE, de incidentie van vals-positieve signalen is zeer laag. In tegenstelling tot bestaande methoden die het Cre / loxP systeem 16, 17 gebruiken, hebben wij opgenomen een &quot;levend&quot; detectiesignaal en daarmee betalen voor de eerste keer de kans om de kinetiek van celfusie track in vivo. Om aan te tonen van de aanpak, muizen alom uiten van Cre-recombinase diende als ontvangers van stamcellen getransfecteerd met een luciferase te bouwen om stroomafwaarts van een floxed stopcodon uit te drukken. Stamcellen werden getransplanteerd via intramyocardial injectie en na transplantatie intravitale beeldanalyse werd uitgevoerd om de aanwezigheid van spoor fusie producten in het hart en de omliggende weefsels in de tijd. Deze aanpak kan worden aangepast aan de celfusie te analyseren in elk weefseltype in elk stadium van ontwikkeling, ziekte of volwassen weefsel te herstellen.

Een methode om celfusie track in levende organismen na verloop van tijd wordt beschreven. De aanpak maakt gebruik van Cre-<em&gt; LoxP</em&gt; Recombinatie om luciferase expressie te induceren bij celfusie. De gegenereerde chemiluminescentie-signaal kan worden gedetecteerd in levende organismen, waarbij biofotonische beeldvormende systemen met een gevoeligheid van detectie van ~ 1.000 cellen in perifere weefsels.

Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo</em

Het vermogen van twee of meer cellen van hetzelfde type om te fuseren, is gedurende de evolutie bij metazoa benut voor de vorming van vele complexe organen, waaronder ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren en volgen van cel-cel-fusiegebeurtenissen in vivo. Dit wordt bereikt door eerst een geflockt luciferase-gen in donorcellen te transfecteren. De tweede stap van de procedure is het afleveren van de getransfecteerde cellen in weefsels van een muis die genetisch is gemodificeerd om constitutief Cre-recombinase tot expressie te brengen.De derde stap is het in beeld brengen van de luminescentie in de weefsels van de recipientmuizen, wat correspondeert met cel-cel-fusiegebeurtenissen. Dit wordt gevolgd door een analyse van de signaalintensiteiten op basis van de experimentele condities. Uiteindelijk kunnen de resultaten de lokalisatie en het transport van cel-cel-fusieproducten in levende muizen aantonen door de detectie van induceerbare luminescentie geassocieerd met celfusie.De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van ontwikkeling, stamcelbiologie en kankerbiologie, zoals de vraag of celtransfusie stamcelprogrammering faciliteert, of dat kankermetastase afhankelijk is van celtransfusie. De procedure wordt gedemonstreerd door Anthony Springers, Nicholas Co en Brian Freeman, studenten in ons laboratorium, en Gal Queen Song, een associate scientist in de afdeling geneeskunde. Begin met het trypsiniseren van cellen voor in vivo fusie wanneer deze 70 tot 80% confluent zijn. In dit geval worden mesenchymale stamcellen gebruikt; inactiveer het trypsine met een antibioticavrij alpha-MEM compleet medium en centrifugeer de cellen. Aspireer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 mL 1X PBS. Zodra de cellen zijn geteld met behulp van een hemocytometer, worden 1,5 miljoen cellen overgebracht naar een centrifugebuis om deze te pelletiseren.Na het zorgvuldig aspireren van het supernatant, resuspendeer het pellet in 300 µL R-buffer met zes µg plasmide volgens het protocol van de fabrikant. Plaats drie mL EBU in de electroporatie-dockingpoort.Breng vervolgens 100 µL van de celplasmide-oplossing over naar een Neon-pipetpunt. Plaats de pipetpunt in het electroporatieapparaat en electroporeer de cellen.Breng deze cellen nu over naar een conische buis van 15 milliliter met 9,7 milliliter alpha MEM, compleet medium. Herhaal het elektroporatieproces tweemaal om in totaal 300 microliters geëlektroporeerde cellen te verkrijgen, die allemaal worden samengevoegd in het alpha MEM compleet medium. Voeg de cellen vervolgens toe aan een T 1 75-fles die nog 10 milliliter alpha MEM compleet bevat.Vervang het medium 24 uur na de transfectie; de celoverleving na elektroporatie is ongeveer 30%, wat resulteert in ongeveer een half miljoen levensvatbare cellen per kolf. Na twee of drie dagen zullen de cellen voor 70 tot 80% confluent zijn. Breng de cellen vervolgens over en tel ze vlak voor de injectie Resus.Suspendeer de cellen in compleet alpha MEM met een concentratie van 1 miljoen cellen per 50 µL medium en injecteer deze zo snel mogelijk om celsterfte te minimaliseren. Voor deze procedure worden muizen gebruikt die zodanig zijn genetisch gemodificeerd dat ze Cree-recombinase ubiquitair tot expressie brengen, nadat de muis is gebenestheseerd met isofluraan. Controleer aan de hand van een pijntest of de muis zich in een chirurgisch vlak van anesthesie bevindt.Verwijder nu het haar van de borststreek met een haartrimmer of een chemische ontharing. Bereid de muis vervolgens voor op de operatie door een 18 gauge katheter in te brengen, de muis op een muisventilator en een warmtemat te plaatsen. Voer nu een thoracotomie uit met een laterale incisie over de vierde intercostaalruimte.Zorg voor een vrij zicht op het hart. Buig de punt van een naald met maat 28, die is bevestigd aan een spuit van één milliliter, tot bijna 90 graden. Vul de spuit met 50 µL van de voorbereide cellen, inclusief wat extra lucht, zodat het volledige celvolume uit de naald kan worden gespoten.Voer nu 2 intramyocardiale injecties van 25 µL van de getransfecteerde celsuspensie uit in de voorste ruimte van de linker ventrikel. Het is belangrijk om er zeker van te zijn dat de celinjectie in het weefsel plaatsvindt. Dit kan worden bevestigd door te letten op de vertakking van het weefsel tijdens het injecteren na de injecties.Gebruik resorbeerbare hechtdraden, zoals Vicryl-hechtdraden, om de ribben en spierlagen te sluiten. Voltooi de operatie door de huid te sluiten met 4-0 nylon of zijde. Werk snel tijdens de operatie en de injectie, aangezien het succes afhangt van de kortst mogelijke duur van deze procedure.Laat de muis nu herstellen van de anesthesie op een warmteplaat en extubeer de muis zodra deze hoest of reflexactiviteit vertoont. Voor de controles moet in de cream ice alpha MEM-medium worden geïnjecteerd, zonder getransfecteerde cellen, en moeten de wildtype muizen worden geïnjecteerd met de getransfecteerde cellen. Anestheseer de muizen die worden geïmageerd met 4% isofluorine.Bereid de muizen voor met een intraperitonele injectie van D Lucifer. Plaats elke geanestheseerde en met lucifer geladen muis in rugligging. In de imagingbox kunnen meerdere muizen gelijktijdig worden gescand, inclusief een sham-injectiecontrolemuis.Houd de anesthesie in stand met 1 tot 2% isofluraan met behulp van een gasmasker. Plaats de beeldvormingsbox onder de microscoop en open een commercieel beschikbaar softwarepakket voor de beeldvorming. Bereid de software voor door eerst de juiste belichtingstijd in te stellen.Stel vervolgens de vorm van het te beelden gebied in voor één muis en gebruik dezelfde vorm voor elke andere te beelden muis. Stel daarna de hoogte van het subject in op 4,5 centimeter. Registreer een luminescentiesignaal dat overeenkomt met de muis of muizen binnen het gezichtsveld.Sla vervolgens het ongewijzigde afbeeldingsbestand op. Verwerk de beelden om het achtergrondsignaal te verwijderen dat overeenkomt met de intensiteitswaarden van de controlemuis; waarden boven de achtergrondluminescentie komen overeen met gefuseerde cellen in het dier. We stellen vast dat de open-source software ImageJ eenvoudig aan te passen en betrouwbaar is voor de post-processing van beelden.Om deze analyse uit te voeren, is het essentieel dat de beelden die met de Xeno gen-software zijn verkregen, worden geëxporteerd als T-bestanden. De intensiteitsanalyse kan worden uitgevoerd met commercieel verkrijgbare of opensource software voor beeldanalyse. Gewoonlijk wordt er een regio van interesse geselecteerd om intensiteitsgegevens tussen dieren en experimenten te vergelijken om de gevoeligheid van het beeldvormingssysteem te bepalen.Een cellijn die constitutief luciferase tot expressie brengt, werd in verschillende concentraties geïnjecteerd in het myocardium van C 57 black six-muizen. Zes uur later werden de muizen gescand op luminescentiesignaal. Een signaal werd gedetecteerd bij twee van de zes muizen die met 1000 cellen waren geïnjecteerd, en bij alle zes de dieren die met 10 000 cellen waren geïnjecteerd.Na het bekijken van deze video hebt u een goed inzicht in hoe u cel-cel-fusieproducten in vivo kunt identificeren en volgen via de detectie van induceerbare luminescentie.

a-cre-lox-p-recombination-approach-for-detection-cell-fusion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van...

Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Het doel van dit protocol is om twee verschillende celtypen te fuseren om hybride cellen te maken. Fluorescentiemicroscopie analyse van gesmolten cellen wordt gebruikt om de cel van oorsprong van cellulaire organellen te volgen. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe cellulaire structuur en functie reageren op perturbatie door celfusie.

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Leer een Cre-LoxP-recombinatiemethode om celfusie in vivo te detecteren met luminescentiebeeldvorming in muizen. Deze techniek maakt real-time tracking van fusieproducten mogelijk voor onderzoek naar stamcelbiologie en kanker.

Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo

Meer video's verkennen