Name: De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer een in vitro strategie voor stamcellevering via chitosan-microsferen in een collageenhydrogel. Deze methode behoudt multipotentie van adipose-derived stem cells voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DOZ wordt ondersteund door een subsidie ​​van The Genève Foundation. SN werd ondersteund door een Postdoctoraal Fellowship Grant van de Pittsburgh Tissue Engineering Initiative.

1. Isoleren Adipose-stamcellen (ASC) Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. <ol><li> Isoleer rat perirenal en epididymis vet en wassen met een gebufferde zoutoplossing steriele Hank&#39;s (HBSS) met 1% foetaal bovine serum (FBS) zoals eerder beschreven 6. </li><li> Gehakt het weefsel en breng 1-2 g in 25 ml HBSS met 1% FBS in een 50 ml buis en centrifugeer bij 500 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verzamelen de vrij zwevende vetweefsel laag overdracht 125 ml erlenmeyer en 25 ml collagenase type II (200 U / ml) in HBSS gedurende 45 min bij 37 ° C te behandelen op een schudapparaat (125 rpm). </li><li> Verwijder de vloeibare fractie (onder olie en vetlaag) en zuig achtereenvolgens 100-um en 70-um nylon zeef. Centrifugeer het filtraat bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zuig de supernatant en tweemaal wassen met 25 ml pellet HBSS. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 50 ml kweekmedium (MesenPRO RS basismedium) aangevuld met MesenPRO RS groeisupplement, antibiotica antimycotische (100 U / ml penicilline G 100 ug / mL streptomycine sulfaat en 0,25 ug / ml amfotericine B) en 2 mM L-glutamine en pipet cellen in 2 T75 kolf (25 ml / kolf). </li><li> Cultuur de ASC in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C (passage 2-4 ASC worden gebruikt voor alle experimenten). </li></ol> 2. Voorbereiden Chitosan microsferen (CSM) Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. <ol><li> CSM worden bereid door een water-in-olie emulsies proces met een ionisch gelering waarbij gebruik onze eerdere protocol 6. Emulgeren van een waterige oplossing van chitosan (6 ml van 3% w / v chitosan in 0,5 M azijnzuur) in een 100 ml van een oliefase mengsel van sojaolie, n-octanol (1:2 v / v) en 5% sorbitan-mono-oleaat (span 80) emulgator met overhead (1700 rpm) en magnetische roerstaaf (1000 rpm) tegelijkertijd in tegengestelde richting. Deze dubbele mengmethode zorgt ervoor dat micellen vroeg voor verknoping optreedt gevormd kunnen in oplossing blijven en niet naar de bodem. Bovendien is de magnetische roerstaaf helpt bij het de-aggregatie van chitosan tijdens micel vorming en rigidization. </li><li> Het mengsel wordt constant geroerd gedurende ongeveer 1 uur tot een stabiele water-in-olie emulsie wordt verkregen. Ionische verknoping wordt gestart door de toevoeging van 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroxide in n-octanol elke 15 min wordt 4 h (24 ml totaal). </li><li> Na voltooiing van de verknopingsreactie langzaam bezinken de oliefase van het mengsel dat CSM onmiddellijk de bollen op 100 ml aceton. Was de bollen met aceton tot aan de olie-fase wordt volledig verwijderd. </li><li> Droog de herstelde bollen in een vacuüm exsiccator en analeyze zonder verdere verwerking. De gemiddelde deeltjesgrootte CSM, oppervlakte milligram en de toestel kubieke volume werd bepaald met deeltjesgrootte-analysator. </li><li> Voor verdere experimenten was CSM driemaal met steriel water om residueel zouten te verwijderen en absolute alcohol steriliseren. </li></ol> 3. Bepalen van het aantal vrije aminogroepen in CSM Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. <ol><li> Bepaal het aantal vrije aminogroepen in CSM na ionische verknoping met de trinitro benzeensulfonzuur (TNBS) zuur assay van Bubins en Ofner 7. Incubeer 5 mg microsferen met 1 ml 0,5% TNBS oplossing in een 50 ml glazen buis gedurende 4 uur bij 40 ° C en hydrolyseren met de toevoeging van 3 ml 6N HCl bij 60 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Koel de monsters tot kamertemperatuur en extraheren van de vrije TNBS door toevoeging van 5 ml gedeioniseerd water en 10 ml ethylether. </li><li> Verwarm een ​​5 ml aliquot van de waterfase tot 40 ° C in een waterbad gedurende 15 minuten om eventuele ether, afkoelen tot kamertemperatuur, verdampen en verdund met 15 ml water. </li><li> Meet de absorptie bij 345 nm met een spectrofotometer TNBS oplossing zonder chitosan als blanco en chitosan voor CSM preparaat in de totale aantal aminogroepen bepalen. Schatting van het aantal vrije aminogroepen van de CSM ten opzichte van chitosan. </li></ol> 4. Laden ASC in CSM Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. <ol><li> Equilibreer 5 mg gesteriliseerd CSM uit paragraaf 2.5 in steriele HBSS &#39;s nachts en toe te voegen aan een 8-um poriegrootte membraan cultuur plaat insert (24-wells plaat). </li><li> Nadat de CSM hebben zich op het membraan voorzichtig zuig de HBSS en voeg 300 ul groeimedium aan de binnenzijde van het inzetstuk en 700 ul van groeimedia met the buitenkant van de insert. </li><li> Hersuspenderen ASC de juiste concentratie (1 x 10 4 4 x 10 4) in 200 pi groeimedium en zaad via CSM in de petrischaal inzetstuk. Het eindvolume van medium in de cultuur inzetstuk, na het zaaien, 500 ul. </li><li> Incubeer de ASC geplaatste CSM gedurende 24 uur in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li></ol> 5. Bepalen van het percentage van de ASC laden en levensvatbaarheid van de cellen in CSM Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. <ol><li> Na de incubatie, het verzamelen van de ASC-loaded CSM in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis zonder verstoring van de cellen die zijn gemigreerd naar de insert membraan. </li><li> Verwijder het resterende medium en voeg 250 ul vers groeimedium de buis. </li><li> Om elke buis voeg 25 ul MTT (3 - [4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide]oplossing (5 mg / ml) en incubeer 4 h in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li><li> Na incubatie verwijderen medium, voeg 250 ul dimethyl sulfoxide en vortex het mengsel gedurende 2-5 minuten de formazan complex oplosbaar. </li><li> Centrifugeer de CSM bij 2700 x g gedurende 5 minuten, en bepaal de supernatant absorptie gemeten bij 570 nm met behulp van 630 nm als referentie. </li><li> Bepaal het aantal cellen in verband met de CSM ten opzichte van de extinctie van bekende nummers van levensvatbare ASC. </li></ol> 6. Kenmerkend ASC-CSM-Embedded Collageen Gel Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. <ol><li> Mix ASC geladen CSM (5 mg met ≈ 2 x 10 4 cellen) met type 1 collageen (7,5 mg / ml) uit rattenstaart pees volgens de werkwijze van Bornstein 8 en fibrilleren nadat de pH op 6,8 met 2 N NaOH. </li&gt; <li> Voeg de gefibrilleerde collageen ASC-CSM mengsel tot een 12-well plaat en gedurende 30 minuten bij een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li><li> Na volledige fibrillatie incuberen de collageen ASC-CSM gels tot 14 dagen in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li><li> Afgifte en migratie van cellen uit CSM in de gel waargenomen met behulp van standaard microscopische technieken. </li></ol> 7. Representatieve resultaten In de huidige studie hebben we een in vitro strategie om stamcellen van chitosan microsferen (CSM) te leveren in een collageen gel schavot. Poreuze CSM van uniforme grootte (175-225 micrometer in diameter) en samenstelling werden bereid en gebruikt als cel dragers (figuur 2). Bij incuberen ASC de CSM de cellen gevoegd in een concentratie van 2 x 10 4 cells/5mg van CSM. De cellen waren in staat om zich over de microsfeer, terwijl de uitbreiding van filopodiain het poreuze spleten van de microsfeer (figuur 3). Wanneer de cel geladen CSM werden gemengd met het collageen gel, de cellen onmiddellijk begonnen migreren naar de gels (figuur 4). <img alt="Tabel 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" /> Tabel 1. Biologische voordelen voor het gebruik van chitosan en collageen in een stamcel leveringssysteem. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische afbeelding van de algemene strategie voor de dubbel gebruik van de ASC-CSM geladen collageen steigers. Figuren 2, 3 en 4 zijn geannoteerd in het schema om te helpen met de interpretatie van de beelden. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische weergave afgebeeld het proces zaaien stamcellen op chitosan microsferen. De process gaat co-kweken van ASC met CSM in een 8 - um poriegrootte membraan cultuur plaat insert. Na 24 uur worden de microsferen uit de insert en klaar voor het inbedden in een matrix biomateriaal. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" /> Figuur 3. Morfologische karakterisatie van CSM-geladen met ASC. Paneel A toont een licht microfoto van ASC-loaded CSM, terwijl paneel B toont hetzelfde beeldveld bovenop met een beeld verkregen door confocale fluorescentie microscopie. ASC werden geleverd met calceïne AM (groen). Paneel C toont een beeld van een SEM-opname van een onbelaste microsfeer, terwijl het paneel D toont cellen geladen op de microsfeer (sterretjes). De TEM beeld paneel E toont een dwarsdoorsnede van een onbelaste microsfeer. Een veelheid van poriën en spleten liggen verspreid over het microsfeer. Paneel F toont een doorsnede-doorsnede microsfeer met cellen (pijlen) verbonden en verlenging filopodia de creondeugden. Originele vergrotingen: A &amp; B = 70X, C = 500x, D = 2.000 x, E &amp; F = 2.500 x. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" /> Figuur 4. Migratie van ASC de CSM de driedimensionale collageen scaffold. Panelen A en B tonen de CSM met cellen migreren uit de buurt van microsfeer en in de collageen matrix op dag 3 (A, pijlen). Paneel B toont een soortgelijk cultuur na 12 dagen. Transmissie electronenmicroscopie (TEM) beelden worden weergegeven in C, D en E. Asterisks in C en D tonen een microsfeer die cross-doorsnede is met cellen migreren afstand van de microsfeer (pijlen). Hogere vergroting van het paneel D is afgebeeld in panel E, en toont cel filopodia aan de collageen fibrillen (inzet). Originele vergroting: A &amp; B = 100x, C &amp; D = 6.000 x, E = 20.000 x, inzet = 150.000 x. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" /> Figuur 5.Schematische afbeelding van de enorme gebruik van CSM in de regeneratieve geneeskunde en drug delivery.

<ol><li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+bone%2C+cartilage%2C+tendon+and+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.</a> Bone. 39, 678-683 (2006).</li>
<li>Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+strategies+for+adipose+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering strategies for adipose tissue repair.</a> Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).</li>
<li>Pountos, I., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Biology of mesenchymal stem cells.</a> Injury. 36, Suppl 3. S8-S12 (2005).</li>
<li>Kim, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+and+its+derivatives+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications.</a> Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).</li>
<li>Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+chitosan+and+its+derivatives+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine.</a> J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).</li>
<li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell+delivery+into+collagen+gels+using+chitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres.</a> Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).</li>
<li>Bubnis, W. A., Ofner, C. M. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+epsilon-amino+groups+in+soluble+and+poorly+soluble+proteinaceous+materials+by+a+spectrophotometric+method+using+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Lab Invest. 7, 134-137 (1958).</li>
<li>Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+production+prevents+anoikis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).</li>
<li>Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+niches+that+promote+hMSC+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability.</a> Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).</li>
<li>Shanmuganathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+chitosan+microspheres+for+doxycycline+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Polym%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery.</a> Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).</li>
<li>Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+a+new+microcapsule+membrane+combining+alginate%2C+chitosan%2C+polyethylene+glycol+and+poly-L-lysine+for+cell+transplantation+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications.</a> Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).</li>
<li>Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%3A+a+unique+hypoimmunogenic+platform+for+long-term+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy.</a> FASEB J. 24, 22-31 (2010).</li>
<li>Zielinski, B. A., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+a+matrix+for+mammalian+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation.</a> Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).</li>
<li>Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Božikov, K., Barliç, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+for+Adipose+Tissue+Engineering+with+Adipose-Derived+Stem+Cells+Using+Different+Scaffolds+of+Natural+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Biol.+%28Praha%29%22%5BJournal%5D)">In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin.</a> Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).</li>
<li>Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-chitosan+complex+coacervation+for+cell+encapsulation%3A+effect+on+mechanical+properties+and+on+long-term+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability.</a> Biopolymers. 82, 570-579 (2006).</li>
<li>Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fsilk+fibroin-based+tissue-engineered+graft+seeded+with+adipose-derived+stem+cells+enhances+nerve+regeneration+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).</li>
<li>Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-chitosan%2FPLGA-alginate+nanoparticle+blends+as+biodegradable+colloidal+gels+for+seeding+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).</li>
<li>Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlves+da+Silva%2C+ML+%22+J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22"> J. Tissue Eng. Regen. Med</a>. , (2010).</li>
<li>Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biocompatibility+study+of+electrospun+chitosan+microfiber+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).</li>
<li>Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+channels+containing+spinal+cord-derived+stem%2Fprogenitor+cells+for+repair+of+subacute+spinal+cord+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat.</a> Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32, 57-64 (2011).</li>
<li>Altman, A. M., Gupta, V., RÃ­os, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion%2C+migration+and+mechanics+of+human+adipose-tissue-derived+stem+cells+on+silk+fibroin-chitosan+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix.</a> Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).</li>
<li>Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Human+adipose-derived+stem+cells+seeded+on+a+silk+fibroin-chitosan+scaffold+enhance+wound+repair+in+a+murine+soft+tissue+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model.</a> Stem Cells. 27, 250-258 (2009).</li>
<li>Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+chitosan-gelatin-chondroitin+porous+scaffold+improves+osteogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).</li>
</ol>

Geen concurrerende financiële belangen bestaan. Disclaimers De meningen of beweringen in dit document zijn de prive-opvattingen van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als officiële of die de opvattingen van het ministerie van Defensie of de Amerikaanse overheid. De auteurs zijn medewerkers van de Amerikaanse overheid, en dit werk werd opgesteld in het kader van hun officiële taken. Al het werk werd ondersteund door het Amerikaanse leger Medical Research en Materieel Command. Deze studie werd uitgevoerd onder een protocol beoordeeld en goedgekeurd door de US Army Medical Research en Materieel Command Institutional Review Board, en in overeenstemming met het goedgekeurde protocol.

Een belangrijke hindernis in stamcel-gebaseerde therapie is het ontwikkelen van efficiënte methoden voor de levering van cellen aan de bepaalde gebieden voor reparatie. Als gevolg van patiënt tot patiënt variabiliteit, het weefseltype, letsel grootte en diepte; moet de methodiek van het leveren van stamcellen worden bepaald op een case-by-case basis. Hoewel het inbedden van stamcellen binnen een matrix en leveren ze aan de wond lijkt een volgende logische aanpak voor tissue engineering, enkele technische hindernissen bl...

<table border="1" ><tbody><tr><td> Naam van het reagens / apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14175 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Collagenase type II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6685 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> 70-um nylon mesh filter </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> 100-um nylon mesh filter </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> MesenPRO groeimedium System </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> T75 Tissue Culture Flask </td><td> BD Biosciences </td><td> 137787 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Chitosan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448869 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320099 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> N-Octanol </td><td> Acros Organics </td><td> 150630025 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Sorbitaan-mono-oleaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6760 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Kalium Hydroxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1767 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Fisher Scientific </td><td> L-4859 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270741 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Trinitro benzeensulfonzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2297 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Zoutzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320331 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Ethyl Ether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472-484 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> 8-um Tissue Culture Plate Inserts </td><td> BD Biosciences </td><td> 353097 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> 1,5-ml Reactievaatjes </td><td> Visser </td><td> 05-408-129 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> MTT Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8779 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) </td><td> Molecular Probes </td><td> Q2502PMP </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Type 1 collageen </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Natriumhydroxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8045 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> 12-well kultuurplaten </td><td> BD Biosciences </td><td> 353043 </td><td> Verbruiksartikelen </td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> New Brunswick Scienctific </td><td> C24 </td><td> Uitrusting </td&gt; </tr><tr><td> Bevochtigde incubator met Air-5% CO2 </td><td> Thermo Scientific </td><td> Model 370 </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Overhead Roerder </td><td> IKA </td><td> Visc6000 </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Magneetroerder </td><td> Corning </td><td> PC-210 </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Vacuümexsiccator </td><td> - </td><td> - </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Particle Size Analyzer </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Water Bath </td><td> Fisher Scientific </td><td> Isotemp210 </td><td> Uitrusting </td&gt; </tr><tr><td> Spectrofotometer </td><td> Beckman </td><td> Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrofotometer </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Draaikolk </td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Microplate Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M2 </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Licht / fluorescentiemicroscoop </td><td> Olympus </td><td> IX71 </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Olympus </td><td> FV-500 laser scanning confocale microscoop </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Scanning Electron Microscope </td><td> Carl Zeiss MicroImaging </td><td> Leo 435 VP </td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Transmission Electron Microscope </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> Uitrusting </td></tr></tbody></table>

de bouw van een collageen hydrogel voor de levering van stem cell-loaded chitosan microspheres

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotente stamcellen is gebleken zeer nuttig in het gebied van regeneratieve geneeskunde 1-3. Om echter doeltreffend te gebruiken deze cellen voor weefselregeneratie, moet een aantal variabelen wordt gehouden. Deze variabelen omvatten: het totale volume en de oppervlakte van de implantatie, de mechanische eigenschappen van het weefsel en het weefsel micro, waardoor de hoeveelheid van vascularisatie en de componenten van de extracellulaire matrix omvat. Daarom moeten de materialen gebruikt om deze cellen te leveren biocompatibel met een gedefinieerde chemische samenstelling terwijl een mechanische sterkte dat het gastheerweefsel nabootst. Deze materialen moet zijn doorlaatbaar voor zuurstof en voedingsstoffen een gunstige micro voor cellen te hechten en vermenigvuldigen voorzien. Chitosan is een kationische polysaccharide met uitstekende biocompatibiliteit, gemakkelijk chemisch worden gemodificeerd en een hoge affiniteit voor de te binden in vivo macromolecules 4-5. Chitosan bootst de glycosaminoglycaan gedeelte van de extracellulaire matrix, waardoor het functioneren als een substraat voor celadhesie, en proliferatie. In deze studie gebruik chitosan in de vorm van microsferen vet-stamcellen (ASC) leveren aan een collageen gebaseerd driedimensionale scaffold 6. Een ideale cel-microsfeer verhouding werd bepaald ten opzichte van incubatietijd en celdichtheid maximum aantal cellen die kunnen worden geladen bereiken. Als ASC worden gezaaid op de chitosan microsferen (CSM), worden ze ingebed in een collageen steiger en kan worden gehandhaafd in cultuur voor langere perioden. Samenvattend deze studie een werkwijze precies stamcellen binnen een driedimensionale biomateriaal scaffold.

Een belangrijke hindernis in de huidige stamceltherapie is het bepalen van de meest effectieve methode om deze cellen te leveren aan gastheer weefsels. Hier beschrijven we een chitosan-gebaseerde levering methode die is efficiënt en eenvoudig in aanpak, terwijl vet-afgeleide stamcellen om hun multipotent te behouden.

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotente stamcellen zijn uiterst nuttig gebleken op het gebied van regeneratieve geneeskunde1-3. Om deze cellen echter effectief te kunnen gebruiken ...

Dit protocol biedt een in vitro strategie voor het afleveren van stamcellen vanuit chitosan-microsferen in een collageengel-steiger, inclusief oogsten en cultiveren. De primaire adipocytenstamcellen worden vervolgens geëmulgeerd en hersteld in een preparaat van chitosan-microsferen. Zaai daarna de stamcellen op de chitosan-microsferen en cultiveer deze in een membraancultuurplaat-insert met een poriegrootte van acht micron om een CS-geladen CSM te produceren; meng tot slot het microsfeer-afleversysteem met een driedimensionale collageengel-steiger.Uiteindelijk biedt dit CSM-systeem potentieel voor gebruik in de regeneratieve geneeskunde en bij geneesmiddelentoediening. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals celinjectie of micro-encapsulatie is het vermogen van cellen om zich aan een dragermateriaal te hechten en te overleven na de initiële toepassing. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat esan-microsferen een inherente statische lading hebben.Het laden van cellen over een bed van microsferen zal uitdagend zijn zonder ze te verstoren. Snijd perineaal en epideraal vetweefsel uit en was di

constructing-collagen-hydrogel-for-delivery-stem-cell-loaded-chitosan

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Oprichting van micro-weefsels met behulp van cilindrische collageen gels, genaamd modules, die ingesloten cellen en dat het oppervlak bevatten, is bekleed met endotheelcellen.

Fabricatie van Micro-weefsels met behulp van modules van Collageen gel met cellen

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid...

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Kraakbeenherstel vormt een onopgeloste medische uitdaging en cel-gebaseerde benaderingen om menselijk articulair kraakbeen te ontwikkelen zijn een veelbelovende oplossing. Hier beschrijven we driedimensionale (3D) biomimetische hydrogels als een ideaal hulpmiddel voor de uitbreiding en rijping van menselijke articulaire kraakbeencellen.

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.

Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

Dit artikel beschrijft de inkapseling van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) met behulp van een co-axiale stroomfocusapparaat. We tonen aan dat deze microfluïdische inkapselingstechnologie een efficiënte vorming van hPSC-sferoïden mogelijk maakt.

Microfluïdische fabricage van core-shell microcapsules met menselijke pluripotente stamcelsferoïden

Het huidige protocol beschrijft een niet-emulsie-gebaseerde methode voor de fabricage van chitosan-genipin microgels. De grootte van deze microgels kan nauwkeurig worden gecontroleerd en ze kunnen pH-afhankelijke zwelling vertonen, in vivo afbreken en worden geladen met therapeutische moleculen die in de loop van de tijd op een duurzame manier vrijkomen, waardoor ze zeer relevant zijn voor tissue engineering-toepassingen.

Fabricage van maatgecontroleerde en emulsievrije Chitosan-Genipin-microgels voor tissue engineering-toepassingen

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Leer een in vitro strategie voor stamcellevering via chitosan-microsferen in een collageenhydrogel. Deze methode behoudt multipotentie van adipose-derived stem cells voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Meer video's verkennen