Metabole route Bevestiging en Discovery door ¹³ C-etikettering van proteïnogene aminozuren

Het doel van dit protocol is om het bacteriële metabolisme te bestuderen met behulp van metabole analyse ondersteund door koolstof 13. Allereerst worden microben gekweekt in de aanwezigheid van gelabelde koolstofsubstraten, die worden ingebouwd in de microbiële eiwitten. Vervolgens worden de microben geoogst en worden de aminozuren geëxtraheerd, gehydrolyseerd en gederivatiseerd.

De monsters worden geanalyseerd met een gaschromatograaf-massaspectrometer of GCMS. Door de atoomovergangspaden tussen metabolieten in het biochemische netwerk te volgen, kunnen de functionele metabole routes die door de microbe worden gebruikt, worden bepaald. Ik ben Bert Burla.

De methode die we hier presenteren kan worden gebruikt als aanvulling op transcriptomics en proteomics om de metabole routes in microben te bepalen. We hebben deze techniek gebruikt om fotosynthetische microben, zoals cyanobacteriën, te onderzoeken op myotroof of heterotroof koolstofgebruik. In deze video gebruiken we ANOTHE 5 1 1 42 als modelstam om het gebruik van gelabelde koolstofsubstraten aan te tonen voor het ontdekken van nieuwe enzymatische functies.

De procedure wordt gedemonstreerd door mijzelf, li Yu en Chu Yang Fang. Begin deze procedure door cyana thesei-bacteriën te kweken in een niet-gelabeld medium. Wanneer de bacteriën de midden-logaritmische groeifase bereiken, inoculeert u 3% van het volume in het met koolstof 13 gelabelde medium.

Vervolgens, om te voorkomen dat ongelabelde koolstof uit de initiële inoculum-subcultuur in hetzelfde gelabelde medium terechtkomt tijdens de midden-logaritmische groeifase. Wanneer de koolstof-13 gelabelde Cy Thesei bacteriën de midden-logaritmische groeifase bereiken, oogst dan 10 milliliters door middel van centrifugatie. Resuspendeer het pellet in 1,5 milliliters zes molaire zoutzuur en breng dit over naar een helder glazen gaschromatografie- of GC-vial met schroefdop.

Sluit de flacons af en plaats ze gedurende 24 uur in een oven van 100 °C om de biomassestromen te hydrolyseren tot aminozuren. Hydrolyse van biomassapellets levert 16 van de 20 algemene aminozuren op; breng na hydrolyse de aminozuuroplossing over in microcentrifugebuisjes van 2 mL en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 20.000 ×g. Na de hydrolyse wordt de aminozuuroplossing overgebracht naar microcentrifugebuisjes van 2 mL en vervolgens 5 minuten gecentrifugeerd bij 20.000 ×g om vaste deeltjes neer te slaan.

Breng na het centrifugeren de supernatanten over naar nieuwe GC-vials om vaste deeltjes in de hydrolyse-oplossing te verwijderen, zodat deze de GC-kolom niet binnendringen. Vervolgens worden de aminozuren gedroogd om ze vluchtig te maken voor scheiding via gaschromatografie. Los de gedroogde monsters op in 150 µL tetrahydrofuran (THF) en 150 µL N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamide (BSTFA) met 1% trimethylchlorosilaan (TMCS).

Incubeer alle monsters in een oven tussen 65 en 80 °C gedurende één uur met acetamide, T-B-D-M-S derivatiseringsreagens. Vortex de monsters af en toe om ervoor te zorgen dat de metabolieten in het vial zijn opgelost. Centrifugeer de monsters bij 20.000 ×g gedurende 10 minuten en breng vervolgens het supernatant over naar nieuwe GC-vials.

De supernatant moet een heldere gelige oplossing zijn. De GC-temperaturen zijn als volgt: twee minuten vasthouden op 150 °C. Met drie °C per minuut verhogen tot 280 °C.

Verhoog de temperatuur met 20 °C per minuut tot 300 °C en houd dit gedurende vijf minuten vast. Stel vervolgens voor een GC-kolom van 30 meter de solvent delay in op ongeveer vijf minuten en het bereik van de massa-ladingverhouding op tussen 60 en 500. Analyseer de monsters via GCMS met een split-verhouding van 1:5 of 1:10, een injectievolume van 1 µL en helium als dragergas met een debiet van 1,2 mL per minuut volgens het run-schema.

Analyseer de GC-MS-gegevens met Microsoft Excel. De GC-retentietijd en de unieke massa-ladingsverhouding-pieken voor elk aminozuur zijn in deze figuur weergegeven. T-B-D-M-S-gederiveerde aminozuren worden door MS gewoonlijk duidelijk gesplitst in twee geladen fragmenten: fragment M minus 57, dat het volledige aminozuur bevat, en fragment M minus 159, waarin de alfa-carboxylgroep van het aminozuur ontbreekt voor leucine en isoleucine.

De M minus 57 piek werd overlapt door andere massafragmentpieken. N minus 15 kan worden gebruikt om de gehele aminozuurmarkering te analyseren. Daarnaast wordt de F 3 0 2 groep vaak gedetecteerd in de meeste aminozuren, en deze bevat alleen de eerste alfacarboxylgroep en de tweede koolstoffen in een aminozuurbackbone.

Omdat deze Ms.Peak echter vaak een hoge ruis-signaalverhouding heeft, wordt F 3 0 2 niet aanbevolen voor de kwantitatieve analyse van metabole fluxen. Derivatisering van aminozuren of centrale metabolieten introduceert aanzienlijke hoeveelheden natuurlijk gelabelde isotopen, waaronder koolstof 13, zuurstof 18, silicium 29 en silicium 30. De meetruis van natuurlijke isotopen in het ruwe massa-isotoop- of spectrum kan worden gecorrigeerd met behulp van gepubliceerde software.

De uiteindelijke isotopenmarkeringsgegevens worden gerapporteerd als massafracties. Bijvoorbeeld M nul, M1, M twee, M drie en M vier, die fragmenten vertegenwoordigen die nul tot vier koolstof-13 gemarkeerde koolstofatomen bevatten. Deze 5 1 1 2 bevat niet het enzym three anine ammonia lyase, dat de omzetting van three anine naar twee keto butyraat katalyseert in de typische isle-synthese route.

Om daarom de isoleucine-route in dit organisme te ontrafelen, werd Cyana Thesei 5 1 1 42 gekweekt in ASP-2 medium met 54 millimolaire glycerol en geanalyseerd via GCMS, zoals beschreven in deze video en hier getoond. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 gebruikt glycerol met een markering op de tweede positie als belangrijkste koolstofbron, en we observeerden dat threonine en alanine, waarvan pyruvaat de precursor is, één gemarkeerd koolstofatoom hebben, terwijl isoleucine met drie koolstofatomen was gemarkeerd. Daarom kan de synthese in Cyana Thesei 5 1 1 4 2 niet voortkomen uit de threonine-route die door de meeste organismen wordt gebruikt. Aan de andere kant vertonen leucine en isoleucine identieke markeringspatronen op basis van fragment M minus 15 en fragment M minus 1 59.

Bijvoorbeeld, de isotoopgegevens van N minus 15 met niet-gefragmenteerde aminozuren vertoonden een identieke markering voor leucine en isoleucine. Hieruit volgt dat leucine en isoleucine gesynthetiseerd moeten worden uit dezelfde precursoren, pyruvaat en acetyl-CoA. Deze observatie is consistent met de gemarkeerde koolstofovergang in de citramaalaatroute voor de synthese van isoleucine.

Deze methode kan worden gebruikt om het metabolisme van een grote diversiteit aan microben te onderzoeken en kan, zodra deze is beheerst, in ongeveer één week van begin tot eind worden uitgevoerd.