Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit
11 maart 2012
We presenteren een methode voor het gebruik van MALDI massaspectrometrie en reductieve methylatie chemie op veranderingen in de lysine-methylatie te kwantificeren.
Het massa-schuifprotocol is bedoeld om lysine demethylase-activiteit te kwantificeren met behulp van isotope methylering en maldi massaspectrometrie. Eerst worden enzym-gekatalyseerde demethyleringsreacties uitgevoerd op peptiden die gemethyleerd lysine bevatten. De residuen methyleren vervolgens chemisch de peptide producten van de demethylase-reactie met gedeutereerd formaldehyde om uniform gemethyleerde peptiden te produceren die op dezelfde manier ioniseren door maldi. Vervolgens worden elke peptide-soort gekwantificeerd met multi-tot massaspectrometrie en wordt rekening gehouden met isotope overlap. Om de relatieve hoeveelheden ongemethyleerde, mono-gemethyleerde en trim-gemethyleerde peptiden te identificeren, bepalen de massa-schuifresultaten de relatieve hoeveelheden van elk demethylase-reactieproduct op basis van veranderingen in massa.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals routinematige maldi massaspectrometrie is dat massascore rekening houdt met verschillen in ionisatie tussen verschillend gemethyleerde peptiden. We hadden eerst het idee voor deze benadering toen we een methode ontwikkelden om histonacetyleringsniveaus te meten met behulp van isotopisch zware azijnzuuranhydride. De uitdaging voor deze techniek is het extraheren van piekgebiedgegevens, wat kan worden gecompliceerd door overlap van isotope enveloppen van peptiden.
Voor de demethylase-reactie combineerden we 125 nanogram recombinant lysine-specifiek demethylase enzym een met 0,25 microgram biotinyleerd dimethyl histon H drie peptide in een eindvolume van 20 microliters demethylase-buffer. Bereid ook een controlemonster voor dat 0,25 microgram peptide bevat zonder het LSD-enzym een. Incubeer de reactie- en controlebuizen gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Om R twee 20 micron poreuze kralen voor te bereiden, meng gelijke volumes kralen en methanol.
Voeg vervolgens 10 volumes TFA (forminezuur) toe, voeg acht microliters poreuze kralen toe aan elk monster en schud gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen twee C 18 zip tips voor. Pipetteer twee keer met 20 microliters 0,1%TFA, vier keer met 70% aceto nitril 0,1%TFA en nogmaals vier keer met 0,1%TFA.
Laad vervolgens de twee monsters op de geconditioneerde zip tips. Gebruik een pipetteerder om het volume door de C 18-hars te duwen. Herhaal dit tot het totale volume van beide monsters door de zip tips is geduwd.
Was vervolgens de zip tips twee keer met 20 microliters 0,1%TFA, elueer de monsters in 40 microliters illusiebuffer en droog ze volledig met een speed vac concentrator. Resuspendeer het monster eerst in 100 microliters 50 millimolair fosfaatbuffer pH 7,4. Voeg vervolgens acht microliters boor-dimethyl amine en 16 microliters gedeutereerd formaldehyde toe.
Incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Herhaal de reductieve methylering door boor-dimethyl lamine en gedeutereerd formaldehyde toe te voegen en gedurende twee uur te incuberen. Voeg de derde keer boor-dimethyl lamine toe en incubeer gedurende 15 uur bij vier graden Celsius.
Quench de reactie met 12,5 microliters één molair tris. pH 7,4 en droog het volledig met een speed vac concentrator. Resuspendeer vervolgens het controle- en demethylase-reactiemonster in 100 microliters 50 millimolair fosfaatbuffer pH 7,4.
Voeg nu acht microliters poreuze kralen toe aan de controle- en demethylase-reactiemonsters en verzamel ze op zip tips zoals eerder getoond. Eludeer in twee microliter volumes op een MALDI-monsterplaat en laat het bij kamertemperatuur kristalliseren. Ga verder met het analyseren van monsters door middel van massaspectrometrie.
Open de spectrobestanden in de werksoftware en exporteer naar M over Z-software. Verifieer vervolgens de reactieproducten door middel van tandem massaspectrometrie. Bepaal eerst de piekgebiedsverhouding van koolstof 13 C twee en koolstof 13 C vier isotopen ten opzichte van de mono-isotopische piek voor het controlemonster.
Gebruik deze berekende verhoudingen om de relatieve hoeveelheid peptide te kwantificeren die in elke modificatie bestaat. De staat van het demethylase-reactiemonster. Het LSD-enzym kan effectief worden gebruikt bij massa-schuifkwantificering van lysine-demethylering.
Aangezien de controlereactie geen reductieve methylering ondergaat, geeft dit de typische isotope enveloppe voor dit peptide aan. De resulterende piekgebieden bepalen de achtergrondverhoudingen van peptide die in koolstof 13 C twee en koolstof 13 C vier bestaan. Isotopenstaten, piekgebieden uit het massaspectrum voor de controlereactie maken kwantificering mogelijk van de relatieve hoeveelheid peptide die in elke modificatietoestand bestaat. In de demethylase-reactie bepalen de piekgebieden van deze controle- en demethylase-reacties 33,7% dimethyl lysine 4, 42 0,3% monomethyl lysine 4 en 24% ongemethyleerd lysine 4.
Deze massa-schuifbenadering biedt belangrijke inzichten in het gebied van histon-epigenetica, zoals hoe demethylering van histon-lysineresiduen bijdraagt aan verschillende ziekten. Hoewel deze methyleringstest is toegepast om demethylasen te bestuderen, kan deze ook worden gebruikt om methyl transferasen te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het kwantificeren van lysine-demethylase-activiteit met behulp van MALDI-massaspectrometrie en reductieve methyleringschemie. De aanpak maakt het mogelijk om veranderingen in lysine-methyleringsniveaus te meten via isotopische labeling.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Biochemie
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Lysine-methylering is een cruciale posttranslationele modificatie.
- Inzicht in demethylase-activiteit is belangrijk voor epigenetisch onderzoek.
- Bestaande methoden houden mogelijk geen rekening met ionisatieverschillen in gemethyleerde peptiden.
- Deze studie bouwt voort op eerder werk waarbij histonacetylering werd gemeten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van lysinedemethylase-activiteit.
- Om de nauwkeurigheid van massaspectrometrie bij het detecteren van methyleringsveranderingen te verbeteren.
- Om inzicht te verschaffen in de dynamiek van lysinemethylering in biologische systemen.
Gebruikte methoden
- Enzymatisch gekatalyseerde demethyleringsreacties van gemethyleerde lysinepeptiden.
- Chemische methylering van demethylasereactieproducten met gedeutereerd formaldehyde.
- Gebruik van MALDI-massaspectrometrie voor kwantificering.
- Analyse van isotopische overlap om relatieve peptidehoeveelheden te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van ongemodificeerde en gemethyleerde peptide-soorten.
- Demonstratie van de voordelen van de methode ten opzichte van traditionele massaspectrometrie.
- Identificatie van uitdagingen met betrekking tot de extractie van data over het piekoppervlak.
- Validatie van de benadering via comparatieve analyse.
Conclusies
- De methode biedt een nieuwe benadering om de dynamiek van lysine-methylering te bestuderen.
- Het vergroot het begrip van de demethylase-activiteit in biologische contexten.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse vakgebieden binnen de epigenetica en proteomica.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Kwantitatieve meting van de lysine-demethylase-activiteit is essentieel voor de validatie van epigenetische targets en de identificatie van lead-verbindingen bij geneesmiddelenonderzoek. De MassSQUIRM-methode pakt een belangrijke beperking van bestaande assays aan door een directe vergelijking van methyleringsstatussen via isotopische standaardisatie mogelijk te maken, waardoor het voorspellend vertrouwen bij het mechanistisch minimaliseren van risico's van epigenetische targets wordt verbeterd. Dit ondersteunt vroege beslissingen in het ontdekkingsproces door reproduceerbare, kwantitatieve uitslagen te leveren voor target-engagement en padmodulatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de demethylase-activiteit op gedefinieerde peptide-substraten te kwantificeren.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde methode om on-, mono-, di- en tri-gemethyleerde lysinestanden te vergelijken, waardoor mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door kwantitatieve activiteitsgegevens te leveren die correleren met target-engagement en pathway-modulatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert uniform ioniseerbare peptiden via reductieve methylering, wat betrouwbare MALDI-MS-kwantificatie over verschillende methyleringstoestanden mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met aanpassing naar plaatformaat voor screening met mediume doorvoer van verbindingenbibliotheken tegen demethylase-doelwitten.
- Reproduceerbaarheid: Corrigeert voor differentiële ionisatie van gemethyleerde peptiden, waardoor consistente kwantitatieve resultaten over experimenten en laboratoria worden gegarandeerd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de afstemming met ziekterelevante systemen door het kwantificeren van de demethylase-activiteit in contexten van histon- en niet-histonproteïnen.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt longitudinale tracking van targetmodulatie in preklinische modellen mogelijk via kwantitatieve resolutie van de methylatietoestand.
- Afstemming van biomarkers: Faciliteert de evaluatie van methylatiewijzigingen als potentiële farmacodynamische biomarkers in studies naar target-engagement.
Integratie van Pipeline & Workflow
De MassSQUIRM-methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekkingsfase en verbindt targetvalidatie via kwantitatieve biochemische assays met leadidentificatie en preklinische evaluatie door schaalbare, reproduceerbare activiteitsmetingen te leveren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door het kwantificeren van enzymspecifieke demethyleringsactiviteit op synthetische peptide-substraten.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en kwantitatieve read-outs mogelijk voor screeningcampagnes van verbindingen die gericht zijn op lysinedemethylases.
- Analytics: Levert isotopische piekoppervlakte-ratio's die een directe vergelijking van modificatietoestanden mogelijk maken, wat datagestuurde besluitvorming bij de hit-to-lead progressie faciliteert.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinisch werk door meting van demethylase-activiteit in ziekterelevante peptide- en eiwitsubstraten mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor epigenetische targetkarakterisering over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Kwantitatieve beoordeling van demethylase-activiteit, vermindering van ionisatiebias bij vergelijking van de methylatiestatus en verbeterde betrouwbaarheid van het target.
- Operationele waarde: Standaardisatie van peptide-ionisatie, reproduceerbaarheid over verschillende MALDI-MS-platforms en schaalbaarheid naar high-throughput-formaten.
- Strategische waarde: Onderbouwde go/no-go-beslissingen op basis van kwantitatieve gegevens over target-modulatie, waardoor het biologische risico in epigenetische programma's wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van epigenetische targets door middel van betrouwbare activiteitsprofielering en mechanisch inzicht.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in enzymologie, peptidechemie en de interpretatie van MALDI-massaspectrometrie-data.
- Afhankelijkheid van toegang tot MALDI-MS-instrumentatie en reagentia voor isotopische reductieve methylering (gedeutereerd formaldehyde, boraan-dimethylamine).
- Noodzaak van gestandaardiseerde protocollen voor peptidesynthese, de opzet van enzymreacties en de consistentie van isotopische markering tussen teams.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten substraatspecificiteit en compatibiliteit met diverse peptidesequenties buiten histon H3.
- Praktische beperkingen omvatten uitdagingen bij de deconvolutie van piekgebieden vanwege overlap van de isotopische enveloppe, wat zorgvuldige spectrale analyse en softwaretools vereist.
