Name: Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Leer metabole route-analyse bij bacteriën met koolstof-13-isotooplabeling en GC-MS. Deze methode maakt het mogelijk om functionele biochemische netwerken te traceren en nieuwe enzymatische functies te ontdekken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door een NSF Career Grant (MCB0954016) en een DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694).

1. Celcultuur (figuur 1) <ol><li> Groeien cellen in minimaal medium met sporenelementen, zouten, vitamines, en specifiek gelabeld koolstofsubstraten die het beste zijn voor pad onderzoek. Gebruik ofwel schudden kolven of bioreactoren voor celcultuur. Organische voedingsstoffen, zoals gist extract, kunnen interfereren met de meting van de aminozuur etikettering en kan dus niet aanwezig zijn in het kweekmedium. </li><li> Monitor celgroei door de optische dichtheid van de cultuur op een optimale golflengte (bv. OD 730 voor Cyanothece 51142) met een UV / Vis spectrofotometer. </li><li> Cellen kunnen eerst worden gekweekt in een niet-gelabeld medium. De middelste-log groeifase cellen zijn bij voorkeur te worden gebruikt voor enting (3% (v / v) in volume enten ratio) van de gelabelde medium. De gelabelde cultuur moet worden sub-gekweekt (3% v / v inenting ratio) in hetzelfde label medium om de introductie van niet-gemerkte koolstof uit de initiële inoculum te vermijden. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Aminozuur-extractie <ol><li> Oogst sub-gekweekte cellen (10 ml) in het midden-log groeifase door centrifugeren (10 min, 8000 × g). </li><li> Resuspendeer de pellet in 1,5 ml van 6M HCl en overzetten naar een helder glas, schroef-top GC flacon. Cap de flacons en leg ze in een 100 ° C oven gedurende 24 uur om de biomassa eiwitten te hydrolyseren in aminozuren. Hydrolyse van biomassa pellets kan opleveren 16 van de 20 gewone aminozuren (Figuur 2) 5. Cysteïne en tryptofaan worden afgebroken, en glutamine en asparagine worden omgezet naar glutamaat en aspartaat, respectievelijk. </li><li> Centrifugeer het aminozuur oplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten met behulp van 2 ml Eppendorf buisjes, en breng de bovenstaande vloeistoffen om nieuwe GC flacons. Deze stap verwijdert vaste deeltjes in de hydrolyse oplossing. </li><li> Verwijder de GC flacon deksels en volledig droog de monsters onder een stroom van lucht met behulp van een Thermo Scientific Reacti-Vap verdamper (let op: een vriesdroger kan ook gebruikt worden to droge monsters). Deze stap kan &#39;s nachts worden gedaan. </li></ol> 3. Aminozuur derivatisering en GC-MS condities Analyse van de aminozuren of geladen / zeer polaire metabolieten via GC vereist dat deze metabolieten gederivatiseerd worden, zodat de aminozuren volatiel zijn en kunnen worden gescheiden door middel van gaschromatografie 2. <ol><li> Los van de gedroogde monsters met 150 ul van tetrahydrofuran (THF) en 150 pi van de N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide derivatiseringsreagens. </li><li> Broed alle monsters in een oven of een waterbad tussen 65 en 80 ° C gedurende 1 uur. Vortex af en toe te controleren of de metabolieten in de flacon worden opgelost. </li><li> Centrifugeer de monsters op 20.000 xg gedurende 10 minuten, en breng het supernatant om nieuwe GC flacons. Het supernatant moet een heldere en geelachtige oplossing zijn. Als gevolg van verzadiging van de detectoren, kunnen GC-MS meetnauwkeurigheid worden beïnvloed door de hoge concentration van de geïnjecteerde TBDMS gederivatiseerde aminozuren (deze monsters vaak shows donker bruine kleur), daarom moeten we verdunnen van deze monsters met behulp van THF voor GC-MS meting 6. </li><li> Het analyseren van de monsters door GC-MS (gebruik een 1:05 of 1:10 splitsingsverhouding, injectie volume = 1 ui, draaggas helium = 1,2 ml / min). Gebruik de volgende GC temperatuur programma: houd bij 150 ° C gedurende 2 minuten, toename bij 3 ° C per minuut tot 280 ° C, te verhogen bij 20 ° C per minuut tot 300 ° C, en daarna gedurende 5 minuten. Solvent vertraging kan worden ingesteld als ~ 5 min (voor een 30 meter GC-kolom). Het bereik van de massa om ratio (m / z) lading in MS kan worden ingesteld tussen 60 en 500. </li></ol> 4. GC-MS data-analyse <ol><li> TBDMS gederivatiseerde aminozuur meting kan ook worden beïnvloed door isotoop discriminatie in GC scheiding. Lichte isotopen bewegen iets sneller dan heave isotopen in GC-kolom. Ter vermindering van de potentiële meetfouten, kunnen we het gemiddelde van de massa spectrum van het geheelaminozuur peak range 6 </li><li> De GC en MS spectra van TBDMS gederivatiseerde metabolieten zijn gemeld voor 7. De GC retentietijd en de unieke m / z pieken voor elk aminozuur worden geïllustreerd in figuur 3. </li><li> Derivatisering van aminozuren of centrale metabolieten introduceert aanzienlijke hoeveelheden van natuurlijk-gelabelde isotopen, waaronder 13 C (1,13%), 18 O (0,20%), 29 Si (4,70%), en 30 Si (3,09%). De meting geluid van natuurlijke isotopen in de ruwe massa isotopomeer spectrum kan worden gecorrigeerd door gebruik te maken gepubliceerde software 5, 8. De laatste isotopische labeling gegevens worden gerapporteerd als massa breuken, bijvoorbeeld, M 0, M 1, M 2, M 3 en M 4 (goed voor fragmenten die nul tot vier 13 C gelabeld koolstofatomen). </li><li> Meting van aminozuren kan isotopische labeling informatie over de acht cruciale voorloper metabolieten: 2-oxo-glutaraten, 3-P-glycerate, acetyl-CoA, erythrose-4-P, oxaalacetaat, fosfoenolpyruvaat, pyruvaat en ribose-5-P. De etikettering patronen in deze metabolieten kan worden gebruikt om een aantal centrale metabole routes (figuur 2) 9 identificeren. Het resultaat van de etikettering experimenten kan verder worden bevestigd met behulp van andere biochemische methoden (bijv., RT-PCR). </li></ol> 5. Pathway analyse met behulp van gelabelde aminozuur gegevens Door te onderzoeken slechts een paar belangrijke aminozuren geproduceerd uit goed ontworpen 13 C tracer experimenten kunnen onthullen we een aantal unieke paden of enzym-activiteiten zonder het uitvoeren van geavanceerde 13 C-metabole flux analyse van de gehele centrale metabolisme. <ol><li> Entner-Doudoroff route: [1 - 13 C] glucose kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de route actief is, wordt serine etikettering beduidend lager dan de etikettering van alanine 10. </li><li> Vertakte TCA cyclus: [1 - 13 C]pyruvaat kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de TCA cyclus is gebroken, kan aspartaat worden gelabeld door twee koolstofatomen, terwijl de glutamaat is gemerkt met slechts een dubbele koolstof 11, 12. </li><li> CO 2 fixatie door Calvin-Benson-Bassham cyclus in een mixotrophic stofwisseling: Non-label CO 2 en gelabeld koolstofsubstraten worden zowel gebruikt als koolstofbron. Als Calvin cyclus is functioneel, zal serine en histidine etikettering duidelijk worden verdund, in vergelijking met andere aminozuren. Een dergelijke methode kan bepalen de relatieve CO 2 fixatie wanneer organische koolstof bronnen aanwezig zijn in het medium 13. </li><li> Oxidatieve pentosefosfaat route: [1 - 13 C] glucose kan gebruikt worden als de koolstofbron. Als de route actief is, wordt niet-gemerkte alanine worden&gt; 50% 12. </li><li> Anaplerotic route (bijv. PEP + CO 2 à oxaalacetaat): 13 CO 2 en de niet-gelabelde koolstof substraten (bijvoorbeeld glycerol of pyruvate) kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de route actief is, wordt aspartaat etikettering aanzienlijk verrijkt, te vergelijken met en alanine serine 13. </li><li> Re-citraat synthase: [1 - 13 C] pyruvaat kan worden gebruikt als koolstofbron. Als het enzym actief is, is glutamaat geëtiketteerd in β-carboxylgroep 3, 4. </li><li> Citramalate pad: [1 - 13 C] pyruvaat, [2 - 13 C] glycerol, of [1 - 13 C] acetaat kan worden gebruikt als koolstofbron. Als de route actief is, leucine en isoleucine etikettering bedragen zijn identiek 14. </li><li> Serine-isocitrate lyase cyclus: [1 - 13 C] pyruvaat of [1 - 13 C] lactaat kan worden gebruikt als de koolstofbron. Als de route actief is, zal de derde positie koolstof in serine worden geëtiketteerd 15. </li><li> Benutting van nutriënten (dat wil zeggen, exogene aminozuren): een kweekmedium met volledig gelabeld koolstofsubstraten en niet-gemerkte aminozurenkunnen worden gebruikt. Als de cellen selectief gebruik maken van deze aangevuld non-label voedingsstoffen, zullen we zien aanzienlijke verwatering etikettering van deze aminozuren in de biomassa. Deze methode kan gebruikt worden om te onderzoeken welke voedingssupplementen zijn de voorkeur van de cel 16. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Recente studies hebben bio-energie nieuw leven ingeblazen belangen in met behulp van nieuwe fototrofe micro-organismen voor de productie van bio-en CO 2-afvang. In de afgelopen jaren hebben heel wat 13C-metabolisme analyses, waaronder geavanceerde 13C-Metabolic Flux Analyses (13C-MFA), is toegepast op centrale metabolisme te onderzoeken in fototrofe bacteriën, vanwege biochemische kennis van de centrale metabole routes is niet gegrond in deze niet-modelorganismen 10, 11, 17-20. Hier presenteren we een voorbeeld van de ontdekking van een alternatieve route in isoleucine Cyanothece 51.142 21. Cyaanothece 51142 bevat niet het enzym (EG 4.3.1.19, threonine ammoniak-lyase), die de omzetting van threonine katalyseert om 2-ketobutyrate in de typische isoleucine synthese weg. Aan het oplossen van de isoleucine pad, we groeien Cyanothece 51.142 (20 ml) in ASP2 medium 22 met 54 mM glycerol (2-13C,&gt; 98%). Cyanothece 51142 maakt gebruik van 2 e positie bestempeld glycerol als de belangrijkste koolstofbron. Zien we dat threonine en alanine heeft een carbon gelabeld, terwijl isoleucine is gelabeld met drie koolstofatomen. Daarom kan synthese in Cyanothece 51.142 niet worden afgeleid uit de threonine route in dienst van de meeste organismen (Figuur 4). Aan de andere kant, leucine en isoleucine hebben identieke patronen etikettering op basis van fragment (M-15) + en fragment (M-159) +. Bijvoorbeeld, de isotopomeer gegevens van [M-15] + (met ongefragmenteerd aminozuren) laten identieke etikettering voor leucine (M0 = 0.01, M1 = 0,03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) en isoleucine (M0 = 0.01, M1 = 0,03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). Zo leucine en isoleucine moeten worden gesynthetiseerd uit dezelfde voorlopers (dat wil zeggen, pyruvaat en acetyl-CoA). Deze waarneming is in overeenstemming met de gelabelde koolstof transitie in de citramalate route voor isoleucine synthese. Om te bevestigen deze route, zoeken we de Joint Genome Institute database en vind de aanwezigheid van een citramalate synthase Cima (cce_0248) in Cyanothece. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. De 13 C-ondersteunde pathway-analyse stappen. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Aminozuren worden gebruikt voor het verwerven van de etikettering patroon van hun metabolische voorlopers. ACoA, acetyl-CoA, AKG, α-Ketoglutaraat, C5P, ribose 5-fosfaat, CIT, citraat, E4P, erythrose 4-fosfaat, G6P, glucose-6-fosfaat; OAA,<html> oxaalacetaat, PEP, fosfoenolpyruvaat, PGA, drie-fosfoglyceraat; PYR, pyruvaat. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. GC pieken voor 16 aminozuren. TBDMS gederivatiseerde aminozuren zijn gebarsten door MS in twee fragmenten: (M-57) +, die de hele aminozuur, en (M-159) +, die mist de α carboxylgroep van het aminozuur. Voor leucine en isoleucine, de (M-57) + werd overlapt door andere massa pieken. We raden u aan fragment (M-15) + om de hele aminozuur etikettering te analyseren. De (f302) + groep is gedetecteerd in de meeste aminozuren, die bevat alleen de eerste (α-carboxyl-groep) en de tweede koolstof in een aminozuur backbone. Omdat deze MS piek heeft vaak met veel lawaai-to-signaal ratio&#39;s, (f302) + wordt niet aanbevolen voor kwantitatief analyseren van de metabole fluxen 7. igure 4 &quot;/&gt; Figuur 4. Labeling overgangen in isoleucine paden in Cyanothece 51.142 (gemodificeerd uit ons vorige artikel) 21.

<ol><li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li>
<li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li>
<li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluxome+analysis+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li>
<li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li>
<li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis%3A+mass+isotope+correction%2C+data+consistency+checking%2C+and+precursor+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li>
<li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li>
<li>Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li>
<li>Tang, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe%28III%29-NTA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li>
<li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calvin+cycle+flux%2C+pathway+constraints%2C+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li>
<li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase%2Freductase%3A+The+ethylmalonyl-CoA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li>
<li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li>
<li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unicellular%2C+aerobic+nitrogen-%C3%AF%C2%AC%C2%81xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li>
<li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li>
<li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-based+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol bestaat uit het voeden van de cel met een gelabeld substraat en het meten van de daaruit voortvloeiende isotopische labeling patronen in de aminozuren via GC-MS. Omdat MS-gegevens (m / z ratio&#39;s) geven gewoon het totale bedrag van de etikettering van MS-ionen, moeten we de isotopomeer verdelingen van aminozuren te beoordelen door onderzoek van de m / z ratio&#39;s van zowel de gefragmenteerde (M-57) + en gefragmenteerd aminozuren (dat wil zeggen, (M-159) + en (f302) +). ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> Labeled koolstof substraat </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td><td> Hangt af van de experimentele vereiste </td><td> Website: <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> Gaschromatograaf </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, model 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC kolommen </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> Massaspectrometer </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reactivering Vap Evaporator </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18825 </td><td> Voor het drogen van aminozuur monsters </td></tr></tbody></table>

metabole route bevestiging en discovery door 13 c-etikettering van proteïnogene aminozuren

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microben hebben complexe metabole routes die kunnen worden onderzocht met behulp van de biochemie en functional genomics methoden. Een belangrijke techniek om cellen centrale metabolisme te onderzoeken en ontdekken nieuwe enzymen is 13 C-metabolisme ondersteunde analyse 1. Deze techniek is gebaseerd op de isotopische labeling, waarbij de microben worden gevoed met een 13 C gelabelde substraten. Door het opsporen van het atoom transitiepaden tussen metabolieten in de biochemische netwerk, kunnen we bepalen functionele paden en ontdek nieuwe enzymen. Als een aanvullende methode om transcriptomics en proteomics, benaderingen voor isotopomeer-ondersteunde analyse van metabole routes bevatten drie belangrijke stappen 2. Ten eerste, we groeien cellen met 13 C gelabelde substraten. In deze stap is de samenstelling van het medium en de selectie van gelabelde substraten zijn twee belangrijke factoren. Om te voorkomen dat de meting geluiden van niet-gemerkte koolstof in voedingssupplementen, Is een minimaal medium met een enige koolstofbron nodig. Verder is de keuze van een gelabeld substraat op basis van hoe effectief het zal het pad wordt geanalyseerd toe te lichten. Omdat de nieuwe enzymen vaak gepaard met andere reactie stereochemie of halffabrikaten, in het algemeen, afzonderlijk gelabelde koolstofsubstraten zijn meer informatief voor de detectie van nieuwe wegen dan uniform label die voor de detectie van nieuwe wegen 3, 4. Ten tweede, analyseren we aminozuur etikettering patronen met behulp van GC -MS. Aminozuren zijn er in overvloed aan eiwitten en kan dus worden verkregen uit biomassa hydrolyse. Aminozuren kunnen gederivatiseerd worden door N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) voor GC scheiding. TBDMS gederivatiseerde aminozuren kan worden versnipperd door MS en resulteren in verschillende arrays van fragmenten. Op basis van de massa op te laden (m / z) verhouding van de gefragmenteerde en ongefragmenteerd aminozuren, kunnen we afleiden van de mogelijke label patronen van de centrale metabolieten die wordenvoorlopers van de aminozuren. Ten derde, we sporen 13C carbon overgangen in de voorgestelde paden en, op basis van de isotopomeer gegevens bevestigen of deze pathways actief zijn 2. Meting van aminozuren levert isotopische labeling informatie over de acht cruciale voorloper metabolieten in het centrale metabolisme. Deze metabole belangrijkste knooppunten kunnen weerspiegelen de functies van de geassocieerde landen in Midden paden. 13 C-metabolisme ondersteunde analyse via proteïnogene aminozuren op grote schaal kunnen worden gebruikt voor functionele karakterisering van slecht gekarakteriseerd microbiële metabolisme 1. In dit protocol, zullen we gebruik maken Cyanothece 51.142 als het model inspannen om het gebruik van gelabelde koolstof substraten voor het ontdekken van nieuwe enzymatische functies te demonstreren.

13 C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.

Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Microben beschikken over complexe metabole routes die onderzocht kunnen worden met behulp van biochemische methoden en functionele genomica. Een belangrijke techniek om ... te onderzoeken...

Het doel van dit protocol is het bestuderen van het bacteriële metabolisme met behulp van metabole analyse ondersteund door koolstof 13. Om te beginnen worden microben gekweekt in de aanwezigheid van gelabelde koolstofsubstraten, die worden ingebouwd in de microbiële eiwitten. De microben worden vervolgens geoogst, waarna aminozuren worden geëxtraheerd, gehydrolyseerd en gederivatiseerd.De monsters worden aangebracht op een gaschromatograaf en massaspectrometer of GC-MS. Door de atoomovergangspaden tussen metabolieten in het biochemische netwerk te volgen, kunnen de functionele metabolische routes die door de microbe worden gebruikt, worden bepaald. Ik ben Bert Burla.De methode die we hier presenteren, kan worden gebruikt als aanvulling op transcriptomica en proteomics om de metabole routes in microben te bepalen. We hebben deze techniek gebruikt om fotosynthetische microben, zoals cyanobacteriën, te onderzoeken op myotroof of heterotroof koolstofgebruik. In deze video gebruiken we ANOTHE 5 1 1 42 als modelstam om het gebruik van gelabelde koolstofsubstraten voor het ontdekken van nieuwe enzymatische functies te demonstreren.De procedure zal worden gedemonstreerd door mijzelf, li Y

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Stabiele isotoop labeling workflows in...

Protease-en Acid-gekatalyseerde Labeling Werkstromen Gebruikmakend<sup&gt; 18</sup&gt; O verrijkte Water

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

De validatie van de enzymatische activiteiten die betrokken zijn bij biochemische pathways kunnen worden toegelicht met behulp van functionele complementatie analyse (FCA). In dit manuscript het FCA assay waaruit de enzymatische activiteit van enzymen betrokken bij het metabolisme van aminozuren, bacteriële stringente respons en bacteriële peptidoglycaan biosynthese.

Functionele Complementatie Analysis (FCA): A Laboratory Oefening ontworpen en geïmplementeerd om het onderwijs in Biochemical Pathways Supplement

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het kwantitatief en uitgebreid onderzoek naar het metabolisme van meerdere nutriënten bronnen. Deze werkstroom, gebaseerd op een combinatie van isotopische tracerproeven en een analytische procedure, kan het lot van verbruikte voedingsstoffen en de metabole oorsprong van moleculen synthetized door micro-organismen te bepalen.

Workflow gebaseerd op de combinatie van isotopische tracerproeven te onderzoeken van de microbiële metabolisme van meerdere nutriënten bronnen

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is een zeer gevoelige, betrouwbare en gemakkelijk uit te voeren methode om omkeerbare lipidemodificatie van cysteïneresiduen (S-acylation) in een verscheidenheid van biologische monsters op te sporen.

Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.

Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn

De ontwikkelde methode van 13C 6-Glucose-etikettering in combinatie met vloeistofchromatografie met hoge resolutie massaspectrometrie is veelzijdig en legt de basis voor toekomstige studies naar de primaire organen en routes die betrokken zijn bij de synthese van secundaire metabolieten in medicinale planten, evenals het uitgebreide gebruik van deze secundaire metabolieten.

13 okt.C 6-glucose-etikettering geassocieerd met LC-MS: identificatie van primaire organen van planten in secundaire metabolietsynthese

Leer metabole route-analyse bij bacteriën met koolstof-13-isotooplabeling en GC-MS. Deze methode maakt het mogelijk om functionele biochemische netwerken te traceren en nieuwe enzymatische functies te ontdekken.

Metabole route Bevestiging en Discovery door¹³ C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Meer video's verkennen