Name: Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Leer dissectie en cultuur van chick statoacoustic ganglion en spinal cord explantaten in collageen gels voor neurietuitgroei assays. Deze methode onderzoekt groeifactoreffecten op neuronoverleving en axonale geleiding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health Grant RO1DC002756 en de Purdue Research Foundation. Wij danken Doris Wu en Wiese Chang voor advies met experimenten en Rodney McPhail voor hulp met cijfers.

Recepten Chick Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Water (weefselkweek graad) </td></tr></tbody></table> Opmerking: Breng de pH tot 7,4. Breng uiteindelijke volume tot 1000 ml met water. 10X PBS <table border="1"><tbody><tr><td> 40 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ml </td><td> DEPC water </td></tr></tbody></table> Opmerking: Breng de pH tot 7,4. Breng finalevolume tot 500 ml met water. Werken concentratie (1X) wordt gemaakt door het verdunnen van een deel 10X voorraad met 9 delen van weefsel-cultuur kwaliteit water, zoals die verkregen met een Millipore UV-bestraling systeem om water te genereren met 18 MΩ cm geleidbaarheid. SAG explantatie holding medium <ul><li> DMEM/F12 met L-glutamine, 10 mM Hepes </li><li> 10% Insuline, overdragen, Selenium (ITS +1) </li><li> 1% pen-strep </li></ul> Explantatie kweekmedium <ul><li> SAG explantatie holding medium </li><li> 10 ng / ml neurotrofine-3 (NT-3) </li><li> 10 ng / ml ciliaire neurotrofe factor (CNTF) </li></ul> Ruggenmerg dissectie en het bedrijf medium <ul><li> L-15 </li><li> 10% foetaal kalf serum </li><li> 1% pen-strep </li></ul> Incubeer de eieren bij 37-38 ° C. Steriliseren ontleden gereedschappen en Sylgard ontleden schotel in 70% ethanol. Ontleden gerechten en tools kunnen ook worden &#39;s nachts UV gesteriliseerd. <ol><li> Plaats kralen in een microbuisjes met 1 ml steriele PBS, mix, en wacht tot de kralen om zich te vestigen op de bodem van de buis. </li><li> Was de kralen meerdere malen door het verwijderen van het supernatant na de kralen hebben gevestigd en resuspendeer in PBS. </li><li> Incubeer de kralen in gezuiverde eiwit (verdund in PBS) of PBS alleen (Control) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel de kralen in PBS en bewaar in een 24-wells plaat met 1 ml PBS totdat geplaatst in collageen. </li></ol> 2. Statoacoustic ganglion dissectie <ol><li> Op E4 verwijder het embryo uit het ei en plaats deze in een schaal met de oplossing chick Ringer om embryonale membranen te verwijderen. </li><li> Plaats het embryo in een Sylgard © bekleed petrischaal gevuld met koud HBSS en positie van het embryo op zijn kant met de otic blaasje naar boven. Speld de embryo de schaal met behulp ontleden pinnen. </li><li> Met behulp van twee ontleden pinnen, een horizontale snede te maken door de huid onmiddellijk aan de ventralekanaal zakken, ongeveer waar het voldoet aan het cochleair kanaal. Maak een verticale snede voorste en achterste naar de SAG. Gebruik een tang of een dissectie pin op te tillen en verwijder de klep van de huid begrensd door de drie bezuinigingen. Opmerking: De SAG is gelegen aan de rand van de anteroventral otocyst, ongeveer halverwege tussen de dorsale pouch die gemakkelijk zichtbaar met helderveld basis verlichting, en de ventrale cochleaire kanaal die ventromedially projecten en wordt verduisterd door de faryngeale bogen. Het cochleair kanaal verlengt zodat de dorsoventral dimensie stijgt geleidelijk op E4 tussen Hamburger-Hamilton stadia 23 tot 25 september. </li><li> Trek de otocyst in een posterieure richting om het te scheiden van de SAG. Verplaats weefsel rondom de SAG met de dissectie pinnen en voorzichtig de SAG te verwijderen uit het embryo met behulp van # 55 tang. Verwijder de grote stukken van mesenchymale weefsel en uitstekende zenuwbanen van de SAG. </li><li> Met behulp van een brede mond pipet tip, overdracht van de explantatie naar een24-wells plaat met 0,5 ml SAG explant holding medium. Houden explanten op ijs of op kamertemperatuur voor maximaal 4 uur. </li></ol> 3. Ruggenmerg dissectie <ol><li> Verwijder de E6 embryo uit het ei en plaats deze in een schotel met kuiken Ringer-oplossing. Verwijder de kop en embryonale membranen. </li><li> Plaats het lichaam in een Sylgard © dissectie schotel met koud ruggenmerg dissectie medium. Positie en pin het embryo &quot;ventrale down&quot; en caudale tegenover de experimentator. Plaats ontleden pinnen door elk ledemaat en door het voorste einde. </li><li> Met behulp van een tang en / of ontleden van pennen, verwijder voorzichtig de huid en weefsel, het verplaatsen in een ventrale richting, tot aan de dorsale oppervlak van het ruggenmerg zichtbaar is. </li><li> Snijd de dorsale middellijn van het ruggenmerg met een dissectie pin, in een posterior naar anterior richting, langs de gehele lengte van het ruggenmerg. Dit leidt tot een &quot;open boek&quot; als de linker-en rechterkant van het ruggenmerg te scheiden. </li><li&gt; Verwijder het omringende weefsel, zijwaarts, naar het ruggenmerg te isoleren en bloot achterwortelganglia (DRG). Verwijder de DRG en de hersenvliezen door wrijven een dissectie pin of pincet tussen het ruggenmerg en de DRG. </li><li> Verwijder het ruggenmerg uit het lichaam door die het meest caudale uiteinde van het ruggenmerg met een tang en omhoog en weg van de experimentator. Verwijder de resterende DRG en hersenvliezen. </li><li> Houd een uiteinde van de het ruggenmerg met een pincet (of pin aan de schotel) en gebruik Vannas schaar te snijden langs de ventrale middellijn, aan het ruggenmerg halveren. </li><li> Houd een uiteinde van de explantatie met een tang om het weefsel te immobiliseren en gebruiken Vannas schaar om kleine explantaten (100-500 um in lengte) afgesneden langs de lengte van het weefsel. De vloerplaat kan worden herkend als een duidelijke verdikking van weefsel langs een explantatie rand. </li><li> Gebruik een brede mond pipet tip om explantaten over te dragen aan een 24 wells plaat met 0,5 ml koud dissectie medium. Houden explantaten op ijs te levensvatbaarheid van het weefsel, f onderhoudenof maximaal 4 uur. </li></ol> 4. Explantatie cultuur met gezuiverde eiwitten om neurieten reactiesnelheid te testen <ol><li> Bereid een 1,5 mg / ml collageen oplossing in een 15 ml conische tube, op ijs, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Controleer de collageen-oplossing heeft een pH van 7-7,4 het gebruik van pH-indicator papier. Stel de pH door toevoeging van NaOH in een ul volumes. </li><li> Transfer explantaten een 24-wells plaat met behulp van een brede mond pipet tip en zuig overtollige vloeistof. Meerdere explanten kunnen worden gekweekt in een goed, maar moet worden geplaatst van ten minste 500 micrometer uit elkaar. </li><li> Voeg 0,5 ml van collageen aan het putje met de explantatie. Plaats de explantaat op de bodem van de put. Zorg ervoor dat elke cultuur volledig set voordat u verder gaat met de volgende goed, omdat de collageen zal beginnen te polymeriseren bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de petrischaal op een 37 ° C slide warmer gedurende 30-45 minuten naar het collageen polymeriseren. Wanneer het collageen is polymegoedkeuring gegeven voor het zal een gel lijken. </li><li> Voeg 0,5 ml warm explantatie kweekmedium aangevuld met ofwel gezuiverde eiwitten (verdund in PBS) of PBS (Control) en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2. Effecten op neurietuitgroei zichtbaar moet zijn met 24 uur. LET OP: Wij hebben hetzelfde protocol om de cultuur SAG explantaten tot 42 uur. </li></ol> 5. Explantatie co-cultuur met eiwit-gecoate kralen om directionele neurietuitgroei-test <ol><li> Begin met explant cultuur stappen 4.1 tot 4.4. </li><li> Met behulp van een pipet, transfer 1-5 kralen uit PBS naar de bron die de collageen oplossing en explantatie. </li><li> Gebruik een tang om kralen 50 tot 500 micrometer positie van de rand van de explantatie. </li><li> Plaats de plaat op een 37 ° C slide warmer gedurende 30-45 minuten naar het collageen polymeriseren. Het weefsel of kralen kunnen worden verplaatst als het collageen polymeriseert. Controleer de culturen en herpositioneren het weefsel en kralen tijdens de eerste 5 minuten. </li><li> Voeg 0,5 ml SAG media aan elke well en incubeer gedurende 24 uur. </li></ol> 6. Visualisatie van neurietuitgroei door immunohistochemie <ol><li> Spoel culturen in PBS en vast gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 4% paraformaldehyde in PBS. </li><li> Laat de gels van de muren van de putten door het opsporen van rond de rand van de gels met het afgeronde einde van een teflon micro-spatel. Voer de immunostain met de gels in de putten. Spoel verschillende keren in PBS. </li><li> Incubeer in 0,5 ml blokkeren oplossing (10% kalfsserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumazide in PBS) overnacht bij 4 ° C. </li><li> &#39;S nachts Incubeer in 0,5 ml primaire antilichaam (anti-β-tubuline antilichaam verdund 1:500 in het blokkeren oplossing) bij 4 ° C. </li><li> Spoel verschillende keren in PBS. &#39;S nachts Incubeer in 0,5 ml secundair antilichaam (Alexa fluor 488 geit anti-muis IgG 2b antilichaam verdund 1:500) bij 4 ° C. Vanaf deze stap voorwaarts, houd platen in donkere of wikkel in folie, vanwege de gevoeligheid van het lichtsecundaire antilichamen. </li><li> Spoel verschillende keren in PBS en bewaar bij 4 ° C in PBS voor maximaal een week. </li></ol> 7. Representatieve resultaten <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> Figuur 1. Representatieve resultaten van de neurieten-bevorderende effecten van gezuiverd NT-3 en NT-3-gecoate kralen op E4 chick SAG explantaten. SAG neuron cellichamen en neurieten waren immunostained met β-tubuline en afgebeeld met een 10x objectief op een confocale microscoop. Na 24 uur in vitro, SAG explantaten weergegeven grotere neurietuitgroei in de aanwezigheid van 100 ng / ml gezuiverd humaan NT-3 toegevoegd aan het celkweekmedium (1B), in vergelijking met controles (1A). SAG neuronen werden samen gekweekt met kralen geweekte in100 ng / ml NT-3 aan te tonen dat een puntbron van NT-3 ter plaatse kan neurietuitgroei te bevorderen. Explantaten weergegeven langer en dichter neurietuitgroei aan de kant van deExplantatie geconfronteerd met de hiel in vergelijking met de andere kant (1D) en vergeleken met culturen met kralen gedrenkt in PBS (1C) te controleren. Schaalbalk = 200 micrometer. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatieve resultaten van de neurieten-bevorderende effecten van gezuiverd Wnt5a en Wnt5a gecoate kralen op E6 chick ruggenmerg. Ruggenmerg explantaten waren immunostained met β-tubuline en afgebeeld met een confocale microscoop. Na 24 uur van de groei in de aanwezigheid van gezuiverd muis Wnt5a (400ng/ml), neurietuitgroei van Chick ruggenmerg explantaten werd verhoogd (2B) in vergelijking met controles gekweekt zonder Wnt5a (2A). Kralen gedrenkt in 500 ng / ml Wnt5a, 300-500 urn geplaatst vanaf de rand van het ruggenmerg explantaten, ook bevorderd neurietuitgroei (2D) in vergelijking met culturen (2C) controle. Vergelijkbare co-cultuur resultaten werden eerder gepubliceerd met Wnt5a-expressie brengende cellen 8. Schaalbalk = 200urn.

<ol><li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li>
<li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inner+ear+afferent+connections%3A+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li>
<li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li>
<li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li>
<li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li>
<li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons%3A+comparison+with+an+otocyst-derived+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li>
<li>Juurlink, B. ernhardH. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture.%22%5BJournal%5D)">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li>
<li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li>
<li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li>
<li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens%3A+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li>
<li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li>
<li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Wij presenteren een methode te ontleden en cultuur E4 SAG en E6 ruggenmerg explantaten, van kuiken, onder serum-vrije omstandigheden. Deze procedure wordt momenteel gebruikt in ons lab aan de gevolgen van de verschillende afgescheiden liganden op SAG neuron overleving en neurietuitgroei studie. Nieuwe aspecten van dit protocol zijn het gebruik van een serum-vrij systeem voor het kweken van explantaten en het gebruik van kralen gedrenkt in groeifactoren de effecten op de SAG neurietuitgroei te bestuderen. Een kraal metho...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> Uitrusting </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection microscoop </td><td></td><td></td><td> We maken gebruik van een Leica M80 stereomicroscoop met helderveld verlichting basis </td></tr><tr><td> Slide warmer </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Collageen polymerisatie </td></tr><tr><td> Kip ei-incubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 bevochtigde celkweek incubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection Materialen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;kopiëren; gecoat petrischaal </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24-well celkweek plaat </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Roestvrij staal ontleden pinnen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Embryo pinning, fijne dissectie </td></tr><tr><td> Moria geperforeerde lepel </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10370-17 </td><td> Embryo oogst / transfer </td></tr><tr><td> 200 ul brede mond pipetpunten </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explantatie overdracht </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 en E6 kippeneieren </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Chick Ringer-oplossing </td><td></td><td></td><td> Embryo oogst </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissectie </td></tr><tr><td> L15 medium </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Ruggenmerg dissectie medium </td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Ruggenmerg dissectie medium </td></tr><tr><td> Vannas Schaar </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 501778 </td><td> Ruggenmerg dissectie </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collageen voorbereiding </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail collageen Type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Explantatie cultuur </td></tr><tr><td> 10X PBS (steriel) </td><td></td><td></td><td> Te neutralize collageen </td></tr><tr><td> 1N NaOH (steriel) </td><td></td><td></td><td> Te neutraliseren collageen </td></tr><tr><td> Gedistilleerd water (steriel) </td><td></td><td></td><td> Te neutraliseren collageen </td></tr><tr><td> pH-indicator papers (6.0-8.1) </td><td> Whatman papier </td><td> 2629-990 </td><td> Om te controleren collageen pH-waarde </td></tr><tr><td> 15 ml conische buizen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 pi brede mond pipetpunten </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Om pipet collageen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explantatie cultuur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 medium </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explantatie kweekmedium </td></tr><tr><td> ITS +1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Medium aan te vullen </td&gt; </tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Medium aan te vullen </td></tr><tr><td> CNTF (rat) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Medium aan te vullen </td></tr><tr><td> NT-3 (menselijke) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Medium aan te vullen </td></tr><tr><td> Gezuiverd muis Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel Blue gel kralen </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immunohistochemie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Bevestiging </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Spoelt </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Blockingbuffer </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Blockingbuffer </td></tr><tr><td> Kalfsserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Blockingbuffer </td></tr><tr><td> Muizen monoklonaal IgG2b anti-β tubuline 1 + II antilichaam </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Labels cellichamen en neurieten </td></tr><tr><td> Alexa fluor 488 geit anti-muis antilichaam IgG2 b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Detecteert β tubuline antilichaam </td></tr><tr><td> Teflon micro spatel </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Laat collageen gels van goed </td></tr></tbody></table>

dissectie en cultuur van chick statoacoustic ganglion en spinal cord explantaten in collageen gels voor neurietuitgroei assays

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

De zintuigen van de kip binnenoor worden geïnnerveerd door de perifere processen van statoacoustic ganglion (SAG) neuronen. Zintuig innervatie is afhankelijk van een combinatie van een axon begeleiding signalen 1 en 2 survival factoren gelegen langs het traject van de groeiende axonen en / of binnen hun zintuig doelen. Bijvoorbeeld, functionele interferentie met een klassieke axon begeleiding signaalweg, semaphorin-neuropilin, gegenereerd misrouting van otic axonen 3. Ook verschillende groeifactoren, uitgedrukt in de sensorische doelstellingen van het binnenoor, waaronder neurotrofine-3 (NT-3) en Brain afgeleide neurotrofe factor (BDNF), zijn gemanipuleerd in transgene dieren, weer wat leidt tot misrouting van SAG axonen 4. Deze zelfde moleculen bevorderen, zowel overleving en uitgroei van neurieten van kuiken SAG neuronen in vitro 5,6. We beschrijven hier en demonstreren van de in-vitro-methode die wij op dit moment are uzingen voor de responsiviteit van kuiken SAG neurieten test om oplosbare eiwitten, waaronder bekende morphogens zoals de Wnts, evenals de groei factoren die van belang zijn voor het bevorderen van SAG neurietuitgroei en neuron overleven. Met behulp van dit model systeem, hopen we conclusies over de effecten die uitgescheiden liganden kunnen uitoefenen op de SAG neuron overleving en neurietuitgroei trekken. SAG explantaten worden ontleed op embryonale dag 4 (E4) en gekweekt in drie-dimensionale collageen gels onder serum-vrije omstandigheden gedurende 24 uur. Ten eerste is neurieten reactievermogen getest door het kweken van explantaten met eiwit-aangevuld medium. Dan, om te vragen of puntbronnen van uitgescheiden liganden kunnen directionele effecten op neurietuitgroei hebben, zijn explantaten samen gekweekt met eiwit-gecoate kralen en getest op het vermogen van de kraal om lokaal bevorderen of belemmeren uitgroei. We hebben ook een demonstratie van de dissectie (gewijzigde protocol 7) en de cultuur van E6 ruggenmerg explantaten. Wijroutinematig gebruik van het ruggenmerg explantaten op bioactiviteit van de eiwitten en eiwit-doordrenkte kralen te bevestigen en te controleren soort cross-reactiviteit met chick weefsel, onder dezelfde voorwaarden als de cultuur SAG explantaten. Deze in vitro testen zijn handig voor het snel screenen op moleculen die trofische (overleving) of tropische (directionele) effecten op de SAG neuronen uit te oefenen, vooral vóór het uitvoeren van studies in vivo. Bovendien is deze methode maakt het testen van individuele moleculen onder serum-vrije omstandigheden, met een hoge neuron overleven 8.

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

De zintuigorganen van het binnenoor van de kip worden geïnnerveerd door de perifere uitlopers van neuronen uit het stato-akoestische ganglion (SAG). De innervatie van zintuigorganen ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de neurietuitgroei in stato-akoestische ganglionneuronen die in cultuur zijn gekweekt te evalueren wanneer verschillende groeifactoren aan het medium worden toegevoegd. Dit wordt bereikt door eerst het stato-akoestische ganglion en controle-ruggenmergen uit het embryo te dissekeren om X-explantaten voor cultuur te creëren. Als tweede stap worden de X-explantaten in collageen geplaatst, óf met oplosbare eiwitten om de algemene uitgroei te testen, óf met eiwitgecoate kraaltjes om de directionele uitgroei te testen.Vervolgens worden X explantaten gelabeld met anti-beta-tubuline en afgebeeld met een confocale microscoop. Om de neurieten te visualiseren die uit het ganglion groeien, worden resultaten verkregen die de effecten tonen die gesecreteerde liganden kunnen uitoefenen op het overleven van neuronen en de uitgroei van neurieten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het gehooronderzoek, zoals welke moleculen belangrijk zijn voor het overleven van otische neuronen en de axonbegeleiding wanneer zintuigorganen worden geïnnerveerd.Om deze procedure te starten, plaatst u de beads in een microtube met één milli

dissection-culture-chick-statoacoustic-ganglion-spinal-cord-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken...

Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie

Deze test evalueert het vermogen van een signaalmolecuul, hier botmorfogenetisch proteïne 7 (BMP7), om commissural axonen te heroriënteren. Een explant van embryonale dorsale ruggenmerg is gekweekt grenst aan een totaal van COS-cellen afscheiden van de kandidaat groeifactoren. Geheroriënteerd commissural axonen groeien binnen de explantatie worden gevisualiseerd door immunohistochemie.

Het testen van het vermogen van diffundeerbare signaalmoleculen om Embryonale Spinal Commissural Axonen Heroriënteer

Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor...

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

This video demonstrates the process for isolating spiral ganglion explants from the inner ear and co-culturing them with the organ of Corti on a multielectrode array. Spiral ganglia are carefully extracted and sectioned into smaller tissue sections or explants. These explants are cultured on the multielectrode array's active area to promote neuronal process outgrowth.

Culturing Murine Spiral Ganglion Neuron Explants on Multielectrode Arrays

This video demonstrates constructing a three-compartment cell culture system using collagen and non-reactive grease. This system is used to observe interactions between glioma cells and axons in real-time.

Preparation of Collagen-Coated Compartmented Culture Dishes for Neuronal Cell Culture

This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

We presenteren een protocol om primaire murine spiraalvormige ganglion neuron explantaten te kweken op multi-elektrode arrays om neuronale responsprofielen te bestuderen en stimulatieparameters te optimaliseren. Dergelijke studies zijn gericht op het verbeteren van de neuron-elektrode interface van cochleaire implantaten om het gehoor bij patiënten te verbeteren evenals het energieverbruik van het apparaat.

Spiraal Ganglion Neuron Explantatie Cultuur en elektrofysiologie op Multi Electrode Arrays

Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel. Neuronale culturen van kuiken CG neuronen bleken effectieve celmodellen in de studie van zenuwspier interacties. We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van CG neuronen uit kuikenembryo's.

Isolatie en cultuur van Chick Ciliary Ganglion Neurons

In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

Leer dissectie en cultuur van chick statoacoustic ganglion en spinal cord explantaten in collageen gels voor neurietuitgroei assays. Deze methode onderzoekt groeifactoreffecten op neuronoverleving en axonale geleiding.

Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

Meer video's verkennen