Name: Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Leer lysine demethylase-activiteit kwantificeren met MALDI-massaspectrometrie en isotopische methylatie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van epigenetisch onderzoek door ionisatieverschillen tussen gemethyleerde peptiden te corrigeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de UAMS Proteomics Faciliteit voor massaspectrometrische ondersteuning. De financiering voor dit project werd verzorgd door NIH subsidies P20RR015569, P20RR016460 en R01DA025755.

Dit protocol wordt gewijzigd van Blair et al.. 6. 1. LSD1 demethylatie Assay <ol><li> In een eindvolume van 20 ul, combineren 125 ng recombinant LSD1 met 0,25 pg di-methyl histoon H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine) in demethylase buffer (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol). Bovendien voert een peptide alleen controle zonder enzym. De besturing is voor sectie 3 en hoeft niet reductieve methylatie. </li><li> Incubeer 2 uur bij 37 ° C. </li><li> Om de peptiden verzamelen voeg 8 pi POROS R2 20 micron korrels aan elk monster en roeren gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Bereid POROS kralen door de schorsing van 1 volume van kralen met een volume van methanol, en voeg dan 10 volumes van 5% mierenzuur / 0,2% TFA. </li><li> Voorwaarde twee C 18 ZipTips door opzuigen 20 pl van 0,1% TFA in de tip en duwen weer naar buiten met een pipet. Doe dit twee keer met 0,1% TFA, viermaal met 70% acetonitril / 0,1% TFA en vier keer opnieuw met 0,1% TFA. </li><li> Plaats de twee monsters (controle en de demethylase reactie) op de geconditioneerde C 18 ZipTips door pipetteren de kraal slurry achter de C 18 hars in de ZipTips en duwen het volume door met een pipet. </li><li> Tweemaal wassen ZipTips met 20 pi 0,1% TFA. </li><li> Elueren in 40 ul van 70% acetonitril / 0,1% TFA. </li><li> Volledig Lyophilize elk elutiemiddel met SpeedVac concentrator. </li></ol> 2. Reductieve methylering Dit gedeelte van het protocol wordt gewijzigd van Blair et al.. En Rayment et al.. 6,7. <ol><li> Resuspendeer de demethylase reactie in 100 ul 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,4. </li><li> Om de demethylase reactie voeg 8 pi van 15 mg / ml boraan dimethylamine. Boraan dimethylamine wordt opgelost in 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,4, de 15 mg / ml voorraadoplossing geven.Dit moet worden vers gemaakt. </li><li> Om de demethylase reactie, voeg 16 ul van 250 mM gedeutereerde formaldehyde. De 250 mM gedeutereerde formaldehyde wordt bereid door verdunning van de voorraad in H 2 0. Dit moet worden vers gemaakt. </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Herhaal stap 2.2, 2.3 en 2.4. </li><li> Herhaal stap 2.2. </li><li> Incubeer bij 4 ° C ~ 15 uur. </li><li> Om de demethylase monster, voeg 12,5 ul van 1 M Tris, pH 7,4 op de reductieve methylatie reactie te lessen. </li></ol> 3. MALDI massaspectrometrie <ol><li> Voeg POROS R2 20 micron kralen aan de demethylase reactie, en te verzamelen over ZipTips zoals beschreven in stappen 1.3-1.6. </li></ol> Opmerking: De resuspendeer in 100 pi 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,4 en behandelen het andere monster vanaf stap 3.1. <ol start="2"><li> Elueer de controle en demethylase reactie monsters uit de ZipTips op een MALDI monster plaat met 2 pl van 33% te verzadigend 2,5-dihydroxybenzoëzuur. Om de 33% te bereiden 2,5-dihydroxybenzoëzuur, een verzadigde oplossing van 2,5-dihydroxybenzoëzuur in 70% acetonitril / 0,1% TFA en vervolgens verdunnen tot 33% verzadigd 70% acetonitril / 0,1% TFA. Laat de geëlueerde monsters te drogen en kristalliseren. </li><li> Verzamel massa spectra met een PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF massaspectrometer of beschikbaar hoge resolutie MALDI massaspectrometer 8,9,10. </li><li> Bekijk spectra en pak piek gebieden met behulp van PerkinElmerSciex TOFworks software of software die door de massaspectrometer fabrikant. </li><li> Controleer of de reactie producten door MS 2 met een beschikbare massaspectrometrische systeem dat tandem massaspectrometrische mogelijkheden. </li></ol> 4. Data-analyse <ol><li> Ter compensatie van de isotopen overlapping die met zware formaldehyde (figuur 1B) bepalen oppervlakte (A) verhouding van 13 C 2 en 13 C 4 isotopen relative de mono-isotopische piek voor de controlemonster die geen behandeling heeft ondergaan reductieve methylering (Fig. 2A). Eq 1: Een 13C2 / A 12C = r 1 Eq 2: Een 13C4 / A 12C = r 2 Dit geeft je de verhouding van peptide bestaande in deze isotopische staten (r 1 &amp; r 2) specifiek voor uw experiment en massaspectrometer. </li><li> Gebruik de r 1 en r 2 waarden in de volgende formules voor het kwantificeren van de relatieve hoeveelheid peptide in elke wijziging staat in de demethylase reactie monster (Fig. 2B): Eq 3: H3K4me2 = A 1 Eq 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1) Eq 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))] </li></ol> 5. Representatieve resultaten Met behulp van LSD1, laten we de effectiviteit van MassSQUIRM voor het kwantificeren vanlysine demethylering. Zoals beschreven in het protocol tekstdeel, voerden we een demethylase assay met 125 ng LSD1 en 0,25 ug di-methyl histoon H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine). De controle en demethylase reactie monsters werden onderworpen aan reductieve methylering en MALDI massaspectrometrie. De controle reactie die niet onderworpen reductieve methylering vertoonden de typische isotopische middelen voor het peptide en piekoppervlakken voorzien vergelijkingen 1 en 2 (figuur 2A). De massaspectrum voor demethylase reactie waarin piekoppervlakken voor vergelijkingen 3-5 (figuur 2B). De piekoppervlakken van de controle en demethylase reactie we vastgesteld dat LSD1 het peptide gedemethyleerd de volgende reactie producten geven: 33,7% di-methyl Lys4, 42,3% mono-methyl Lys4 en 24% niet-gemethyleerde Lys 4. Zie Blair et al.. Voor de volledige analyse van LSD1 demethylase activiteit evenals remmer studies 6. Merk op dat veranderende variabelen zoals reactietijd, enzymconcentratie en substraat concentratie zal zorgen voor een diepgaande analyse van de activiteit. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> Figuur 1. MassSQUIRM overzicht. (A) N-terminale peptide van histoon H3 wordt als niet-(groen), mono-(rood), of di-(blauw) gemethyleerd aan lysine 4. Variatie in de chemische samenstelling van elk peptide leidt tot een verschillende ionisatie maken kwantificering complex. (B) reductieve methylering zet alle lysineresten de di-methyl toestand waardoor alle peptiden op soortgelijke ioniseren. Het gebruik van zware formaldehyde in de reductieve methyleringsreactie kan behoud van de identiteit van de oorspronkelijke methylatie. Open cirkels geven licht methylatie, terwijl gesloten cirkels geven aan zware methylatie. Gewijzigd van Blair et al.. 2011 6. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figure 2. MassSQUIRM kan worden differentieel gemethyleerd peptiden kwantificeren. (A) een di-gemethyleerde synthetische histoon H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotine) werd geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie en piek verhoudingen ten opzichte van de mono-isotopische piek werden waargenomen als R1 en R2 in de vergelijkingen 1 en 2. (B) Dezelfde synthetische peptide geïncubeerd met 125 ng LSD1 in demethylase buffer gedurende twee uur bij 37 ° C. Monsters werden vervolgens onderworpen aan analyse MassSQUIRM. Een gemengde populatie van overlappende pieken betekent drie methylering toestanden zoals in figuur 1B. Werkingssfeer van de mono-isotopische pieken werden genoteerd als A 1, A 2 en A 3. Piekoppervlakken werden vergelijkingen 3-5. Open cirkels geven licht methylatie, terwijl gesloten cirkels geven aan zware methylatie. Gewijzigd van Blair et al.. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

MassSQUIRM is een goedkope en kwantitatieve methode voor een uitgebreide analyse van de activiteit van lysine demethylases betrokken bij de mono-en di-methylatie. MassSQUIRM biedt kwantificering niet alleen van het product van de reactie, maar ook voor de tussenproducten. Deze test kan worden gebruikt als een krachtig middel bestuderen het mechanisme van LSD1 en histon demethylases. Het is ook bruikbaar voor de indeling vele nieuw ontdekte lysine demethylase enzymen zoals PHF8 en kunnen worden gebruikt voor bepaalde met...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotine peptide </td><td> bereid in eigen huis </td><td> geen </td></tr><tr><td> POROS R2 20 micron kralen </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifluorazijnzuur (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> acetonitril </td><td> Visser </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihydroxybenzoëzuur </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Boraan dimethylamine </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotopisch Heavy D 2-formaldehyde </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Visser </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Visser </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Visser </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Visser </td><td> G33 </td></tr><tr><td> Mierenzuur </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Visser </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-fosfaat </td><td> Visser </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Concentrator </td><td> Savant </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF massaspectrometer en TOFworks software </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> geen </td></tr></tbody></table>

toepassing van masssquirm voor kwantitatieve metingen van lysine demethylase activiteit

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Onlangs hebben epigenetische regelgevende instanties zijn ontdekt als belangrijke spelers in een groot aantal verschillende ziekten 1-3. Als gevolg hiervan, deze enzymen zijn primaire doelen voor kleine molecule studies en de ontwikkeling van geneesmiddelen 4. Veel epigenetische regelgevende instanties hebben pas sinds kort ontdekt en zijn nog steeds in het proces worden gekwalificeerd. Onder deze enzymen lysine demethylases die methylgroepen uit lysines op histonen en andere eiwitten. Door de nieuwe karakter van deze klasse van enzymen, weinig assays ontwikkeld om de activiteit te bestuderen. Dit is een blokkade om zowel de indeling en hoge doorvoer studie van histon demethylases. Op dit moment zeer weinig demethylase testen bestaan. Degenen die wel bestaan, hebben de neiging om kwalitatief van aard en kan niet tegelijkertijd onderscheid maken tussen de verschillende lysine-methylatie staten (un-, mono-, di-en tri-). Massaspectrometrie wordt vaak gebruikt om demethylase activiteit te bepalen, maar de huidige massaspectrometrische analyses te doenniet in op de vraag of differentieel gemethyleerd peptiden anders ioniseren. Differentiële ionisatie van gemethyleerde peptiden maakt het vergelijken van methylatie staten moeilijk en zeker niet kwantitatief (figuur 1a). Zo beschikbare tests zijn niet geoptimaliseerd voor de uitgebreide analyse van demethylase activiteit. Hier beschrijven een methode MassSQUIRM (massaspectrometrische kwantificering met isotopen reductieve methylering) die is gebaseerd op de reductieve methylering van aminegroepen met gedeutereerde formaldehyde dwingen alle lysines zijn di-gemethyleerde, waardoor zij in wezen dezelfde chemische stof en derhalve de ioniseren zelfde (figuur 1b). Het enige verschil chemische na reductieve methylering waterstof en deuterium, die geen invloed MALDI ionisatie efficiëntie. De MassSQUIRM assay is specifiek voor demethylase reactieprodukten met on-mono-of di-methyl lysines. De test is ook van toepassing op lysine-methyl-geven van de same reactieproducten. Hier wordt een combinatie van reductieve methylering chemie en MALDI massaspectrometrie van de activiteit van LSD1 meten, een lysine demethylase kan verwijderen di-en mono-methyl groepen, een synthetisch peptide substraat 5. Deze test is eenvoudig en lastig om een ​​lab toegang tot een MALDI massaspectrometer lab of via een proteomics faciliteit. De test heeft ~ 8-voudige dynamisch bereik en is gemakkelijk schaalbaar tot plaat-formaat 5.

We presenteren een methode voor het gebruik van MALDI massaspectrometrie en reductieve methylatie chemie op veranderingen in de lysine-methylatie te kwantificeren.

Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit

Recentelijk zijn epigenetische regulatoren ontdekt als sleutelspelers in veel verschillende ziekten 1-3. Bijgevolg zijn deze enzymen belangrijke doelwitten voor kleine ...

Het mass squirm-protocol is bedoeld om de lysine-demethylase-activiteit te kwantificeren met behulp van isotopische methylering en MALDI-massaspectrometrie. Voer eerst enzymgekatalyseerde demethyleringsreacties uit op peptiden die gemethyleerde lysine bevatten. Methylleer vervolgens de peptideproducten van de demethylasereactie chemisch met gedeutereerd formaldehyd om uniform gemethyleerde peptiden te produceren die op dezelfde wijze ioniseren via MALDI. Kwantificeer vervolgens elke peptidesoort met MALDI-massaspectrometrie en houd rekening met isotopische overlap. Om de relatieve hoeveelheden on-, mono-, di- en trimethyl-peptiden te identificeren, bepalen de mass squirm-resultaten de relatieve hoeveelheden van elk demethylasereactieproduct op basis van massaveranderingen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals routinematige massaspectrometrie, is dat de massascore rekening houdt met verschillen in ionisatie tussen verschillend gemethyleerde peptiden. We kregen voor het eerst het idee voor deze aanpak toen we een methode ontwikkelden om histonacetyleringsniveaus te meten met behulp van isotopisch zwaar azijnzuuranhydride. De uitdaging bij deze techniek is het extraheren van gegevens over de piekruimte, wat bemoeilijkt kan worden door overlap van isotopische enveloppen van peptiden.Combineer voor de demethylasereactie 125 nanogram recombinant lysine-specifiek demethylase één-enzym met 0,25 microgram gebiotineerd dimethyl histone H3-peptide in een eindvolume van 20 microliter demethylasebuffer. Bereid daarnaast een controlemonster voor met 0,25 microgram peptide zonder het LSD1-enzym; incubeer de reactie- en controlebuisjes gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Meng voor de bereiding van R2 20 micron poreuze beads gelijke volumes beads en methanol.Voeg vervolgens 10 volumes TFA-mierenzuur toe, voeg acht microliter poreuze beads toe aan elk monster en agiteer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Conditioneer ondertussen twee C 18 zip tips. Pipetteer tweemaal met 20 microliter 0,1% TFA, vier keer met 70% acetonitril 0,1% TFA en nogmaals vier keer met 0,1% TFA.Laad vervolgens de twee monsters op de geconditioneerde zip tips. Duw met een pipetteur het volume door de C 18 hars. Herhaal dit totdat het totale volume van beide monsters door de zip tips is geduwd.Was vervolgens de zip tips tweemaal met 20 µL 0,1% TFA en elueer de monsters in 40 µL elutiebuffer; laat deze vervolgens volledig drogen met een speed vac-concentrator. Resuspendeer het monster eerst in 100 µL 50 mM fosfaatbuffer pH 7,4. Voeg daarna acht µL borat-dimethylamine en 16 µL gedestilleerd formaldehyde toe.Incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Herhaal de reductieve methylering door boring dimethylamine en gedeutereerd formaldehyd toe te voegen en incubeer gedurende twee uur. Voeg de derde keer boring dimethylamine toe en incubeer gedurende 15 uur bij vier graden Celsius.Stop de reactie met 12,5 µL 1 M tris pH 7,4 en droog het mengsel volledig met een speed vac concentrator. Suspendeer vervolgens de controle- en demethylase-reactiemonsters in 100 µL 50 mM fosfaatbuffer pH 7,4.Voeg nu acht µL poreuze kraaltjes toe aan de controle- en demethylase-reactie monsters en verzamel deze op zip tips zoals eerder beschreven. Elueer in volumes van twee µL op een MALDI-monsterplaat en laat dit bij kamertemperatuur drogen tot kristallisatie. Ga verder met het analyseren van de monsters via massaspectrometrie.Open de spectrovbestanden in de bijbehorende software en exporteer deze naar de M over Z-software. Verifieer de reactieproducten vervolgens via tandem-massaspectrometrie. Bepaal eerst de verhouding van het piekoppervlak van de koolstof 13 C twee- en koolstof 13 C vier-isotopen ten opzichte van de mono-isotopische piek voor de controlemonsters.Gebruik deze berekende ratio's om de relatieve hoeveelheid peptide in elke modificatie te kwantificeren. Toestand van het demethylasereactiemonster. Het LSD1-enzym kan effectief worden gebruikt voor massaspectrometrische kwantificering van lysinedemethylering.Aangezien de contralereactie geen reductieve methylering ondergaat, geeft deze de typische isotopische envelop voor dit peptide aan. De resulterende piekoppervlakken bepalen de achtergrondverhoudingen van het peptide dat voorkomt in koolstof 13 C twee en koolstof 13 C vier. Isotopische toestanden en piekoppervlakken uit het massespectrum voor de contralereactie maken kwantificering mogelijk van de relatieve hoeveelheid peptide in elke modificatietoestand. In de demethylasereactie bepalen de piekoppervlakken van deze controle- en demethylasereacties 33,7% dimethyllysine 4, 42,0,3% monomethyllysine vier en 24% ongemethyleerde lysine vier.Deze massasquame-benadering biedt cruciale inzichten in het veld van de histone-epigenetica, zoals de manier waarop demethylering van histonlysineresiduen bijdraagt aan diverse ziekten. Hoewel deze methyleringsanalyse is toegepast om demethylasen te bestuderen, kan deze ook worden gebruikt voor het bestuderen van methyltransferasen.

application-masssquirm-for-quantitative-measurements-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De activiteit van de induceerbare lysine decarboxylase wordt gecontroleerd door de reactie van het substraat L-lysine en het product cadaverine met 2,4,6-trinitrobenzensulfonic zuur te adducten dat differentiële oplosbaarheid hebben in tolueen vorm.

Een test voor het meten van de activiteit van de Escherichia coli Induceerbare Lysine Decarboxyase

Twee methoden voor het toewijzen van de α- en ε-dimethylamine nucleaire magnetische resonantiesignalen van een reductief 13C-gemethyleerd N-terminaal lysine worden beschreven. De ene methode maakt gebruik van de pH-geïnduceerde selectiviteit van de reductieve methyleringsreactie, en de andere maakt gebruik van aminopeptidase om selectief het N-terminale lysine te verwijderen.

Methoden om de NMR-resonanties van de 13C-Dimethyl N-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Peptidarrays gesynthetiseerd door de SPOT-methode kunnen worden gebruikt om de substraatspecificiteit van proteïne lysine methyltransferases (PKMTs) te analyseren en om het substraatspectrum van PKMTs te definiëren om hun biologische rol te begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe peptidearrays te synthetiseren, ze te methyleren met PKMTs en de resultaten te analyseren.

Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Een protocol voor het synthetiseren van peptoïden met gemengde kationische functionaliteit in dezelfde sequentie wordt gepresenteerd (lysine- en arginine-achtige monomeren). Het daaropvolgende testen van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana, de protozoa-parasieten die cutane leishmaniasis veroorzaken, wordt ook beschreven.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Hier presenteren we een protocol voor het meten van KDM1A doel betrokkenheid in een humane of dierlijke cel, weefsel of bloedmonsters behandeld met KDM1A remmers. Het protocol maakt gebruik van chemoprobe-tagging van het vrije KDM1A-enzym en de directe kwantificering van de doel bezetting met behulp van op chemoprobe gebaseerde immunoassays en kan worden gebruikt in preklinisch onderzoek en klinische studies.

Directe meting van KDM1A target engagement met behulp van Chemoprobe-gebaseerde immunoassay

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Deze protocollen bieden de methodologie die wordt gebruikt om de enzymatische activiteit van individuele leden van de eiwit arginine methyltransferase (PRMT) familie in cellen te beoordelen. Gedetailleerde richtlijnen voor het beoordelen van PRMT-activiteit met behulp van endogene en exogene biomarkers, methyl-arginine-herkennende antilichamen en remmertoolverbindingen worden beschreven.

Kwantitatieve methoden voor het bestuderen van eiwit Arginine Methyltransferase 1-9 activiteit in cellen

Deze studie stelde een methode vast die genetische code-uitbreiding gebruikt om lactyllysine (Klac) succesvol te integreren op specifieke locaties van de menselijke enolase-1 (hENO1) en superfolder GFP (sfGFP) in Escherichia coli - en zoogdiercellen.

Site-specifieke lysinelactylering via genetische code-expansie in E. coli - en zoogdiercellen

Leer lysine demethylase-activiteit kwantificeren met MALDI-massaspectrometrie en isotopische methylatie. Deze methode verbetert de nauwkeurigheid van epigenetisch onderzoek door ionisatieverschillen tussen gemethyleerde peptiden te corrigeren.

Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit

Meer video's verkennen