Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow
14 januari 2012
We tonen de methode voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de milt met behulp van GFP transgene malariaparasieten en de kwantificering van de parasiet de mobiliteit en de bloedstroom binnen dit orgaan.
In deze procedure laten we een kwantitatief intravitale microscopie-aanpak zien om de dynamica van het passeren van parasieten door de milt te beoordelen. In een muismodel voor malaria worden muizen geïnfecteerd met GFP transgene parasieten voorbereid voor intravitale microscopie. Canuleringsveningen van de milt zullen de injectie van intravitale kleurstoffen mogelijk maken. Tijdens het experiment worden fluorescente cellen gezien bewegen in verschillende delen van de milt.
We bieden de mythologie om de mobiliteit van de parasiet in het driedimensionale langzame compartiment van de rode pulp te beschrijven en het bloedvolume in de vaten te berekenen. Deze parameters werden gebruikt om de dynamiek van de milt van twee PULE-stammen te vergelijken. Hallo allemaal.
Mijn naam is Nando El Portillo en een van de belangrijkste onderzoeksvragen in mijn laboratorium is om te proberen de rol van de milt bij malaria te begrijpen. De S-splenomegalie is een van de kenmerken van deze ziekte, maar vanwege technische en ethische problemen is het moeilijk om studies van dit orgaan aan te pakken. Om dit te doen, hebben we technologieën ontwikkeld die ons in staat stellen de dynamische passage van deze parasiet te zien en dit fenomeen te kwantificeren.
Dit is wat Lorena en MI in deze protocollen zullen uitleggen. Dit onderzoek wordt gedeeltelijk uitgevoerd in samenwerking met de groepen van Dr.Ler van de Universiteit van Hamburg in Duitsland en Dr.Maria Kbo hier in het ziekenhuis. Clinic en heeft de algemene financiering ontvangen van de stichting Cellex en ministerieel CIA. In Espanol infectie wordt geïnitieerd door donor M geïnfecteerd met ofwel dodelijke of niet-dodelijke GFP-parasieten bij 10%parasiet. Om de parasiet te controleren, neem een kleine druppel bloed uit de staartvene van de muis en breid deze uit op een microscoop.
Een chole metrische kleuring met GIMs. Een oplossing zal de visualisatie van geïnfecteerde rode bloedcellen mogelijk maken, eenmaal gedroogd, fixeer de bloeduitstrijk met Methanol gedurende twee minuten, breng GIMs een oplossing aan en incubeer gedurende 20 minuten. Was de glijbaan met lopend kraanwater en droog. Tel het percentage pbc's ten opzichte van het totale aantal RBC's met behulp van een lichtmicroscoop met een honderd x olie. Doel.
Muizen infecteren met dodelijke of niet-dodelijke parasieten verkregen uit het staartbloed van donormuizen, verdund in PBS. Pas de dosis aan om een half miljoen parasieten per muis te injecteren om een perifeer parasiet van 1%te bereiken op dag drie na infectie en injecteer intraperitoneaal. Alternatief kunnen FITC-gelabelde RBC's worden gebruikt in controle.
Verzamel bij dieren een milliliter arterieel bloed van een muis en was het pellet door centrifugatie in PBS met EDTA, spreid het opnieuw in FITC-oplossing en incubeer gedurende twee uur in het donker met zachte agitatie. Verwijder na deze tijd het supernatant door centrifugatie en was uitgebreid. Injecteer in een controlemuis gemiddeld 1%in de perifere circulatie en ga door met in vivo-experimenten.
Hallo, ik ben mija. Om de milt in vivo af te beelden, moeten we een kleine synergie van het dier uitvoeren om de milt bloot te leggen, duidelijk is deze techniek. Ik leerde het van Stephanie GR in het laboratorium van werknemer Heisler, aan wie ik wil bedanken en nu zal ik je laten zien hoe te procederen.
Beeldvorming van geïnfecteerde myosis werd uitgevoerd op dag drie na infectie wanneer parat 1%is in beide stammen. Houd de muis gedurende het hele proces onder narcose en in gereguleerde temperatuur. Bescherm de ogen tegen de hydratatie en controleer of de muis volledig verdoofd is door de voetkussen te pingen voordat u verder gaat om intraveneuze toediening van stoffen te vergemakkelijken.
Tijdens het verloop van het experiment canuleer de staartvene van de muis om de canule te construeren. Plaats een kleine naald in het ene uiteinde van een buis en het applicator in het andere. Laad de canule met fysiologische zoutoplossing door luchtbellen te verwijderen en controleer of de oplossing correct door de canule stroomt.
De laterale vene van de staart zal schoon canuleren. Verbeter de zichtbaarheid door een zachte vernauwing aan de basis van de staart te maken. Breng de punt van de canule in de ader.
Het verschijnen van bloed zal aangeven dat de naald goed is gepositioneerd. Als dat niet het geval is, herhaal de canuleringsstroomopwaarts de ader, bevestig vervolgens de canule aan de staart met lijm en tape. Breng het onderste deel van de milt bloot door een kleine incisie in de huid en musculatuur aan de linker dorsale zijde van het dier.
Plaats een milt waar minder ademhalingsbeweging wordt waargenomen en breng PBS aan op het oppervlak dat blootgesteld is om het schoon te houden van het muishaar en gehydrateerd. Sluit de milt af met een deksel om visualisatie mogelijk te maken. Hallo, mijn naam is Lorena.
Het getoonde protocol laat ons toe om de beweging van PULI-parasieten door de milt te visualiseren. Dit is mogelijk gemaakt dankzij GFP transgene parasieten. Vriendelijk gedoneerd door James Burnes van Drexel University.
Beeldvorming van de beweging van fluorescente parasieten laat ons weten of er verschillen zijn in het gedrag tussen dodelijke en niet-dodelijke stammen. Vidal microscopie experimenten werden uitgevoerd in een Leica multifoton-microscoop, uitgerust met een incubatiesysteem met temperatuurregeling en een 63 x glycerolobjectief. Plaats het dier op het microscoopplatform met een deksel om de milt naar beneden te laten zien richting objectief. Aanvankelijk.
Visualisatie van de milt bij lagere vergroting biedt een algemeen beeld van de microcirculatoire structuur van het orgaan. Focus de milt met behulp van autofluorescent weefsel waarbij GFP-parasieten worden waargenomen die door de verschillende delen van de milt passeren. Hallo, mijn naam is Maria Albo van Wetenschappelijke en Technologische Centra van de Universiteit van Barcelona, en we zullen intravitale beeldvorming van de milt uitvoeren.
Om de bloedstroom en mobiliteit van geïnfecteerde rode bloedcellen te bestuderen, zullen we een confocale microscoop gebruiken die is uitgerust met een resonante scan die hogesnelheidsbeeldvorming mogelijk maakt, wat erg handig is om de beweging van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een kwantitatieve intravitale microscopieaanpak om de dynamiek van malariaparasieten in de milt te beoordelen. Met behulp van GFP-transgene malariaparasieten worden de mobiliteit van de parasieten en de bloedstroom binnen de milt gekwantificeerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Microscopie
Achtergrond
- Intravitale microscopie maakt real-time beeldvorming van biologische processen mogelijk.
- Het begrijpen van de dynamiek van parasieten in de milt is cruciaal voor malariaonderzoek.
- GFP-transgene parasieten dienen als visuele marker om bewegingen te volgen.
- Bloedstroomdynamiek kan het gedrag van parasieten en de immuunrespons beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om de mobiliteit van malariaparasieten in de milt te kwantificeren.
- Om de bloedstroomdynamiek in relatie tot de beweging van parasieten te beoordelen.
- Om de miltmechanismen van verschillende malariastammen te vergelijken.
Gebruikte methoden
- Knaagdier-malariamodel met gebruik van muizen geïnfecteerd met GFP-transgene parasieten.
- Intravitale microscopie van de milt met veneuze canulatie voor injectie van kleurstof.
- Beeldvorming van fluorescente cellen die zich door verschillende miltgebieden bewegen.
- Kwantificering van de mobiliteit van parasieten en parameters van de bloedstroom.
Belangrijkste Resultaten
- Gedetailleerde methodologie voor het beoordelen van de mobiliteit van parasieten in de milt.
- Vergelijking van de milt-dynamiek tussen twee PULE-stammen.
- Visualisatie van fluorescerende cellen biedt inzicht in het gedrag van de parasiet.
- Kwantitatieve gegevens over de bloedstroomdynamiek in de milt.
Conclusies
- De studie biedt een kader voor het begrijpen van de dynamiek van malariaparasieten.
- Intravitale microscopie is een krachtig instrument voor real-time analyse.
- De bevindingen kunnen toekomstig malariaonderzoek en behandelstrategieën informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Kwantitatieve intravitale microscopie van de milt maakt directe meting mogelijk van de mobiliteit van malariaparasieten en de bloedstroom in vivo, waardoor een kritisch hiaat wordt opgevuld in het begrijpen van gastheer-pathogeeninteracties op organniveau. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanistische risicoreductie en voorspellende betrouwbaarheid in de vroege ontdekkingsfase, in het bijzonder voor de validatie van targets bij infectieziekten en functionele beoordelingen. De aanpak levert bruikbare gegevens voor portfoliage triage en prioritering van ziekterelevante modellen in translationeel onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van parasiet-gastheerinteracties mogelijk binnen een fysiologisch relevante context van een orgaan.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door de adhesie en mobiliteit van parasieten in vivo te kwantificeren.
- Biedt mechanistische inzichten die bijdragen aan de voorspellende betrouwbaarheid en biologische risicoreductie.
- Faciliteert vergelijkende analyse van verschillende parasietstammen voor de prioritering van targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt gevalideerde imaging- en kwantificatieworkflows vast voor downstream screening van antiparasitaire interventies.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten zoals snelheid, directionaliteit en verblijftijd van parasieten.
- Maakt standaardisatie van assaycondities mogelijk met behulp van open-source analyse-instrumenten zoals ImageJ.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op betrouwbare evaluatie van verbindingen in live-diermodellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt ziekterelevante in vivo-modellen uit met de ontwikkeling van translationele biomarkers voor malariaonderzoek.
- Waarborgt continuïteit van mechanistische studies in de ontdekkingsfase tot de preklinische validatie van therapeutische hypothesen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door kwantitatieve read-outs op organniveau te leveren.
- Verbetert de voorspellende risicoreductie voor portfolio's van infectieziekten.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Dit protocol voor intravitale microscopie is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor vroege mechanistische studies worden verbonden met de validatie van translationele modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert de mobiliteit en adhesie van parasieten, waardoor gastheer-pathogeenroutes in de milt worden verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve imaging-resultaten voor assayontwikkeling en het testen van verbindingen.
- Analytica: Biedt metrieken voor snelheid, directionaliteit en verblijftijd voor een robuuste vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vivo imaging-gegevens met ziekterelevante biomarkerstrategieën bij malaria.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Biedt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform voor diverse modellen van infectieziekten.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging- en kwantificeringsworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door risico's in vroege fasen van programma's te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van ziekterelevante modellen.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in intravitale microscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist toegang tot geavanceerde imagingplatformen en opensource analytische software.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare datageneratie en -interpretatie.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende diermodellen of infectieuze agentia.
- Technische complexiteit en dierbehandeling moeten in overeenstemming zijn met ethische en institutionele richtlijnen.
