De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Dit protocol biedt een in vitro strategie om stamcellen uit chitosanmicrosferen in een collageengelmatrix te brengen, te oogsten en te kweken. De primaire adipocyte-stamcellen emulgeren vervolgens en herstellen een preparaat van chitosanmicrosferen. Zaai vervolgens de stamcellen op de chitosanmicrosferen en kweek ze in een membraancultuurplaatinzet met een poriegrootte van acht micron om een CS-geladen CSM te produceren. Meng ten slotte het microsfeerafleversysteem met een driedimensionale collageengelmatrix.

Uiteindelijk biedt dit CSM-systeem potentieel voor gebruik in regeneratieve geneeskunde en medicijnafgifte. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals celinjectie of micro-inkapseling, is het vermogen van cellen om zich te hechten aan een dragermateriaal en te blijven bestaan na de eerste toepassing. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat esan-microsferen een inherente statische lading heeft.

En het laden van cellen over een microsphere-bed zal een uitdaging zijn zonder ze te verstoren. Verwijder en was, perineaal en epidermaal vetweefsel van een wrap, hakt het weefsel fijn en breng een tot twee gram over in 25 milliliter HBSS met 1%FBS. Na centrifugatie verzamel de vrij zwevende vetweefsellaag in een 125 milliliter erlenmeyerkolf.

Voeg 25 milliliter collageenase type twee toe en incubeer de reactie op een orbitale shaker. Verwijder nu voorzichtig de vloeistoffractie onder de olie en vetlaag en filter sequentieel door nylon gaasfilters van 170 micron. Oogst de cellen door centrifugatie na twee wasbeurten met 25 milliliter.

HBSS Resus, suspendeer de pellet in 30 milliliter gesupplementeerd mesen pro-groeimedium. Verdeel de gezuiverde, aan vet afgeleide stamcellen in twee T 75 kweekkolven en versterk de A SC-preparatie in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Dit CSM-protocol is een water-in-olie-emulgeringsproces dat een ionische coer-techniek gebruikt.

Emulgeer zes milliliter van een waterige oplossing van chitosan in 100 milliliter van een oliefasemengsel met overhead en magnetisch roeren tegelijkertijd in tegengestelde richtingen gedurende één uur tot de stabiele water- en olie-emulsie, voeg elke 15 minuten gedurende vier uur 1,5 milliliter 1% kaliumhydroxide in n octal toe. Na voltooiing van de ionische cross-linking-reactie, decant langzaam de oliefase en voeg de bollen onmiddellijk toe aan 100 milliliter aceton. Was de bollen met aceton totdat de oliefase volledig is verwijderd.

Droog vervolgens de herwonnen bollen in een vacuüm. Bepaal de gemiddelde CSM-deeltjegrootte, oppervlakte per milligram en de eenheid kubieke volume met behulp van een deeltjesgrootte-analyzer. Ga verder met het wassen van CSM drie keer met steriel water om resterende zouten te verwijderen.

Steriliseer nu de CSM-preparatie met absoluut alcohol voor gebruik in celexperimenten in een 50 milliliter glazen buis, meng vijf milligram microspheres met één milliliter 0,5% TNBS-oplossing en incubeer gedurende vier uur bij 40 graden Celsius. Voeg vervolgens drie milliliter zes normale zoutzuur toe en incubeer gedurende twee uur bij 60 graden Celsius. Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, voeg je vijf milliliter gedeïoniseerd water en 10 milliliter Ethel Ether toe.

Om de vrije TNBS te extraheren, verwijder je een vijf milliliter aliquot van de waterige fase en warm je het op tot 40 graden Celsius in een waterbad gedurende 15 minuten om eventueel resterend ether te laten verdampen na afkoeling tot kamertemperatuur. Verdun met 15 milliliter water met een spectrofotometer. Meet de absorptie van de bereide chitosanmicrosferen op 345 nanometer met behulp van TNBS als blanco.

Meet ook het chitosan dat voor de CSM-preparatie wordt gebruikt. Bereken nu het aantal vrije aminogroepen van de CSM ten opzichte van het totale aantal aminogroepen in chitosan. Equilibreer vijf milligram van de gesteriliseerde CSM in steriel HBSS overnacht.

Breng de CSM over naar een acht micron membraaninzet voor 24-welplaten. Nadat de CSM zich heeft gesetteld, zuig voorzichtig de HBSS af. Voeg nu 300 microliter groeimedium toe aan de binnenkant van de inzet en 700 microliter groeimedium aan de buitenkant van de inzet.Resus.

Suspendeer de aan vet afgeleide stamcellen in 200 microliter groeimedium en zaai ze over de CSM in de kweekplaat. Incubeer gedurende 24 uur in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Breng de A SC-geladen CSM over in een steriele microcentrifugebuis zonder de cellen te verstoren die in de inzetmembraan zijn gemigreerd.

Verwijder nu het restmedium en voeg 250 microliter vers groeimedium toe aan elke buis. Voeg 25 microliter vijf milligram per milliliter MTT-oplossing toe en incubeer gedurende vier uur. Verwijder het medium en voeg 250 microliter dimethyl sulfaat voorwerp toe om de forman complex te solubiliseren centrifugeer de CSM bij 2.700 G gedurende vijf minuten.

Meet de supernatantabsorptie bij 570 nanometer met behulp van 630 nanometer als referentie. Ga verder met het bepalen van het celaantal geassocieerd met de CSM ten opzichte van de absorptiewaarde verkregen van bekende aantallen van levensvatbare A SC.Meng vijf milligram A SC-geladen CSM met 7,5 milligram per milliliter. Type één collageen geëxtraheerd uit rat.

Staartpees, pas de pH aan op 6,8 met behulp van twee normale natriumhydroxide en giet in een kweekplaat. Voer nu in om te fibrilleren en breng over naar een 12-welplaat en incubeer gedurende 30 minuten. Blijf het medium verversen voor de collageen A-S-C-C-S-M-gels om de andere dag van de incubatieperiode.

Bewaak, los en migratie van cellen uit CSM in de gel met behulp van standaard microscopietechnieken. Dit volgende voorbeeld beschrijft de in vitro strategie om aan vet afgeleide stamcellen van chitosanmicrosferen in een collageengelmatrix te brengen. SEM- en TEM-beelden geven een voorbereiding van poreuze CSM van uniforme grootte aan.

Incubatie van de microsferen met primaire aan vet afgeleide stamcellen geeft